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Accurate predictions of binding free energies from computer simulations are an invaluable resource for understanding biochemical processes and drug action. The primary aim of the work described in the thesis was to predict and understand ligand binding to several proteins of major pharmaceutical importance using computational methods. We report a computational strategy to quantitatively predict the effects of alanine scanning and ligand modifications based on molecular dynamics free energy simulations. A smooth stepwise scheme for free energy perturbation calculations is derived and applied to a series of thirteen alanine mutations of the human neuropeptide Y1 G-protein coupled receptor and a series of eight analogous antagonists. The robustness and accuracy of the method enables univocal interpretation of existing mutagenesis and binding data. We show how these calculations can be used to validate structural models and demonstrate their ability to discriminate against suboptimal ones. Site-directed mutagenesis, homology modelling and docking were further used to characterize agonist binding to the human neuropeptide Y2 receptor, which is important in feeding behavior and an obesity drug target.  In a separate project, homology modelling was also used for rationalization of mutagenesis data for an integron integrase involved in antibiotic resistance. Blockade of the hERG potassium channel by various drug-like compounds, potentially causing serious cardiac side effects, is a major problem in drug development. We have used a homology model of hERG to conduct molecular docking experiments with a series of channel blockers, followed by molecular dynamics simulations of the complexes and evaluation of binding free energies with the linear interaction energy method. The calculations are in good agreement with experimental binding affinities and allow for a rationalization of three-dimensional structure-activity relationships with implications for design of new compounds. Docking, scoring, molecular dynamics, and the linear interaction energy method were also used to predict binding modes and affinities for a large set of inhibitors to HIV-1 reverse transcriptase. Good agreement with experiment was found and the work provides a validation of the methodology as a powerful tool in structure-based drug design. It is also easily scalable for higher throughput of compounds.

Pacientes com câncer de mama apresentam menores níveis de 1,25(OH)2D3 ou 25(OH)D3 em relação às mulheres sem a doença. Embora linhagens de câncer de mama apresentem inibição do crescimento em concentrações supra-fisiológicas de 1,25(OH)2D3, forma ativa da vitamina D, ainda não se demonstrou se o hormônio exerce efeito antiproliferativo, em concentrações fisiológicas, em tumores de seres humanos. A suplementação de calcitriol pode ser indica a mulheres pós-menopausadas para prevenir a perda óssea. Nosso objetivo foi avaliar em pacientes com câncer de mama, pós menopausadas, a dimensão do tumor, taxa de proliferação (expressão de Ki67), concentração sérica de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3, expressão gênica tumoral do receptor de vitamina D (VDR) e alguns genes alvos como, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, antes a após um mês de suplementação oral de calcitriol. Foram estudadas 24 pacientes com doença operável, idade mediana de 57 anos. As primeiras 10 pacientes e as 14 seguintes receberam 0,25 e 0,50g/dia de calcitriol, respectivamente, por um período mediano de 31 dias. Três quartos das pacientes apresentavam nível sérico de insuficiência de 25(OH)D3 ou insuficiência relativa (<30ng/ml) e após a suplementação, nenhuma paciente apresentou elevação dos níveis séricos de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3. Embora a dimensão tumoral, mensurada por ultrasonografia, não apresentasse variação, a imuno-expressão de Ki67 sofreu um redução relativa mediana de 40%. A expressão relativa de VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 não se alterou com a suplementação. Nossos dados indicam que tumores de mama expressam VDR, e que após suplementação oral de calcitriol, ocorre uma redução da proliferação. Este efeito merece ser elucidado, desde que genes alvo clássicos da 1,25(OH)2D3 não parecem ser mediadores do efeito anti-proliferativo, em amostras de câncer de mama de pacientes pós menopausadas. / Breast cancer patients present lower 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum levels than unaffected women. Although breast cancer cell lines are growth inhibited by vitamin D supra-physiological concentrations, there is much uncertainty about the anti-proliferative effect of physiological concentrations of 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, in breast cancer specimens in vivo. Vitamin D supplementation to post-menopausal women may be indicated to reduce bone loss. Our aim was to evaluate tumor dimension, proliferation rate (Ki67 expression), 25(OH)D3 and 1,25(OH)2D3 serum concentration, and tumor expression of vitamin D receptor (VDR), and of some target genes as CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, before and after a one month calcitriol supplementation to post-menopausal breast cancer patients. Twenty four patients with operable disease, median age 57 years, were enrolled. The first tem patients were supplemented with calcitriol 0.25g/d and the next 14 patients, with 0.50g/d, for a median period of 31 days. Three fourths of the patients presented 25(OH)D3 insufficiency or relative insufficiency (<30 ng/mL) and after calcitriol supplementation, none of them presented an elevation of 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum concentration. Although tumor dimension, evaluated by ultrasonography, did not vary, a median relative reduction of 40% in Ki67 immuno-expression, was observed. No differences in VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 mRNA relative expression were detected between pre and post-supplementation samples. No differences in VDR, CYP27B1 and CYP24A1 tumor relative expression were detected following supplementation. Our data indicate that VDR expression is detected in breast cancer samples and that growth inhibition takes place after calcitriol oral supplementation. This anti-proliferative effect deserves further investigation, as classical target genes do not seem to be involved.

