O carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) abrange 95% de todas as doenças malignas da tireóide. Nos EUA, aumentou em 2,4 vezes nos últimos anos (1973-2002). O seu tratamento inclui tireoidectomia total, seguido por terapia com radioiodo e supressão do TSH com L-tiroxina. A doença pode recidivar em ~20% dos casos, sendo necessária avaliação periódica através de exames de imagens e dosagem de tireoglobulina sérica (TGs). Os Anticorpos (Acs) anti-TG podem ser detectados em 15 a 25% dos pacientes, comprometendo, parcialmente, o uso da TGs como marcador de recidiva do câncer. Um método alternativo proposto para monitorar os pacientes é a detecção de células tireoidianas em sangue periférico, através da mensuração do RNA mensageiro de TG (RNAm-TG) pela técnica de RTPCR em tempo real. Esta nova metodologia aumenta a sensibilidade da detecção desta molécula. O objetivo deste estudo é verificar a significância da quantificação do RNAm-TG, como método diagnóstico complementar no acompanhamento a longo prazo de pacientes com CDT. Amostras de sangue de 45 pacientes (25 sem metástase, 14 com metástase ganglionar e 6 com metástase à distância) foram coletadas nos tempos: antes e 24, 48, 72 horas, 7 dias, 1, 3, 6, 9 meses, 1, 2, 4, 5, 6 e 7 anos após a dose ablativa de radioiodo. Foi realizada extensiva padronização da técnica com a finalidade de excluir interferências metodológicas, empregando dois genes controles interno (GAPDH e HPRT1) para o cálculo da concentração do RNAm-TG. Concomitantemente foi realizada a mensuração de TGs, perfil hormonal e de anticorpos anti-TG. A pesquisa de corpo inteiro, realizada 7 dias após a dose terapêutica, estabeleceu o estadio clínico inicial dos pacientes. Não foi possível estabelecer um valor de corte para o RNAm-TG. O RNAm-TG não diferenciou os estadios clínicos da doença ao longo do tempo, independente do gene controle interno utilizado, e tampouco quando analisaram-se os dados na presença de Acs anti-TG e TSH30ng/mL. A TGs diferenciou os estadios clínicos ao longo do tempo. Concluiu-se que, o RNAm-TG não é um bom marcador de recidiva do CDT, mesmo quando considerou-se critérios de padronização da técnica, avaliação em longo prazo e presença de Acs anti-TG, sendo assim não poderia ser utilizado como método diagnóstico complementar no acompanhamento de pacientes com CDT. Este estudo demonstra que a técnica de RT-PCR em tempo real é muito sensível perdendo especificidade, inviabilizando sua utilização no acompanhamento dos pacientes com CDT / The differentiated thyroid carcinoma (DTC) encloses 95% of all thyroid malignant disease. In USA, it increased 2,4 times in recent years (1973- 2002). The treatment includes total thyroidectomy, ablation with radioiodine (RAI) followed by TSH suppression with L-Thyroxine. The cancer recurrence occurs in 20% of the cases. Periodic evaluation through imaging examinations and serum thyroglobulin (TG) measurements by imunoassays method is recommended for careful follow-up of these patients. The anti-TG antibodies prevalence is 15-25% and would impair, partially, the serum TG use as a tumor marker. An alternative method to identify the recurrence of the tumor is the thyroid cells detection in peripheral blood, through the TG messenger RNA quantification (mRNA-TG) by real time RT-PCR. This new methodology increases the sensitivity detection for this molecule. The objective of this study was to verify the mRNA-TG peripheral blood quantification significance, as a complementary diagnostic method in the long term follow up of patients with DTC. Fourty five blood samples from patients with DTC have been collected before and 24, 48, 72 hours, 7 days, 1, 3, 6, 9 months, 1, 2, 4, 5, 6 and 7 years after the ablation therapy. Extensive technique standardization for mRNA-TG measurements was carried out to exclude methodological interventions and two housekeeping genes (GAPDH and HPRT1) were used to calculate the mRNA-TG concentrations. Concomitantly, serum TG measurements, hormonal profile and antibodies anti-TG assays were performed. The whole body scan was performed 7 days after RAI ablation to determine the stage of the disease. It was not possible to establish a cut-point value for mRNA-TG. The mRNA-TG did not differentiated the clinical stage of the disease in the long term follow-up and neither in the presence of anti-TG antibodies and TSH30ng/mL. Serum TG was able to differentiate the clinical stage of the patients during the follow-up. In conclusion mRNA-TG is not a good marker for the DCT recurrence, even when technical standardization, long term evaluation and the presence of antibodies anti-TG were considered. Thus it could not be used as a complementary diagnostic method in the DTC patients follow-up. This study confirmed the high sensivity of the real time RT-PCR whereas with very low specificity, consequently is unviable to be used in the DTC patients follow-up

INTRODUÇÃO: Pacientes em terapia anti-retroviral podem apresentar escapes transitórios de viremia plasmática (blip), porém os preditores desse evento e seu impacto sobre a incidência de falência virológica são ainda controversos na literatura. Neste estudo de coorte estimou-se a incidência de blip e de falência virológica e investigaram-se possíveis preditores de tais desfechos. Blip foi definido como carga viral superior a 50 cópias/mL com subseqüente supressão da viremia plasmática e falência virológica como duas medidas consecutivas de carga viral plasmática superiores a 50 cópias/mL. Adicionalmente, pesquisou-se, por ocasião desses eventos, a presença de mutações genotípicas de HIV capazes de conferir resistência aos anti-retrovirais e as concentrações plasmáticas de inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e inibidores da protease, comparando-as com o relato dos participantes sobre adesão à medicação. MÉTODOS: 350 participantes infectados pelo HIV (250 homens e 100 mulheres) foram selecionados no Serviço de Extensão ao Atendimento de Pacientes com HIV/Aids Casa da Aids do Hospital das Clínicas da FMUSP, São Paulo, Brasil. Na admissão ao estudo e trimestralmente, ao longo de 78 semanas, foram coletadas informações sobre dados sóciodemográficos, forma presumida de aquisição do vírus, uso de e adesão a medicações anti-retrovirais, ocorrência de outras comorbidades, bem como uso de álcool e de drogas ilícitas. Investigaram-se fatores potencialmente associados à incidência dos desfechos de interesse, tais como ocorrência de outras doenças, exposição a imunizações e falha na adesão a práticas de sexo mais seguro. Amostras de sangue periférico foram coletadas a cada visita para determinação de carga viral plasmática por RT-PCR ultrassensível, e contagem de linfócitos T CD4+ por citometria de fluxo. Nos indivíduos que apresentaram os desfechos de interesse do estudo, procedeu-se ao seqüenciamento dos genes da transcriptase reversa e da protease de HIV e à dosagem plasmática dos anti-retrovirais por método de Cromatografia Líquida de Alta Performance. As incidências de blip e falência virológica foram estimadas e os fatores associados a ambos investigados em modelo de regressão logística múltipla. RESULTADOS: As incidências de blip e falência virológica foram 9,4 e 4,2/100 pessoas-ano, respectivamente. Três indivíduos apresentaram falência virológica precedidos por blip. À análise multivariada, a não adesão às praticas de sexo mais seguro no mês precedente se mostrou independentemente associada à ocorrência de blip (OR 24,64, IC 95% 4,40 137,88, p<0,001) e de falência virológica (OR 24,69, IC 95% 4,20 145,18, p<0,001). Adicionalmente, observou-se que a exposição prévia a maior número de esquemas anti-retrovirais foi preditora dos eventos blip (OR 1,82, IC 95% 1,41 2,36, p<0,001) e falência virológica (OR 1,67, IC 95% 1,19 2,35, p=0,003). A ocorrência de blip não se associou ao desenvolvimento posterior de falência virológica. Um maior número de mutações conferidoras de resistência medicamentosa foi identificado no momento de falência virológica, quando comparado ao momento de blip, com predomínio de mutações no gene da transcriptase reversa, refletindo o maior uso desses fármacos. Das 122 concentrações plasmáticas de anti-retrovirais analisadas em 120 amostras, 84 estavam em níveis terapêuticos adequados. Porém, tais resultados apresentaram apenas 69% de concordância com a adesão auto-referida à medicação. Este estudo mostra que apresentar blip em uma medida isolada pode ser um evento benigno; por outro lado, falência virológica pode ser conseqüente a acúmulo de mutações conferidoras de resistência a pelo menos um dos anti-retrovirais em uso, podendo comprometer a eficácia do esquema terapêutico utilizado. Ambos os desfechos mostraram-se mais incidentes na população multiexperimentada à terapêutica, que, portanto, merece atenção particular. Uma importante contribuição deste estudo foi a avaliação da dosagem plasmática dos antiretrovirais, método simples e de baixo custo, que, implantado na rotina laboratorial, pode contribuir para o monitoramento da adesão aos antiretrovirais e reduzir a demanda por testes genotípicos / BACKGROUND: HIV-1-infected patients under antiretroviral therapy may present intermittent viremia (blip); however, predictors of this outcome and its influence on the incidence of virologic failure remain controversial in the literature. The aim of this study is to estimate the incidence of blip and virologic failure in a cohort of patients under stable antiretroviral therapy and to investigate their associated factors. Blip was defined as a plasma HIVRNA load above 50 copies/mL followed by a subsequent value below 50 copies/mL. Virologic failure was defined as two consecutives measures of viral load above 50 copies/mL. Moreover, at time of occurrence of these outcomes, HIV genotyping assays were performed in search of drug resistance-associated mutations, and plasma concentrations of nonnucleoside reverse transcriptase and protease inhibitors assessed and compared with self-reported adhrence to therapy. METHODS: 350 subjects (250 male and 100 female) were enrolled at the HIV Clinic, School of Medicine, University of São Paulo, Brazil and followed for 78 weeks. At baseline and in 3-month interval follow-up visits we collected sociodemographic data and information on presumed mode of HIV acquisition, use of and adherence to antiretrovirals, comorbidities and use of alcohol and illicit drugs. Additionally, patients were questioned about potential predictors of the outcomes, including occurrence of other diseases, immunizations and risky sexual behavior. Blood samples were drawn for assessment of HIV plasma viral loads, using ultrasensitive RT-PCR, and T CD4+ cell counts by flow cytometry. Individuals who presented blip and/or virologic failure were submitted to HIV genotyping assays and assessment of antiretroviral plasma concentrations by high-performance liquid chromatography. Incidences of blip and virological failure were estimated and associated factors investigated, using a multiple logistic regression model. RESULTS: The incidence of blip and of virologic failure were 9.4/100 and 4.2/100 person-years, respectively. Three individuals presented virologic failure after blip episodes. On multivariate analysis, non-adherence to safer sex measures in the previous month was shown independently associated with the occurrence of blip (OR 24.64, 95%CI 4.40 137.88, p<0.001) and virologic failure (OR 24.69, 95%CI 4.20 145.18, p<0.001). In addition, history of multiple exposures to antiretroviral regimens was also a predictor of blip (OR 1.82, 95%CI 1.41 2.36, p<0.001) and virologic failure (OR 1.67, 95%CI 1.19 2.35, p<0.001). Blips were not predictive of virologic failure. A larger number of HIV mutations were identified at time of virologic failure, as compared to blip episodes, with mutations detected predominantly in the reverse transcriptase (RT) gene, probably due to larger exposure to RT inhibitors. Eighty-four out of 122 assessments of antiretroviral plasma concentrations analyzed in 120 samples resulted in the therapeutic range. However, these results were concordant with self-reported adherence to therapy in 69% of cases only. This study shows that a single blip episode may be considered benign, whereas virologic failure could result from accumulation of HIV drug resistance-associated mutations that may impair the efficacy of therapy. Both study outcomes occurred more frequently among patients with larger exposure to antiretrovirals, and therefore they should be monitored in this regard. An important contribution of this study concerns the assessment of antiretroviral plasma concentrations, a simple and low cost laboratory tool. Incorporated routinely in patient follow-up, it would help monitoring adherence to therapy and reduce the need for HIV genotyping assays