A epilepsia é um transtorno do funcionamento cerebral caracterizado por crises epilépticas recorrentes que acomete cerca de 1 a 2% da população mundial. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o subtipo mais prevalente. A refratariedade aos medicamentos é comum e cerca de 40 % destes pacientes apresentam transtornos psiquiátricos. Neste trabalho utilizamos o método de TacMan real time PCR para quantificar o mRNA de subtipos dos receptores de noradrenalina, dopamina, serotonina e substância P em hipocampos cirurgicamente removidos de pacientes com ELT para conhecer o papel destes na ELT com ou sem comorbidade psiquiátrica (depressão ou psicose). Nossa amostra foi de 48 pacientes com ELT sem (Epilepsia - 24) ou com comorbidade psicótica (Psicose - 10) ou depressiva (Depressão - 14) e 8 Controles (necrópsias). O receptor adrenérgico-&#945;2A (AD2A) apresentou diferença entre os grupos (p = 0,0059) com significância para a variável Antiepiléptico (p = 0,0374) e pós-teste significante de maior expressão do mRNA de AD2A no grupo Epilepsia comparado com Controle e com Psicose. A ativação dos receptores &#945;2A no hipocampo pelos antiepilépticos pode explicar nossos achados do grupo Epilepsia comparado ao Controle, corroborando a literatura acerca do AD2A na epilepsia e em relação aos antiepilépticos. O AD2C mostrou diferença entre os grupos (p = 0,0016), sem significância nas variáveis de controle e significante maior expressão do mRNA de AD2C no grupo Epilepsia comparado ao Controle e Psicose. O AD2C é encontrado em áreas que processam informações sensoriais e controlam atividades motoras e emocionais relacionadas, o que pode explicar nossos resultados. Parece ser importante na patologia relacionada à ELT e merece ser estudado. A não diferença entre Epilepsia e Depressão para AD2A e AD2C, parecem confirmar uma relação bi-direcional ou um mecanismo patogênico comum entre epilepsia e depressão, enquanto a menor expressão de AD2A e AD2C nos psicóticos parece indicar diferenças nos mecanismos adrenérgicos ligados a psicose e epilepsia. D2 mostrou diferença entre os grupos (p = 0,0125) com resultado significativo para a variável Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (p = 0,0239), provavelmente devido a cronicidade da doença e a quantidade de episódios depressivos apresentados pelos sujeitos. Quanto maior a freqüência das crises (p = 0,0381) maior a expressão do D2 no grupo Epilepsia e no Depressão comparados ao Controle. Estes achados sugerem a participação deste receptor na depressão comórbida na ELT; corroboram que o monitoramento dopaminérgico límbico pode ser útil para desenvolver novos antidepressivos e propõem pesquisas futuras sobre D2 em epilépticos. A participação de 5-HT2A na ELT é indicada, pois, sua maior expressão no grupo Epilepsia em relação ao Controle foi significativa (p = 0,0273). Quanto maior a freqüência das crises epilépticas maior a expressão do 5-HT2A (p = 0, 0433). Não encontramos resultados significativos referentes aos receptores D4, 5-HT1A, 5-HT2C e NK1. Nossos resultados mostraram a possibilidade da aplicação do TacMan real time PCR no estudo de receptores de neurotransmissores, sugeriu a importância dos receptores estudados na ELT e comorbidades psiquiátricas, e que outras estruturas límbicas, como a amígdala, sejam focos de investigação. / Epilepsy is a mental functional disorder characterized by recurrent seizures that affect about 1 to 2% of world population. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype. The refractory to medication is common and about 40% of these patients have psychiatric disorders. This study used the TacMan real time PCR method to quantify noradrenergic, dopaminergic, serotoninergic and substance P receptors subtypes mRNA expression in hippocampus surgically removed from patients with TLE to know their role in TLE with or without psychiatric commorbity (depression or psychosis). Our sample consisted of 48 TLE patients without (Epilepsy - 24) or with psychotic (Psychosis - 10) or depressive (Depression - 14) commorbity and 8 Controls (necropsies). The &#945;2A adrenergic receptor (AD2A) showed difference between groups (p = 0.0059) with significance for Antiepileptic Medication variable (p = 0.0374) and post-hoc test significantly greater AD2A mRNA expression of Epilepsy group compared with Control and Psychosis. The activation of hippocampus &#945;2A receptors by antiepileptic drugs can explain our findings of the Epilepsy group compared with Control, corroborating the literature about the AD2A in epilepsy and for antiepileptic drugs. The AD2C showed differences between groups (p = 0.0016) without significance in the variables of control and significantly greater AD2C mRNA expression of the Epilepsy group compared to Control and Psychosis. The AD2C is found in areas that process sensory information and control motor and emotional related activities, which may explain our results. It seems to be important in the pathology related to TLE and deserves to be studied. No differences between Epilepsy and Depression to AD2A and AD2C seem to confirm a bi-directional relation