Orientador: Marcelo Carnier Dornelas / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RaphaelRiconde_M.pdf: 18901083 bytes, checksum: be7da78a89962bc71a77edca29ef7399 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A família dos genes MADS-box codifica fatores de transcrição que atuam como reguladores importantes em muitas etapas no desenvolvimento de diversos organismos. Em plantas, estes genes estão envolvidos na determinação da identidade dos meristemas reprodutivos e dos órgãos florais, bem como no controle de diversos processos durante o desenvolvimento. O presente trabalho teve como objetivo estudar o padrão de expressão dos prováveis ortólogos dos genes do modelo ABC (APETALA1, APETALA3, PISTILATA e AGAMOUS de Arabidopsis thaliana, e do gene TM6 de Solanum lycopersicum) em Coffea arabica L. Estes genes pertencem à família MADS-box e estão relacionados à determinação da identidade dos órgãos florais na planta-modelo A. thaliana. A partir do banco de dados de sequências expressas de cafeeiro (CAFEST), foram identificados 23 possíveis homólogos de genes MADS-box em cafeeiro. Perfis de expressão por RT-PCR indicaram que a maioria destes genes são expressos em flor e fruto. A análise dos dados gerados pelo uso de microscopia óptica e de varredura permitiu estabelecer uma sequência de desenvolvimento para estabelecimento dos órgãos florais em cafeeiro, facilitando a identificação dos locais de expressão dos ortólogos do modelo ABC pela técnica de hibridização in situ. Sendo C. arabica uma espécie relativamente recente e com características peculiares, foi proposto um mecanismo de atuação dos genes do modelo ABC. Dessa forma, os resultados obtidos contribuem para a compreensão do estabelecimento dos órgãos florais em C. arabica. Adicionalmente, pela caracterização de um número elevado de genes da família MADS, foram identificados outros genes potencialmente envolvidos em outros processos de desenvolvimento, que futuramente poderão ser utilizados para incremento da indústria cafeeira. / Abstract: The MADS-box gene family encodes transcription factors that act as key regulators in many steps in the development of various organisms. In plants, these genes are involved in determining the identity of reproductive meristems and floral organs as well as in controlling several processes during development. This work aimed to study the expression patterns of putative orthologs of the ABC model genes (APETALA1, APETALA3, AGAMOUS and PISTILATA from Arabidopsis thaliana, and TM6 from Solanum Lycopersicum) in Coffea arabica L. These genes belong to the MADS-box family and are related to the determination of floral organ identity in the model plant A. thaliana. From the CAFEST database of expressed sequence tags, 23 MADS-box gene sequences were identified in coffee. Expression profiles of these genes, determined by RT-PCR, indicated that most of these genes are expressed in flowers and fruits. The analysis of data from optical microscopy and scanning electron microscopy allowed the establishment of a developmental sequence for the establishment of floral organ, facilitating the characterization of the spatial expression patterns of orthologs of the ABC genes by in situ hybridization. A diversified role of conserved genes of the ABC model was proposed for the relatively recent and peculiar specie that is C. arabica. The obtained results aid the understanding of the establishment of floral organs in C. Arabica. Additionally, as many other coffee MADS-box genes were also characterized, other genes, potentially involved in other developmental processes that could be of interest to the industry in the future were also identified. / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Orientadores: Edgard Graner, Dirce Maria Carraro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-09T00:12:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_SabrinaDanielada_D.pdf: 3843644 bytes, checksum: 5f28aadd1eaaa2a9069f84e9bccd7d5f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O sistema ubiquitina (Ub)-proteassomo degrada proteínas intracelulares marcadas com etiquetas de Ub, controlando a disponibilidade destas para a célula. Graner et al. (2004) clonaram recentemente USP2a, uma enzima desubiquitinante que interage com ácido graxo sintase (FAS), provocando sua estabilização e protegendo-a da degradação proteassômica, o que aumenta a meia vida desta enzima metabólica. FAS é a principal enzima envolvida na síntese endógena de ácidos graxos saturados de cadeia longa. Nos tecidos normais a síntese é mínima, pois a maior parte dos ácidos graxos utilizados pelas células é proveniente da dieta. Vários trabalhos recentes têm demonstrado que a expressão de FAS está elevada em diversas neoplasias malignas humanas e, em alguns tumores, sua alta expressão foi associada com pior prognóstico. Há poucos estudos sobre a expressão de FAS em carcinomas espinocelulares (CEC) bucais e todos sugerem a sua participação nas etapas iniciais de transformação maligna. Foi demonstrado que FAS é essencial para a proliferação de linhagens celulares de CECs bucais, tumores estes que expressam maior quantidade desta enzima que o epitélio normal adjacente. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos básicos envolvidos no aumento da expressão de FAS em células malignas e seu controle pós-traducional. Recentemente foi demonstrado que ErbB2, um receptor da família ErbB, é capaz de aumentar a expressão de FAS em uma linhagem celular de mama, a qual se torna sensível ao tratamento com bloqueadores da atividade de FAS, entrando em apoptose. Considerando-se o relevante papel biológico de USP2a de proteger FAS da destruição pelo proteassomo e o fato da superexpressão de ErbB2 estar ligada a FAS, o objetivo deste projeto foi estudar a quantidade de RNAs mensageiros provenientes de amostras microdissecadas a laser e suas proteínas em CECs bucais. Nas amostras avaliadas, ErbB2 exibiu dois padrões bastante distintos de marcação, um localizado na membrana plasmática e o outro intra-citoplasmático. Uma alta porcentagem (97,06%) das células fortemente positivas para FAS foi também intensamente marcada para ErbB2 em membrana plasmática, com correlação positiva estatisticamente significante (p = 0,001) e ambos tiveram associação com o marcador de proliferação celular Ki-67. A positividade para ErbB2 e FAS foi correlacionada com os tumores que apresentaram maior espessura de lesão e comprometimento microscópico dos linfonodos. A intensa expressão de ErbB2 na membrana celular ocorreu em áreas de maior diferenciação celular, enquanto que áreas menos diferenciadas e com maior pleomorfismo celular, a expressão citoplasmática de ErbB2 foi mais evidente. As análises realizadas, por meio de qRT-PCR indicaram que os transcritos USP2a, FAS e ErbB2 estão diferencialmente expressos entre as amostras tumorais de CEC bucal quando comparado ao tecido pareado morfologicamente normal das margens adjacentes e ambos estão estatisticamente correlacionadas entre si. Estes resultados mostram que a maioria dos CECs bucais analisados expressa concomitantemente FAS e ErbB2, sugerindo a participação desta última molécula na regulação da expressão gênica de FAS, a qual pode ter um papel biológico na patogênese destas lesões. Além do mais, as proteínas analisadas mostraram ser marcadores moleculares para o prognóstico nestas lesões / Abstract: The ubiquitin (Ub)-proteasome pathway controls cellular protein turnover by degrading targeted intracellular proteins tagged with Ub. Graner et al. (2004) demonstrated that the deubiquitinating enzyme USP2a stabilizes and rescues fatty acid synthase (FAS) from proteassomal degradation. FAS plays a central role in de novo lipogenesis and is down-regulated in most of the tissues, because cells preferentially use circulating dietary fatty acids for the synthesis of new structural lipids. On the other hand, it has been demonstrated that FAS is highly expressed in several human cancers and in some of them its expression is correlated with poor outcome. Few studies describe FAS expression in oral squamous cell carcinoma (SCC), however, all of them suggest that the it is increased at the early stages of malignant transformation. It has been shown that FAS is over-expressed in human oral SCC cell lines and plays an essential role in their proliferation. However, the basic mechanism underlying the control of FAS expression in malignant cells is not known at the moment. It was recently demonstrated that the overexpression of the transmembrane tyrosine kinase receptor ErbB2 is able to increase the expression of FAS in a breast epithelial cell line, which in turn becomes susceptible to apoptosis by FAS inhibition. Considering that USP2a prevents the destruction of FAS through deubiquitination and that ErbB2 overexpression is associated with FAS production, the purpose of the present study was to investigate their mRNA levels by real time PCR in SCC samples and morphologically normal tissue after laser capture microdissection. We also evaluated ErbB2 and FAS protein levels by immunohistochemistry. Two distinct patterns of ErbB2 positivity were identified, a sharply demarcated membrane staining, found in the adjacent normal epithelium and well differentiated areas of the tumors, and a cytoplasmic reaction observed mainly in undifferentiated cells. Most of the lesions (97.06%) that showed a high expression of FAS were also positive for ErbB2 at the cell membrane (p=0.001) and both had correlated with the proliferation marker Ki-67. The immunolabeling for ErbB2 at the cell membrane was also stronger in histologically well differentiated lesions while cytoplasmic positivity was found in undifferentiated tumors. FAS and ErbB2 positivity were associated with microscopic characteristics as thickness and lymphatic embolization of the lesion. Our study also showed a strong positive correlation between ErbB2, FAS and USP2a mRNA expression in the SCC samples compared with normal morphologically tissue of the same source. Taken together, the results presented here show that FAS and ErbB2 are co-expressed in oral SCC and suggest that ErbB2 is able to regulate FAS production in these tumors. Moreover, our data point out that these proteins are significantly associated with a poor prognosis / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientadores: Clarice Weis Arns, Isabela Cristina Simoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MariaJuditeBittencourt_D.pdf: 1711625 bytes, checksum: d2876be51222b1ba7526b13ab7a72795 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A doença infecciosa da bursa (IBD), denominada também doença de Gumboro, é uma doença aguda, imunossupressora, altamente contagiosa de aves jovens e de grande importância econômica para a avicultura. O vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), sorotipo 1, pode ser classificado de acordo com sua antigenicidade e patogenicidade em amostras clássicas virulentas (cv), atenuadas, variantes antigênicas ou muito virulentas (vv). Estas diferenças antigênicas são encontradas na região hipervariável do gene VP2, que é responsável pela indução de anticorpos neutralizantes e também dos possíveis marcadores de virulência que ainda não estão bem estabelecidos. O gene VP1 parece também apresentar um papel na virulência do vírus. Primeiramente, o objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização molecular de 66 amostras brasileiras de IBDV através da RT-PCR de um fragmento do gene VP2 seguida pela digestão por enzimas de restrição (RE) e posterior confirmação pelo sequenciamento. A análise da RT-PCR/RE classificou 25 isolados como cepas vv e 16 como cepas cv além da classificação de 6 grupo moleculares. O sequenciamento também confirmou esta classificação com a presnça dos aminoácidos (aa) típicos das amostras vv (222A, 242I, 256I e 294I). Em 3 destes amostras vv também se observou mutações únicas que mostram pequenas, mas contínuas alterações dos vvIBDV circulantes nas granjas brasileiras. A arvore filogenética confirmou a origem comum das nossas amostras vv com os isolados de outros países assim como a origem monofilética destas amostras. Posteriormente foi feito a RT-PCR de um fragmento representativo do gene VP1 das amostras positivas para IBDV e a análise das sequências e filogenética. Quatorze amostras vv e três cv tiveram êxito nas sequências analisadas. Treze amostras vv apresentaram as substituições de aa comuns para as amostras vv (145T, 146D, 147N e 242E), exceto um que apresentou a sequência das amostras cv e na filogenia agrupou-se com estas amostras. A árvore a partir da VP1 pressupõe um rearranjo genético deste gene. Esta amostra com perfil do segmento A de amostra vv e do segmento B de cv seria o primeiro relato no Brasil de um rearranjo genético natural. Estes rearranjos de segmentos que também foram observados em amostras de outros países ou que podem ser produzidos em laboratório (quimeras) mostram que o segmento B pode estar contribuindo para a patogênese deste vírus. A origem destes rearranjos pode ser de troca genética com o uso de vacinas vivas ou se aceita a hipótese de que o segmento VP1 dos vvIBDV se originaram de um rearranjo genético de fonte desconhecida, estes rearranjos com segmento vvVP2 e cvVP1, seriam descendentes dos ancentrais dos vvVP1. Apenas um seqüenciamento completo das duas sequências e estudos in vivo poderão caracterizar o papel da VP1 na virulência desta amostra. Assim, o monitoramento contínuo das amostras de IBDV através da caracterização molecular pela análise das sequências dos genes e a detecção de alterações genéticas que possam influenciar a patogenicidade do vírus são de extrema importância, pois geram informações fundamentais que possibilitam e subsidiam o controle desta doença no Brasil / Abstract: Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a disease among young chickens of great economic importance to the poultry industry worldwide both for the both mortality as the immunosuppression. Two distinct serotypes, 1 and 2, of IBDV are recognized. Only the serotype 1 is pathogenic for chickens and classified according to the antigenicity and/or pathogenicity in classical virulent (cv) strains, very virulent (vv) strains, antigenic variant strains, and attenuated strains. This classification has been based mainly on the VP2 gene sequence, more specifically on the hypervariable region corresponding to the induction of neutralizing