or a common pathogenic mechanism between epilepsy and depression, while the lowest AD2A and AD2C expression within psychotics seem suggests differences in adrenergic mechanisms linked to psychosis and epilepsy. D2 showed differences between groups (p = 0.0125) with significant results for the variable Subtype of Psychiatric Diagnosis (p = 0.0239), probably due to chronic disease and the number of depressive episodes presented by subjects. The higher the frequency of seizures (p = 0.0381) the higher was the D2 expression within Epilepsy group compared with Control and Depression compared to Control. These findings suggest the involvement of this receptor in TLE commorbid depression; corroborate that limbic dopaminergic monitoring may be useful in developing new antidepressants and propose future research on D2 in epileptics. The participation of 5-HT2A in TLE is indicated, therefore its significant higher expression in the Epilepsy group in relation to Control (p = 0.0273). The higher the frequency of seizures the higher was the 5-HT2A expression (p = 0.0433). We found no significant results for the D4, 5-HT1A, 5-HT2C and NK1 receptors. Our results showed the possibility of TacMan real time PCR method application in TLE neurotransmission receptors study, suggested the importance of the studied receptors in TLE and psychiatric commorbities and that other limbic structures, as the amygdala, should be investigation targets.

O carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) abrange 95% de todas as doenças malignas da tireóide. Nos EUA, aumentou em 2,4 vezes nos últimos anos (1973-2002). O seu tratamento inclui tireoidectomia total, seguido por terapia com radioiodo e supressão do TSH com L-tiroxina. A doença pode recidivar em ~20% dos casos, sendo necessária avaliação periódica através de exames de imagens e dosagem de tireoglobulina sérica (TGs). Os Anticorpos (Acs) anti-TG podem ser detectados em 15 a 25% dos pacientes, comprometendo, parcialmente, o uso da TGs como marcador de recidiva do câncer. Um método alternativo proposto para monitorar os pacientes é a detecção de células tireoidianas em sangue periférico, através da mensuração do RNA mensageiro de TG (RNAm-TG) pela técnica de RTPCR em tempo real. Esta nova metodologia aumenta a sensibilidade da detecção desta molécula. O objetivo deste estudo é verificar a significância da quantificação do RNAm-TG, como método diagnóstico complementar no acompanhamento a longo prazo de pacientes com CDT. Amostras de sangue de 45 pacientes (25 sem metástase, 14 com metástase ganglionar e 6 com metástase à distância) foram coletadas nos tempos: antes e 24, 48, 72 horas, 7 dias, 1, 3, 6, 9 meses, 1, 2, 4, 5, 6 e 7 anos após a dose ablativa de radioiodo. Foi realizada extensiva padronização da técnica com a finalidade de excluir interferências metodológicas, empregando dois genes controles interno (GAPDH e HPRT1) para o cálculo da concentração do RNAm-TG. Concomitantemente foi realizada a mensuração de TGs, perfil hormonal e de anticorpos anti-TG. A pesquisa de corpo inteiro, realizada 7 dias após a dose terapêutica, estabeleceu o estadio clínico inicial dos pacientes. Não foi possível estabelecer um valor de corte para o RNAm-TG. O RNAm-TG não diferenciou os estadios clínicos da doença ao longo do tempo, independente do gene controle interno utilizado, e tampouco quando analisaram-se os dados na presença de Acs anti-TG e TSH30ng/mL. A TGs diferenciou os estadios clínicos ao longo do tempo. Concluiu-se que, o RNAm-TG não é um bom marcador de recidiva do CDT, mesmo quando considerou-se critérios de padronização da técnica, avaliação em longo prazo e presença de Acs anti-TG, sendo assim não poderia ser utilizado como método diagnóstico complementar no acompanhamento de pacientes com CDT. Este estudo demonstra que a técnica de RT-PCR em tempo real é muito sensível perdendo especificidade, inviabilizando sua utilização no acompanhamento dos pacientes com CDT / The differentiated thyroid carcinoma (DTC) encloses 95% of all thyroid malignant disease. In USA, it increased 2,4 times in recent years (1973- 2002). The treatment includes total thyroidectomy, ablation with radioiodine (RAI) followed by TSH suppression with L-Thyroxine. The cancer recurrence occurs in 20% of the cases. Periodic evaluation through imaging examinations and serum thyroglobulin (TG) measurements by imunoassays method is recommended for careful follow-up of these patients. The anti-TG antibodies prevalence is 15-25% and would impair, partially, the serum TG use as a tumor marker. An alternative method to identify the recurrence of the tumor is the thyroid cells detection in peripheral blood, through the TG messenger RNA quantification (mRNA-TG) by real time RT-PCR. This new methodology increases the sensitivity detection for this molecule. The objective of this study was to verify the mRNA-TG peripheral blood quantification significance, as a complementary diagnostic method in the long term follow up of patients with DTC. Fourty five blood samples from patients with DTC have been collected before and 24, 48, 72 hours, 7 days, 1, 