antibodies and the serotype specificity. However, the fundamental molecular basis for pathogenicity is not yet clear. Studies with the VP1 gene have also shown its possible role in this virulence and pathogenicity. Firstly, the aim of the present paper was the molecular characterization of sixty-six Brazilian IBDV isolates from broiler and layers flocks during the period from 1997 to 2005 by RT-PCR followed by restriction enzyme analysis of a fragment from VP2 gene variable region. Sequence and phylogenetic analysis of the positive isolates were also carried out. Twenty-five of the isolates were identified as very virulent (vv) and sixteen as classic virulent (cv). All of vv isolates had the typical amino acid (aa) residues and clustered in a phylogenetic tree with the vvIBDV strains. Three vv isolates presented four common aa substitutions and differed from other vv strains indicating that the vvIBDVs circulating on Brazilian farms are undergoing slight but continuous exchanges. Furthermore, the Brazilian IBDV isolates characterized by the VP2 sequence in cv and vv strains were analyzed by the sequence and phylogeny of the VP1 gene fragment. Our vv isolates maintained clustered with the other vvIBDVs in phylogenetic tree obtained from the VP1 gene and presented the common aa too. The same occurred with the cv isolates. However, one isolate vv showed both characters, cv and vv into VP1 sequence and clustered with the ours and other cv isolates in the tree. This isolate has similar type of a reassortment / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Pacientes com câncer de mama localmente avançado são submetidas à quimioterapia neoadjuvante na tentativa de reduzir a dimensão do tumor e aumentar a possibilidade da realização de uma cirurgia conservadora. Nosso grupo identificou previamente através da tecnologia de cDNA microarray, trios de genes, incluindo BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 e XLHSRF-1, cuja expressão era capaz de predizer a resposta à quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ciclofosfamida em pacientes com câncer de mama. No presente estudo, avaliamos se a expressão destes genes é reprodutível na identificação de pacientes responsivas e não-responsivas através de RT-PCR em tempo real, que representa uma técnica mais acessível. Avaliamos inicialmente amostras de 28 pacientes anteriormente estudadas (grupo de validação técnica = 23 responsivas e cinco não-responsivas) e a seguir um grupo de 14 novas pacientes (grupo de validação biológica = 11 responsivas e três não-responsivas). Dentre os trios de genes inicialmente identificados, a expressão de RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 e RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 classificou corretamente 86% (24/28) das amostras do grupo de validação técnica e 71% (10/14) das amostras do grupo de validação biológica, através de análise de classificação discriminante. Desse modo, esses trios não demonstraram a mesma precisão em comparação com resultados de cDNA microarray. Uma nova análise combinatória foi realizada na procura do melhor modelo preditivo utilizando valores de expressão obtidos por RT-PCR em tempo real. Identificamos então um novo trio, composto pelos genes RPL37A, SMYD2 e MTSS1, cuja expressão classificou corretamente 93% das amostras do grupo de validação técnica (22/23 responsivas e 4/5 não-responsivas) e 79% do grupo de validação biológica (8/11 responsivas e 3/3 não-responsivas). Portanto, o teste apresentou 88% de sensibilidade e especificidade em detectar pacientes responsivas para o total de amostras analisadas. Ao verificarmos o poder de classificação do mesmo grupo de genes, utilizando os valores de expressão pela análise de cDNA microarray, observamos um resultado semelhante (91% de sensibilidade e especificidade em reconhecer as amostras responsivas). Dessa forma, demonstramos que o perfil de expressão gênica obtido com cDNA microarray é reprodutível através do uso de RT-PCR em tempo real. Um estudo integrando um maior número de pacientes e uma plataforma de cDNA microarray mais abrangente pode auxiliar na identificação de um modelo preditivo baseado em grupos de genes mais acurado para antever a resposta ao tratamento com quimioterapia baseada em doxorrubicina. / Patients with locally advanced breast cancer are submitted to primary chemotherapy as an attempt to reduce tumor dimension and increase breast conserving surgery rates. Our group has previously identified through cDNA microarray technology gene trios, including BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 and XLHSRF-1, whose expression was capable of predicting response to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin and cyclophosphamide in breast cancer patients. In the current study, it was evaluated whether expression of these genes is reproducible in the identification of responsive and non-responsive patients by real time RT-PCR, which represents a more accessible technique. We initially evaluated samples from 28 patients earlier studied (technical validation group = 23 responsive and 5 non-responsive) and subsequent to a new 14 patients set (biological validation group = 11 responsive and three non-responsive). Among the initially identified gene trios, RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 and RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 expression correctly classify 86% (24/28) samples from the technical validation group and 71% (10/14) samples from the biological validation group, through discriminant classification analysis. Therefore, these trios didnt demonstrate the same precision as compared with cDNA microarray results. A new combinatorial analysis was also performed in search of the best predictive model using real time RT-PCR expression values. A new trio was identified, represented by RPL37A, SMYD2 and MTSS1 genes, whose expression correctly classified 93% samples from technical validation group (22/23 responsive and 4/5 non-responsive) and 79% samples from biological validation group (8/11 responsive samples and 3/3 non-responsive samples). Therefore, the test presented 88% sensibility and specificity in identifying responsive patients for all samples analyzed. By means of verifying the classification strength of the same gene group, using cDNA microarray expression values, we observed a similar result (91% sensibility and specificity in recognizing responsive samples). Thus, we demonstrated that gene expression profile obtained by cDNA microarray is reproducible through real time RT-PCR. A study integrating a larger number of patients and a more comprehensive cDNA microarray platform may help the identification of a more accurate predictive model based on gene groups to foresee response to doxorubicin-based chemotherapy treatment.

Pacientes com câncer de mama apresentam menores níveis de 1,25(OH)2D3 ou 25(OH)D3 em relação às mulheres sem a doença. Embora linhagens de câncer de mama apresentem inibição do crescimento em concentrações supra-fisiológicas de 1,25(OH)2D3, forma ativa da vitamina D, ainda não se demonstrou se o hormônio exerce efeito antiproliferativo, em concentrações fisiológicas, em tumores de seres humanos. A suplementação de calcitriol pode ser indica a mulheres pós-menopausadas para prevenir a perda óssea. Nosso objetivo foi avaliar em pacientes com câncer de mama, pós menopausadas, a dimensão do tumor, taxa de proliferação (expressão de Ki67), concentração sérica de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3, expressão gênica tumoral do receptor de vitamina D (VDR) e alguns genes alvos como, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, antes a após um mês de suplementação oral de calcitriol. Foram estudadas 24 pacientes com doença operável, idade mediana de 57 anos. As primeiras 10 pacientes e as 14 seguintes receberam 0,25 e 0,50g/dia de calcitriol, respectivamente, por um período mediano de 31 dias. Três quartos das pacientes apresentavam nível sérico de insuficiência de 25(OH)D3 ou insuficiência relativa (<30ng/ml) e após a suplementação, nenhuma paciente apresentou elevação dos níveis séricos de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3. Embora a dimensão tumoral, mensurada por ultrasonografia, não apresentasse variação, a imuno-expressão de Ki67 sofreu um redução relativa mediana de 40%. A expressão relativa de VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 não se alterou com a suplementação. Nossos dados indicam que tumores de mama expressam VDR, e que após suplementação oral de calcitriol, ocorre uma redução da proliferação. Este efeito merece ser elucidado, desde que genes alvo clássicos da 1,25(OH)2D3 não parecem ser mediadores do efeito anti-proliferativo, em amostras de câncer de mama de pacientes pós menopausadas. / Breast cancer patients present lower 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum levels than unaffected women. Although breast cancer cell lines are growth inhibited by vitamin D supra-physiological concentrations, there is much uncertainty about the anti-proliferative effect of physiological concentrations of 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, in breast cancer specimens in vivo. Vitamin D supplementation to post-menopausal women may be indicated to reduce bone loss. Our aim was to evaluate tumor dimension, proliferation rate (Ki67 expression), 25(OH)D3 and 1,25(OH)2D3 serum concentration, and tumor expression of vitamin D receptor (VDR), and of some target genes as CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, before and after a one month calcitriol supplementation to post-menopausal breast cancer patients. Twenty four patients with operable disease, median age 57 years, were enrolled. The first tem patients were supplemented with calcitriol 0.25g/d and the next 14 patients, with 0.50g/d, for a median period of 31 days. Three fourths of the patients presented 25(OH)D3 insufficiency or relative insufficiency (<30 ng/mL) and after calcitriol supplementation, none of them presented an elevation of 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum concentration. Although tumor dimension, evaluated by ultrasonography, did not vary, a median relative reduction of 40% in Ki67 immuno-expression, was observed. No differences in VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 mRNA relative expression were detected between pre and post-supplementation samples. No differences in VDR, CYP27B1 and CYP24A1 tumor relative expression were detected following supplementation. Our data indicate that VDR expression is detected in breast cancer samples and that growth inhibition takes place after calcitriol oral supplementation. This anti-proliferative effect deserves further investigation, as classical target genes do not seem to be involved.