3, 6, 9 months, 1, 2, 4, 5, 6 and 7 years after the ablation therapy. Extensive technique standardization for mRNA-TG measurements was carried out to exclude methodological interventions and two housekeeping genes (GAPDH and HPRT1) were used to calculate the mRNA-TG concentrations. Concomitantly, serum TG measurements, hormonal profile and antibodies anti-TG assays were performed. The whole body scan was performed 7 days after RAI ablation to determine the stage of the disease. It was not possible to establish a cut-point value for mRNA-TG. The mRNA-TG did not differentiated the clinical stage of the disease in the long term follow-up and neither in the presence of anti-TG antibodies and TSH30ng/mL. Serum TG was able to differentiate the clinical stage of the patients during the follow-up. In conclusion mRNA-TG is not a good marker for the DCT recurrence, even when technical standardization, long term evaluation and the presence of antibodies anti-TG were considered. Thus it could not be used as a complementary diagnostic method in the DTC patients follow-up. This study confirmed the high sensivity of the real time RT-PCR whereas with very low specificity, consequently is unviable to be used in the DTC patients follow-up

Estudos sugerem que a presença de células metastáticas ocultas em medula óssea pode ser fator prognóstico em câncer de mama. Além disso, é possível que um perfil gênico tumoral específico, caracterizado por repressão da expressão gênica, esteja associado à detecção de células tumorais na medula óssea. O silenciamento de genes é controlado pela desacetilação de histonas e metilação de DNA, esta última catalisada por enzimas DNA metil transferases. Outro alvo de metil-transferases são as histonas, e histona H3 quando sofre metilação em lisina 9, gera sítio de ligação a proteínas HP1 (Heterocromatin protein-1 ou cromobox). Membros da família HP1 (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1HsY) participam da formação da heterocromatina e da regulação da expressão de genes. Logo, nosso objetivo foi determinar no tumor primário de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy , que participam da repressão gênica, em relação à presença ou ausência de células metastáticas ocultas na medula óssea. Neste estudo foram incluídas 37 pacientes de forma prospectiva, atendidas no Instituto Brasileiro de Controle do Câncer (IBCC) no período de junho de 2004 a julho de 2005, com diagnóstico histopatológico de carcinoma invasivo de mama, estádio clínico (EC) I (16,2%), II (51,4%) ou III (32,4%), segundo a classificação patológica. A idade mediana das pacientes foi 63 anos (41 a 90) e 62.2% delas encontravam-se na pós-menopausa, sendo que 24.3% relatava história familiar para câncer de mama. O tipo histológico predominante foi carcinoma ductal invasivo (89.2% dos casos), sendo, o restante, representado por carcinoma lobular invasivo (10.8%). Foram coletadas amostras de tumor primário de mama e de aspirado de medula óssea de cada paciente. A presença de células metastáticas ocultas (CMO) na medula óssea (MO) foi detectada através da expressão de citoqueratina 19 (CK19) pelo método de nested RT-PCR. A expressão relativa dos genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy foi determinada no tumor primário, usando-se a técnica de RT-PCR em tempo real. Presença de CMO foi detectada na MO de 20 pacientes (54.1%). Não observamos diferença na expressão de HP1Hs? (1,93 ± 2,25 MO- vs 3,84 ± 5,53 MO+), HP1Hs? (6,74 ± 6,31 MO- vs 6,49 ± 5,86 MO+) e HP1Hs? (24,58 ± 11,14 MO- vs 24,91 ± 15,88 MO+) entre as amostras tumorais de pacientes com presença (MO+) ou ausência (MO-) de micrometástase medular. Também não observamos variação da expressão de genes HP1 em relação ao comprometimento linfonodal, dimensão e grau histológico do tumor, expressão tumoral de receptores de estrógeno e estado menopausal da paciente. A expressão de HP1Hsalfa em tumores de pacientes com câncer de mama ERBB2 negativos, entretanto, foi maior do que em tumores ERBB2 positivos. Nossos dados indicam que em tumores de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy não parece se associar à presença de células ocultas em medula óssea / Studies suggest that the presence of occult metastatic cells (OMC) in the bone marrow (BM) may be a prognostic factor in breast cancer. Besides, it is possible that a specific tumor gene profile, characterized by repression of gene expression, may be associated to the presence of tumoral cells in the bone marrow. Gene silencing is controlled by histone deacetylation and DNA methylation, the last one catalized by enzymes DNA methyltransferases (DNMTs). Histones are another target of methyltransferases, and methylation of histone H3 on lysine-9 generate a binding site for HP1 proteins (Heterocromatin protein-1 or chromobox). Members of the HP1 family (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy) take part in heterochromatin formation and gene expression regulation. Hence, our aim was to determine in the primary tumor of the breast, the expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy, which participate in gene