Estudos sugerem que a presença de células metastáticas ocultas em medula óssea pode ser fator prognóstico em câncer de mama. Além disso, é possível que um perfil gênico tumoral específico, caracterizado por repressão da expressão gênica, esteja associado à detecção de células tumorais na medula óssea. O silenciamento de genes é controlado pela desacetilação de histonas e metilação de DNA, esta última catalisada por enzimas DNA metil transferases. Outro alvo de metil-transferases são as histonas, e histona H3 quando sofre metilação em lisina 9, gera sítio de ligação a proteínas HP1 (Heterocromatin protein-1 ou cromobox). Membros da família HP1 (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1HsY) participam da formação da heterocromatina e da regulação da expressão de genes. Logo, nosso objetivo foi determinar no tumor primário de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy , que participam da repressão gênica, em relação à presença ou ausência de células metastáticas ocultas na medula óssea. Neste estudo foram incluídas 37 pacientes de forma prospectiva, atendidas no Instituto Brasileiro de Controle do Câncer (IBCC) no período de junho de 2004 a julho de 2005, com diagnóstico histopatológico de carcinoma invasivo de mama, estádio clínico (EC) I (16,2%), II (51,4%) ou III (32,4%), segundo a classificação patológica. A idade mediana das pacientes foi 63 anos (41 a 90) e 62.2% delas encontravam-se na pós-menopausa, sendo que 24.3% relatava história familiar para câncer de mama. O tipo histológico predominante foi carcinoma ductal invasivo (89.2% dos casos), sendo, o restante, representado por carcinoma lobular invasivo (10.8%). Foram coletadas amostras de tumor primário de mama e de aspirado de medula óssea de cada paciente. A presença de células metastáticas ocultas (CMO) na medula óssea (MO) foi detectada através da expressão de citoqueratina 19 (CK19) pelo método de nested RT-PCR. A expressão relativa dos genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy foi determinada no tumor primário, usando-se a técnica de RT-PCR em tempo real. Presença de CMO foi detectada na MO de 20 pacientes (54.1%). Não observamos diferença na expressão de HP1Hs? (1,93 ± 2,25 MO- vs 3,84 ± 5,53 MO+), HP1Hs? (6,74 ± 6,31 MO- vs 6,49 ± 5,86 MO+) e HP1Hs? (24,58 ± 11,14 MO- vs 24,91 ± 15,88 MO+) entre as amostras tumorais de pacientes com presença (MO+) ou ausência (MO-) de micrometástase medular. Também não observamos variação da expressão de genes HP1 em relação ao comprometimento linfonodal, dimensão e grau histológico do tumor, expressão tumoral de receptores de estrógeno e estado menopausal da paciente. A expressão de HP1Hsalfa em tumores de pacientes com câncer de mama ERBB2 negativos, entretanto, foi maior do que em tumores ERBB2 positivos. Nossos dados indicam que em tumores de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy não parece se associar à presença de células ocultas em medula óssea / Studies suggest that the presence of occult metastatic cells (OMC) in the bone marrow (BM) may be a prognostic factor in breast cancer. Besides, it is possible that a specific tumor gene profile, characterized by repression of gene expression, may be associated to the presence of tumoral cells in the bone marrow. Gene silencing is controlled by histone deacetylation and DNA methylation, the last one catalized by enzymes DNA methyltransferases (DNMTs). Histones are another target of methyltransferases, and methylation of histone H3 on lysine-9 generate a binding site for HP1 proteins (Heterocromatin protein-1 or chromobox). Members of the HP1 family (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy) take part in heterochromatin formation and gene expression regulation. Hence, our aim was to determine in the primary tumor of the breast, the expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy, which participate in gene repression, in the presence or absence of occult metastatic cells in the bone marrow. In this study, 37 patients treated at Instituto Brasileiro de Controle do Câncer, from June 2004 to July 2005, with invasive breast cancer histopathologically confirmed, pathological clinical stages I (16,2%), II (51,4%) or III (32,4), were included. The median age of the patients was 63 years (41 to 90), 62.2% were post-menopausal and 24.3% reported family history of breast cancer. Invasive ductal carcinoma was diagnosed in most patients (89.2%), and invasive lobular carcinoma was detected in the other patients (10.8%). Tumor samples and bone marrow aspirates were obtained from each patient. The presence of CMO in BM was detected by keratin-19 (CK19) expression by nested RT-PCR. The relative expression of the genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy was determined by real-time RT-PCR. Occult metastatic cells (OMC) in BM were detected in 20 patients (54.1%). No differences were observed in the expression of HP1Hs? (1,93 ± 2,25 BM- vs 3,84 ± 5,53 BM+), HP1Hsalfa (6,74 ± 6,31 BM- vs 6,49 ± 5,86 BM+) and HP1Hsbeta (24,58 ± 11,14 BM- vs 24,91 ± 15,88 BM+) between tumor samples of BM+ patients and BM- patients. Variations of HP1 gene expression were neither observed according to lymph node involvement, tumor size, histological grade, estrogen receptor status and menopausal status. However, HP1Hsbeta expression in ERBB2-negative tumors was higher than in ERBB2-positive tumors. Our data indicate that in breast cancer tumors, expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy does not seem to be associated with the presence of occult metastatic cells in the bone marrow

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A partícula viral não apresenta envelope e o material genético é constituído por uma molécula de RNA de fita simples, de polaridade positiva. Pertencem à família Caliciviridae, gênero Norovirus e estão classificados em cinco genogrupos (GI–V), sendo que os NoV humanos estão agrupados nos genogrupos I, II e IV e destes, os NoV do genogrupo II e genótipo 4 (GII.4) são os mais comumente encontrados, em todo o mundo. Apesar da associação destes vírus com a doença diarréica aguda estar bem documentada na literatura mundial, no Brasil, os trabalhos são escassos e restritos aos grandes centros e adjacências. Assim, considerando-se o pouco conhecimento sobre os norovírus e a inexistência de dados epidemiológicos na cidade de Juiz de Fora, MG, foi realizado o presente estudo, cujos objetivos foram a detecção e caracterização molecular de amostras de NoV, associadas a casos esporádicos de doença diarréica aguda infantil, bem como a avaliação da influência de fatores climáticos e demográficos na ocorrência destas infecções. De janeiro de 2008 