repression, in the presence or absence of occult metastatic cells in the bone marrow. In this study, 37 patients treated at Instituto Brasileiro de Controle do Câncer, from June 2004 to July 2005, with invasive breast cancer histopathologically confirmed, pathological clinical stages I (16,2%), II (51,4%) or III (32,4), were included. The median age of the patients was 63 years (41 to 90), 62.2% were post-menopausal and 24.3% reported family history of breast cancer. Invasive ductal carcinoma was diagnosed in most patients (89.2%), and invasive lobular carcinoma was detected in the other patients (10.8%). Tumor samples and bone marrow aspirates were obtained from each patient. The presence of CMO in BM was detected by keratin-19 (CK19) expression by nested RT-PCR. The relative expression of the genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy was determined by real-time RT-PCR. Occult metastatic cells (OMC) in BM were detected in 20 patients (54.1%). No differences were observed in the expression of HP1Hs? (1,93 ± 2,25 BM- vs 3,84 ± 5,53 BM+), HP1Hsalfa (6,74 ± 6,31 BM- vs 6,49 ± 5,86 BM+) and HP1Hsbeta (24,58 ± 11,14 BM- vs 24,91 ± 15,88 BM+) between tumor samples of BM+ patients and BM- patients. Variations of HP1 gene expression were neither observed according to lymph node involvement, tumor size, histological grade, estrogen receptor status and menopausal status. However, HP1Hsbeta expression in ERBB2-negative tumors was higher than in ERBB2-positive tumors. Our data indicate that in breast cancer tumors, expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy does not seem to be associated with the presence of occult metastatic cells in the bone marrow

Die Telomere sind spezialisierte DNA-Protein-Komplexe, die sich an den Enden der Chromosomen der eukaryotischen Zellen befinden. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, welches für die vollständige Replikation der Telomere bei den meisten Eukaryoten verantwortlich ist. Die katalytische Untereinheit des Enzyms (hTERT beim Menschen) besitzt Reverse-Transkriptase-Aktivität, und nutzt eine integrierte RNA (hTR beim Menschen) als Template, um Telomer-Wiederholungssequenzen an den Enden der Chromosomen zu synthetisieren. Die Telomerase ist in den meisten normalen humanen somatischen Zellen unterdrückt. In den meisten Krebszellen jedoch, stellt die Reaktivierung der Telomerase zur Beibehaltung der Telomerlänge eine Voraussetzung für deren unbegrenztes Wachstumspotential dar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein neuer, einfacher und selektiver Assay für den Nachweis der humanen Telomerase entwickelt werden. In dem neuen Assay sollten die beiden Kernkomponenten des Enzyms, die Protein-Untereinheit und die RNA, die Targets sein. Der Test ist in seiner Grundstruktur wie folgt aufgebaut : 1. Immobilisierung der Telomerase über die hTERT an eine Festphase, beschichtet mit Phosphorothioat-modifizierten (PS) Oligonukleotiden oder Heparin. Zusammen mit der Telomerase werden bei diesem Schritt die Heparin-bindenden Proteine, die in der Probe enthalten sind, an die Festphase gebunden. 2. Spezifischer Nachweis der hTR. Zur Detektion der hTR wird ein Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) oder eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) eingesetzt. In der optimierten Endversion wurde zur Immobilisierung des Enzyms eine Festphase, beschichtet mit PS-Oligonukleotiden, verwendet. Die hTR wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Mit dem neuen Assay wurden erfolgreich 75 Tumorzellen detektiert. / Telomeres are specialized DNA-Protein structures located at the ends of linear eukaryotic chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which is responsible for the complete replication of the telomeres in most eukaryotes. The catalytic reverse transcriptase protein subunit (hTERT in humans) of the nucleoprotein uses an integral RNA (hTR in humans) as a template for the addition of telomeric repeat sequences to the ends of chromosomes. Telomerase is repressed in most normal human somatic cells, while the reactivation of telomerase to maintain telomere length is necessary for the unlimited growth potential of most human cancer cells. The aim of this work was the development of a new, simple and selective assay for the detection of human telomerase. The targets of the new assay were the two core subunits of the enzyme : hTERT and hTR. The test comprises two principal steps : 1. Immobilization of the telomerase via the hTERT subunit on a solid phase, coated with heparin or phosphorothioate-modified (PS) oligonucleotides. In this step telomerase is bound together with the heparin-binding proteins of the analysed sample to the surface. 2. Specific detection of the hTR. For the detection of the hTR an oligonucleotide ligation assay (OLA) or a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used. In the optimized final version of the assay a PS-coated solid phase was used for the immobilization of the enzyme. Reverse transcriptase PCR was applied for detection of the hTR. 75 tumor cells were successfully detected with the new assay.

Pacientes com câncer de mama localmente avançado são submetidas à quimioterapia neoadjuvante na tentativa de reduzir a dimensão do tumor e aumentar a possibilidade da realização de uma cirurgia conservadora. Nosso grupo identificou previamente através da tecnologia de cDNA microarray, trios de genes, incluindo BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 e XLHSRF-1, cuja expressão era capaz de predizer a resposta à quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ciclofosfamida em pacientes com câncer de mama. No presente estudo, avaliamos se a expressão destes genes é reprodutível na identificação de pacientes responsivas e não-responsivas através de RT-PCR em tempo real, que representa uma técnica mais acessível. Avaliamos inicialmente amostras de 28 pacientes anteriormente estudadas (grupo de validação técnica = 23 responsivas e cinco não-responsivas) e a seguir um grupo de 14 novas pacientes (grupo de validação biológica = 11 responsivas e três não-responsivas). Dentre os trios de genes inicialmente identificados, a expressão de RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 e RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 classificou corretamente 86% (24/28) das amostras do grupo de validação técnica e 71% (10/14) das amostras do grupo de validação biológica, através de análise de classificação discriminante. Desse modo, esses trios não demonstraram a mesma precisão em comparação com resultados de cDNA microarray. Uma nova análise combinatória foi realizada na procura do melhor modelo preditivo utilizando valores de expressão obtidos por RT-PCR em tempo real. Identificamos então um novo trio, composto pelos genes RPL37A, SMYD2 e MTSS1, cuja expressão classificou corretamente 93% das amostras do grupo de validação técnica (22/23 responsivas e 4/5 não-responsivas) e 79% do grupo de validação biológica (8/11 responsivas e 3/3 não-responsivas). Portanto, o teste apresentou 88% de sensibilidade e especificidade em detectar pacientes responsivas para o total de amostras analisadas. Ao verificarmos o poder de classificação do mesmo grupo de genes, utilizando os valores de expressão pela análise de cDNA microarray, observamos um resultado semelhante (91% de sensibilidade e especificidade em reconhecer as amostras responsivas). Dessa forma, demonstramos que o perfil de expressão gênica obtido com cDNA microarray é reprodutível através do uso de RT-PCR em tempo real. Um estudo integrando um maior número de pacientes e uma plataforma de cDNA microarray mais abrangente pode auxiliar na identificação de um modelo preditivo baseado em grupos de genes mais acurado para antever a resposta ao tratamento com quimioterapia baseada em doxorrubicina. / Patients with locally advanced breast cancer are submitted to primary chemotherapy as an attempt to reduce tumor dimension and increase breast conserving surgery rates. Our group has previously identified through cDNA microarray technology gene trios, including BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 and XLHSRF-1, whose expression was capable of predicting response to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin and cyclophosphamide in breast cancer patients. In the current study, it was evaluated whether expression of these genes is reproducible in the identification of responsive and non-responsive patients by real time RT-PCR, which represents a more accessible technique. We initially evaluated samples from 28 patients earlier studied (technical validation group = 23 responsive and 5 non-responsive) and subsequent to a new 14 patients set (biological validation group = 11 responsive and three non-responsive). Among the initially identified gene trios, RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 and RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 expression correctly classify 86% (24/28) samples from the technical validation group and 71% (10/14) samples from the biological validation group, through discriminant classification analysis. Therefore, these trios didnt demonstrate the same precision as compared with cDNA microarray results. A new combinatorial analysis was also performed in search of the best predictive model using real time RT-PCR expression values. A new trio was identified, represented by RPL37A, SMYD2 and MTSS1 genes, whose expression correctly classified 93% samples from technical validation group (22/23 responsive and 4/5 non-responsive) and 79% samples from biological validation group (8/11 responsive samples and 3/3 non-responsive samples). Therefore, the test presented 88% sensibility and specificity in identifying responsive patients for all samples analyzed. By means of verifying the classification strength of the same gene group, using cDNA microarray expression values, we observed a similar result (91% sensibility and specificity in recognizing responsive samples). Thus, we demonstrated that gene expression profile obtained by cDNA microarray is reproducible through real time RT-PCR. A study integrating a larger number of patients and a more comprehensive cDNA microarray platform may help the identification of a more accurate predictive model based on gene groups to foresee response to doxorubicin-based chemotherapy treatment.

Os genes homeobox são uma família de genes reguladores que são vitais para vários aspectos do crescimento e diferenciação celular. Recentemente, implicações dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF na gênese e progressão tumoral vêm sendo verificadas. Entretanto, o envolvimento desses genes em carcinomas epidermóides (CE) de boca ainda não foi demonstrado. A possível presença de transcritos dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF em carcinomas epidermóides de boca e em tecidos não tumorais adjacentes (TN) foi analisada. Os transcritos dos genes foram amplificados por RT-PCR e sua localização celular determinada por hibridização in situ (ISH) com sondas de mRNA específicas. A amplificação do HOXA7 foi observada em 70% dos casos sendo 15% apenas nas amostras TN, 45% somente nos CEs e 10% em ambos tecidos. Nenhuma amplificação do HOXC6 foi observada. O TGIF foi amplificado em 80% dos casos, sendo 5% somente nas amostras TN, 20% nos CEs e 55% em ambos tecidos. Análises estatísticas mostraram que não havia diferença significante entre a amplificação do transcrito HOXA7 ou TGIF e o tipo de tecido analisado. Além disso, nenhuma associação entre a amplificação dos transcritos nas amostras CE e os aspectos clínicos foi observada. O sinal de hibridização in situ foi similar para os transcritos HOXA7 e TGIF. Nas amostras TN o sinal da ISH foi intenso no epitélio, ora disperso sendo mais proeminente na camada espinhosa ora mais proeminente nas camadas basais e suprabasais. Nos CEs os transcritos foram localizados por toda neoplasia sendo que o sinal era menor em áreas menos diferenciadas. Esses resultados mostram que o HOXC6 não está envolvido com a carcinogênese oral enquanto que a presença dos transcritos HOXA7 e TGIF principalmente em regiões bem diferenciadas dos carcinomas epidermóides de boca sugere uma participação desses genes nesta neoplasia / Homeobox genes comprise a family of developmental regulators that are vital for several aspects of growth and differentiation. Recently HOXA7, HOXC6 and TGIF genes have been implicated with carcinogenesis and tumoral progression. However their involvement with oral squamous cell carcinomas (OSCC) has not been demonstrated yet. The possible presence of HOXA7, HOXC6 and TGIF transcripts in OSCC and adjacent non-tumoral tissues (NT) was verified. Transcripts were amplified by RT -PCR and its cellular localization was determined by in situ hybridization with specific riboprobes. Amplification of HOXA7 was seen in 70% of cases, 15% only in NT tissues, 45% only in OSCC samples and 10% in both tissues. No amplification of HOXC6 was observed. TGIF was amplified in 80% of cases, 5% only in NT tissues, 20% only in OSCC samples and 55% in both tissues. Statistical analysis showed that there was no significant difference between amplification of HOXA7 or TGIF and the type of tissue analyzed. Moreover, no association between amplification of transcripts in OSSC and clinical aspects was observed. ISH signal was similar for HOXA7 and TGIF transcripts. In NT tissues there was an intense expression in the epithelium, either in basal and suprabasal layers or disperse and more intense in the spinous layer. In OSCC transcripts were locali zed in all tumoral cells, but in poorly differentiated areas the signal was less intense. These results show that HOXC6 was not involved in oral carcinogenesis while the presence of HOXA7 and TGIF transcripts in OSSC, mostly in well differentiated regions, suggests a participation of these genes in OSCC

Genes da família homeobox têm sido alvo de intensas pesquisas científicas relacionadas ao câncer. Recentemente, mostramos que o gene homeobox TGIF1 está expresso no carcinoma epidermóide de boca na sua forma genérica. Porém, não foi feita uma discriminação entre quais variantes transcricionais, ou subtipos, do TGIF1 estariam expressas. Neste estudo, propusemo-nos a verificar diferenças na freqüência de expressão das variantes transcricionais do TGIF1 em carcinomas epidermóides de boca (CEB) em relação a tecidos morfologicamente não tumorais (TN), avaliar possíveis associações entre essas variantes nos pacientes portadores de CEB e relacionar o grau de expressão dessas variantes com aspectos clínicos, histológicos e com a sobrevida dos pacientes. Adicionalmente, procuramos analisar a expressão da proteína do TGIF1. Foram analisadas 48 amostras congeladas de CEB e 12 de TN. O RNA total de cada amostra foi extraído utilizando-se solução de TRizol®. Os transcritos do TGIF1 foram amplificados por RT-PCR para cada caso de CEB e TN utilizando-se inicialmente um par de iniciadores genéricos para todas as suas variantes. Após essa triagem, os casos positivos foram amplificados utilizando-se pares de iniciadores específicos para cada variante. Não houve diferença estatística entre a freqüência de expressão das variantes do TGIF1 nos grupos CEB e TN, porém as variantes 4 e 8 foram as que apresentaram p-valores menores. Dentro do grupo de CEB, houve associação significativa entre algumas variantes entre si (sete dos vinte e um cruzamentos), de forma que as variantes 1 e 4 foram as que mais tiverem associação com outras variantes. Dessa forma, optamos por prosseguir o estudo utilizando somente as variantes 1, 4 e 8. Não houve correlação entre a expressão das variantes selecionadas e variáveis clinicas e histológicas propostas. Em relação à sobrevida, a expressão das variantes 1 e 8 mostraram correlação univariada com o desfecho óbito, de maneira que o grupo de indivíduos que mais expressou ambas as variantes foi o que apresentou menor risco de óbito. Através da análise multivariada das variantes 1 e 8 e aspectos clínicos e histológicos, somente o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguínea tiveram significado estatístico. A expressão protéica do TGIF1 foi analisada em 46 amostras parafinadas considerando-se a diferenciação celular, a graduação imunoistoquímica e o compartimento celular. Os resultados obtidos mostraram que as variantes do TGIF1 estão expressas diferentemente no grupo dos pacientes com CEB e sugerese que a expressão das variantes 1 e 8 estejam relacionadas, de maneira semelhante, a um menor risco de óbito para pacientes portadores de CEB. Adicionalmente, sugere-se que o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguinea representem fatores de risco relevantes para o óbito de pacientes portadores de CEB. Sugere-se também que a expressão simultânea da proteína do TGIF1 tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula esteja correlacionada a lesões pobremente diferenciadas. / Genes of the homeobox family have been the subject of intense scientific research related to cancer. Recently, we show that this gene is expressed in oral squamous cell carcinoma in its generic form. However, it was not made a discrimination between which transcript variants, or subtypes\", of TGIF1 were expressed. In this study, we aim to verify differences in the expression of the eight transcript variants described for the homeobox gene TGIF1 in oral squamous cell carcinomas (OSCC) related with morphologically non-tumoral tissues (NT), evaluate possible associations between these variants in patients with OSCC and relate the degree of expression of these variants with clinical, histological and survival aspects of patients. Additionally, we analyzed the expression of TGIF1 protein. It was analyzed 48 frozen samples of OSCC and 12 of NT. The total RNA from each sample was extracted using TRizol solution. TGIF1 transcripts were first amplified by RT-PCR for each case of OSCC and NT using a generic pair of primers. After these screening, the positive cases were amplified using specific pair of primers for each variant. There was no statistical difference between the frequency of expression of TGIF1 transcript variants in OSSC and NT groups, but the variants 4 and 8 had the lowest p-values. Within the OSCC group, there was a significant association between some variants among themselves (seven of the twenty-one associations), in a way that the variants 1 and 4 were the ones that had most association with other variants. Thus, we chose to continue the study using only variants 1, 4 and 8. There was no correlation between the expression of the selected variants with the clinical and histological aspects. Regarding survival, the expression of variants 1 and 8 showed statistical correlation with the outcome death, in a way that the group of patients that most expressed both variants was that one with the lower risk of death. By multivariate analysis of variants 1 and 8 and clinical and histological aspects, only the size of the lesion and vascular invasion blood were statistically significant. The protein expression of TGIF1 was analyzed in 46 paraffin-embedded tissues considering the cell differentiation, the immunohistochemistry graduation and the cell compartment. The results showed that the variants of TGIF1 are differently expressed in the OSCC group of patients and it is suggested that the expression of variants 1 and 8 may be related, in a similar way, to a lower risk of death for patients with OSCC. Additionally, it is suggested that the size of the lesion and the vascular invasion of blood represent relevant risk factors for death in patients with OSCC. It is also suggested that the simultaneous expression of TGIF1 protein not only in the nucleus but also in the cytoplasm of the cell is correlated with the poorly differentiated lesions of OSCC.