a dezembro de 2009, 218 espécimes fecais foram analisados para a presença de NoV, por RT-PCR convencional, todos obtidos de crianças de 0 a 12 anos de idade, proveniente de atendimentos ambulatoriais (89,45%) e hospitalizados (10,55%). Foram detectadas 20 (9,17%) amostras positivas e observou-se uma tendência de sazonalidade das infecções no período da estação seca, no ano de 2008, fato que não se repetiu em 2009. A maioria das amostras positivas foi detectada em crianças na faixa de 0 a 36 meses e não houve correlação, estatisticamente significante, entre a ocorrência das infecções e o sexo. Das 20 amostras detectadas, 19 foram caracterizadas como NoV GII e 1 como NoV GI. O sequenciamento parcial do genoma e a análise filogenética das amostras selecionadas, revelou a presença de NoV dos genótipos GII.4 e GII.6, que cocircularam nos dois anos do estudo. As amostras NoV GII.4, detectadas em Juiz de Fora, apresentaram maior similaridade de nucleotídeos e de aminoácidos com aquelas que circularam no estado do Rio de Janeiro nos anos de 2006, 2007 e 2008. A análise filogenética das amostras NoV GII.6 detectadas em Juiz de Fora, associada à alta similaridade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos, mostrou que estas foram mais proximamente relacionadas com a amostra NoV GII.6 (GU132461/2007), detectada no estado do Rio de Janeiro em 2007, fatos que, aliados à proximidade geográfica de ambas as cidades, sugerem uma possível linhagem comum entre as mesmas. Este levantamento epidemiológico permitiu constatar a presença e circulação de NoV na população infantil de Juiz de Fora, MG, demonstrando sua importante participação como agente etiológico das diarreias agudas, também nesta comunidade / Noroviruses (NoV) are important etiological agents responsible for outbreaks and sporadic cases of acute diarrhea in individuals of all ages. The viral particles are nonenveloped with and the genome is composed of a positive single-stranded RNA. Norovirus belongs to the Caliciviridae family, Norovirus genus and are classified into five genogroups (GI-V), with GI, GII and GIV being found in human and among them, the NoV GII genotype 4 (GII.4) are the most commonly found worldwide. In Brazil, norovirus surveys are realized mainly in research institutes, carried out in the biggest centers and surroundings. Thus, considering the little knowledge about these viruses and the lack of epidemiological data on this viral infection in the Juiz de Fora city, MG state, it was performed this study, which aimed to detect and characterize the NoV samples, associated with sporadic cases of acute infantile diarrhea, as well as asses the influence of climatic and demographic factors in the occurrence of these infections. Between January 2008 to December 2009, 218 fecal specimens were analyzed for the presence of NoV by conventional RT-PCR, all obtained from children 0-12 years of age, from outpatient (89.45%) and inpatients (10.55%). We detected 20 (9.17%) positive samples and there was a tendency for seasonal infections during the dry season in 2008, a fact which was not repeated in 2009. The biggest number of positive samples were detected in children aged 0 to 24 months and there was no statistically significant correlation between the occurrence of infections and sex. Of the 20 samples detected, 19 were characterized as NoV GII and 1 as NoV GI. The partial genome sequencing and phylogenetic analysis of selected samples revealed the presence of NoV genotypes GII.4 and GII.6, which co-circulated in the two years of study. Samples NoV GII.4 detected in Juiz de Fora, showed greater similarity of nucleotides and aminoacids with those that circulated in the state of Rio de Janeiro during 2006, 2007 and 2008. Phylogenetic analysis of the samples GII.6 NoV, detected in Juiz de Fora, associated with the high similarity of nucleotide and amino acid sequences showed that they were most closely related to the sample GII.6 NoV (GU132461/2007) detected in the state of Rio de Janeiro in 2007. This fact associated with the geographical proximity of both cities, suggesting a possible common lineage between them. This epidemiological survey revealed the presence and circulation of NoV in the infantile population of Juiz de Fora, MG, demonstrating its important role as an etiologic agent of acute diarrhea, also in this community.

Organic nitrates, such as nitroglycerine (NTG), are widely used for their potent vasodilator capacity in the management of coronary artery disease and heart failure. Unfortunately, their beneficial effect is rapidly lost due to the development of nitrate tolerance, which is translated by an impaired vasorelaxation to NTG and an increased oxidative stress production. Although the mechanisms of the development of nitrate tolerance are still not fully elucidated, much interest has been focused in treating nitrate-receiving patients together with other drugs in order to overcome the development of nitrate tolerance. The Nitric Oxide generating enzyme, eNOS, and the superoxide anion generating enzyme, NAD(P)H oxidase, have been suggested to play a role in the development of nitrate tolerance. The aim of this study was to analyse the underlying mechanism by which ramipril, an ACE inhibitor and rosuvastatin, a new molecule of the statin class, are able to protect against the development of nitrate tolerance in the aortas isolated from rats, wild-type (wt) and eNOS-/- mice. <p>These results show that ramipril as well as rosuvastatin are able to protect against the development of nitrate tolerance in the wt and eNOS-/- mice aortas suggesting that eNOS is not necessary for their protective effect. The aortas from nitrate tolerant rats and mice showed a significant increase in the NAD(P)H oxidase activation compared to the aortas from the control and from the co-treated ramipril+NTG or rosuvastatin+NTG animals. In line with these findings were the results obtained by RT-PCR analysis: the mRNA expression of the different subunits of the NAD(P)H oxidase, such as gp91phox, p22phox, were significantly decreased after rosuvastatin or ramipril treatment in wt and eNOS-/- mice aortas. Apocynin, the NAD(P)H oxidase inhibitor was also able to inhibit the development of nitrate tolerance in the rat and mouse aortas. <p>In conclusion, these results suggest that rosuvastatin and ramipril are able to protect against the development of nitrate tolerance by counteracting the nitrate-induced oxidative stress. The mechanism of protection involves a direct interaction with the NAD(P)H oxidase pathway and seems to be completely independent of the eNOS pathway. <p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished