Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCLSP.pdf: 1835751 bytes, checksum: 94d92e1d4b14f4f8befcd6cb0b350de1 (MD5) Previous issue date: 2006-11-23 / Universidade Federal de Sao Carlos / Disintegrins are snake venom protein, of low molecular weight, rich in cysteines and RGDcontaining peptides that bind specifically to integrins αIIbβ3, α5β1, and αvβ3 expressed on platelets, endothelial and tumor cells. The biological effects of these peptides are related with biological process of cellular adhesion where receptors called integrins are presents. This dissertation describes the optimization of purification and additional characterization of a recombinant RGD-disintegrin of Bothrops alternatus, DisBa-01.. The DisBa-01 is a recombinant RGD-disintegrin, which interacts with αIIbβ3 integrin, inhibiting platelet aggregation and proliferation of endothelial and some tumor cells. In this work, a new protocol of purification was proposed for most efficient purification of the DisBa-01. The recombinant disintegrin, DisBa-01, was expressed in an optimizedbacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and purified by affinity chromatography. In this new protocol, the product of the purification in nickel column is submitted ion exchange chromatography. The use of the ion exchange chromatography as second step for purification increased the purity degree and the protein yield. The purified protein had its N-Terminal portion sequenced in 20 amino acids residues and its molecular mass determined by mass spectrometry. The mass spectrometry assay confirmed the mass of the DisBa-01 as 11.658 Da. The RGD-disintegrin pure had the tag of polihistidinas removed with thrombin. The cleavage of the tag of histidinas with thrombin was efficient. Polyclonal antibodies against DisBa-01 have also been produced in mice. The reactivity of these antibodies was observed through imunoblotting. These results provided one better form of obtain the pure protein as well as significant additional information for a better characterization of recombinant RGDdisintegrin, DisBa-01, which could be useful for the study of RGD-disintegrin, recombinant or native, and integrin. / Desintegrinas são proteínas de veneno de serpentes, de baixo peso molecular, ricas em cisteína e em geral um peptídeo contendo o motivo RGD que liga especificamente a integrinas αIIbβ3, α5β1, e αvβ3 de plaquetas, células endoteliais e células tumorais. Os efeitos biológicos desses peptídeos estão relacionados com processos biológicos de adesão celular onde receptores denominados integrinas estão presentes. Esta dissertação descreve a otimização da purificação de uma desintegrina-RGD recombinante de Bothrops alternatus, DisBa-01, e a caracterização adicional desta proteína. A DisBa-01 é uma desintegrina-RGD recombinante que interage com a integrina αIIbβ3 inibindo agregação plaquetária e proliferação de células endoteliais e algumas células tumorais. Neste trabalho, um novo protocolo de purificação foi proposto para a purificação mais eficiente da DisBa-01. A desintegrina, DisBa-01, foi expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3)pET28a+DisBa-01) e purificada em coluna de afinidade. Neste novo protocolo, o produto da purificação na coluna de níquel é submetido à cromatografia de troca-iônica. O uso da cromatografia de troca-iônica aumentou o grau de pureza e o produto protéico final. A proteína purificada teve o N-terminal seqüenciado em 20 resíduos de aminoácidos. A massa molecular foi determinada por espectrometria de massa que confirmou como 11.658 Da a massa da proteína. A desintegrina-RGD pura teve a cauda de polihistidinas eficientemente removida com proteólise com trombina. Anticorpos policlonais contra DisBa-01 foram produzidos em camundongos. A reatividade desses anticorpos foi observada através de imunoblotting. Estes resultados estabelecem uma nova forma de obtenção da proteína pura, assim como informações adicionais significativas de uma melhor caracterização da desintegrina-RGD recombinante, DisBa-01, que pode ser útil para o estudo de desintegrinas- RGD, recombinantes ou nativas, e interações com integrinas.

La recherche actuelle sur le cancer se tourne vers des « stratégies ciblées » afin de développer de nouvelles méthodes diagnostiques plus sensibles et performantes, ainsi que de nouvelles thérapies plus efficaces mais aussi mieux tolérées. Dans ce contexte, nos travaux sont consacrés à la conception de vecteurs synthétiques ciblant un récepteur cellulaire surexprimé par les tumeurs, l'intégrine alphaVbeta3. Ce ciblage permet de concentrer les drogues ou les éléments de détection au niveau tumoral. L'outil utilisé pour la construction chimique de nos vecteurs est un châssis décapeptidique cyclique RAFT (Regioselectively Addressable Functionalized Template) présentant deux domaines indépendants permettant de séparer les deux fonctions du vecteur. Sur un domaine, la fonction de ciblage est assurée par la présentation multivalente de ligands -RGD- spécifiques du récepteur. L'autre domaine du vecteur supporte les molécules d'intérêt à vectoriser : agents thérapeutiques pour limiter la prolifération du foyer malin ou agents de détection pour l'imagerie médicale.

Chapter One provides a general introduction into the biology and chemistry of nitric oxide, with particular focus on the role of nitric oxide in cardiovascular disease, cancer and hypoxia. It also details the types of organic functional groups used as nitric oxide donors, with detailed discussion of nitrate esters, furoxans and sydnonimines. Chapter Two discusses prostate cancer. It provides an overview into the development of prostate cancer, prostate cancer staging, and treatment. The key molecular aspects of prostate cancer are detailed, and the types of treatment available outlined. Chapter Three details the synthesis and activity of NCX-1102, a nitric oxide-donating analogue of the non-steroidal anti-inflammatory drug sulindac, and the synthetic work in the preparation of analogues of NCX-1102, using nitrate esters, furoxans and sydnonimines as nitric oxide-donating functional groups. The compounds prepared were tested against a prostate cancer cell line (PC3) and the cytotoxicity results are presented. Chapter Four describes the synthesis of nitric-oxide donating analogues of abiraterone, a CYP17 inhibitor for the treatment of prostate cancer. The results of cytotoxicity assays against PC3 cells are detailed. Chapter Five discusses the application of nitric oxide-donating functional groups in tandem with biologically active motifs. The synthesis of nitric oxide-donating amino acids, and their application to the preparation of nitric oxide-donating RGD peptides and prostate-specific membrane antigen inhibitors is presented, along with representative biological evaluation. Chapter Six introduces possible future work for the continuation of the project, suggesting the synthesis of fluorinated sydnonimines, prostate-specific membrane antigen inhibitors combined with for prostate cancer imaging and a “tool-box” of nitric oxide-donating bioconjugation reagents.

A cerebral aneurysm is a weakened area of an artery in the brain, creating an abnormal expansion. Recent research for treatment is utilizing a photopolymerizable hydrogel as a possible operation for injection in situ. This paper aimed to achieve bioconjugation of peptides on a PEGDMA polymer network (using the photoinitiator PEG-BAPO) to form a biocompatible photopolymerizable hydrogel, without compromise to any of its mechanical attributes. Achieving cell adhesion to the hydrogel surface is a critical requirement as that could drive the growth of endothelium between aneurysm and artery, to considerably enhance its sustainability and decrease the risk of inflammation. The hydrogel was synthesized by functionalizing RGD with a PEG-spacer and co-polymerize it with PEGDMA using UV-radiation to create an intertwined cross-linking network. Samples of various peptide concentrations were studied in cell culture to analyze cell adhesion, followed by mechanical tests to identify possible deviations. A subsequent study was established to create a dynamic prototype as a quantifiable replication of a hydrogel inside an aneurysm in vivo. The model was designed in SolidWorks and connected with an Ibidi sticky-Slide to roughly replicate a cerebral aneurysm connected to an artery with space to introduce a hydrogel sample.

Plant viruses have been instrumental in our understanding of the biophysical properties pertaining to non-enveloped icosahedral virus particles. A substantial amount of research has been performed over five decades on Turnip yellow mosaic virus (TYMV), arguably one of the most extensively studied icosahedral plant viruses and the type-member of the Tymovirus plant virus genus. Even with a substantial body of published scientific literature, little is known about the role of specific coat protein (CP) residues in TYMV assembly, disassembly and disencapsidation. We have shown through our mutagenesis studies that the N-terminal region of the CP that is involved in the formation of an annulus structure and is disordered in A-subunit pentamers is not essential in vivo, but annulus-forming residues are critical in ensuring virion stability and low accessibility after virus is purified (Chapter 2). We have shown that a range of amino acid residue types is tolerated within the CP N-terminus in vivo, although they can greatly affect the stability of virions and empty particles, most notably at low pH (Chapter 3). Unlike full-length CP, N-terminal deletion and substitution mutants fail to reassemble into particles in vitro (Chapter 2, 3) suggesting a critical determinant for the N-terminus in reassembly (discussed Chapter 7). This is the first documented in vitro reassembly reported for a member of the Tymoviridae family and should provide a framework for further studies. We have identified a new way to create empty artificial top component (ATC)-particles through treatment with EDTA (Chapter 6) and we also show that tymoviruses can be engineered with altered pH-dependent enhanced stability (Chapter 4). In collaboration with the Qian Wang laboratory from the University of South Carolina we have shown that an RGD (Arg-Gly-Asp) motif can be genetically engineered within the CP of TYMV, resulting in infectious particles with attractive stem-cell adhesion properties (Chapter 5). With focus on basic viral mechanisms, we have crystallized the TYMV virion and ATC particle at pH 7.7 and collected data to less than 5 Å resolution (Chapter 4, supplementary). These structures represent the first tymovirus-based structures solved above pH 5.5 and will provide insight into the N-terminal conformations within the TYMV particle. Finally, we have characterized an N-terminal CP cleavage seen after ATC formation (Chapter 4) suggesting an additional and yet uncharacterized feature associated with decapsidation. / Graduation date: 2012

Ce travail décrit une étude quantitative de plusieurs systèmes de reconnaissance biomoléculaire impliquant des interactions multivalentes.<br />Deux chapitres sont axés sur l'utilisation de plateformes supramoléculaires cyclodécapeptidiques appelées RAFT (Regioselectively Adressable Functionnalized Template) permettant la présentation multiple de ligand saccharidique ou cyclopeptidique. Une étude cinétique et thermodynamique des interactions entre les ligands RAFT-saccharide et une lectine modèle, la concanavaline A, a permis de démontrer que deux mécanismes moléculaires sont à l'origine de la meilleure affinité des RAFT multivalents par rapport à leurs homologues monovalents : d'une part un effet de « proximité-statistique » dû à la concentration locale élevée en motif sucre et d'autre part la capacité des RAFT multivalents à se lier à plusieurs lectines selon un effet « cluster ». Des études préliminaires ont également concerné l'analyse de l'interaction entre RAFT-RGD et des récepteurs cellulaires.<br />Dans un dernier chapitre, nous avons démontré, pour la première fois, la formation de films multicouches grâce à des interactions de type hôte-invité entre deux biopolymères de chitosane, l'un fonctionnalisés par des cavités Β-cyclodextrine et l'autre par des entités adamantane. Bien que la stabilité de l'assemblage soit assurée par des interactions de complexation multivalentes, la croissance de l'assemblage, quant à elle, dépend de la disponibilité des sites de complexation offerts par chacune des couches. De plus, les deux polymères chargés positivement confèrent à l'assemblage des propriétés de gonflement-dégonflement en réponse à des variations de force ionique et pH.

This thesis deals with the design of 18F- and 68Ga-labelled positron emission tomography (PET) tracers and the development of technologies that enable faster and simpler preparation with high specific radioactivity. Techniques like microwave heating and reducing the concentrations of the precursor were investigated with this perspective. A few applications were explored using molecular design perspectives. A nucleophilic 18F-labelling strategy using perfluoro-containing leaving groups was explored. We observed that [18F]fluoride was interacting with the perfluoro alkyl chains of the substrate, preventing the nucleophilic substitution from taking place. When a perfluoroaryl group was instead used in the leaving group, the substitution took place and purification by fluorous solid-phase extraction was possible. 18F-Labelled analogues of the monoamine oxidase-A inhibitor harmine were prepared by one-step nucleophilic fluorinations and evaluated by in vitro autoradiography, showing high specific binding. Biotin analogues labelled with 18F and 68Ga were prepared and their binding to avidin evaluated. All analogues retained their binding ability and will be further evaluated in transplantation models with avidin-coated islets of Langerhans. Peptide design perspectives were used in some examples where the Arg-Gly-Asp (RGD) sequence and a single-chain version of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein functionalized with 2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetic acid (DOTA) or 2,2',2''-(1,4,7-triazonane-1,4,7-triyl)triacetic acid (NOTA) as chelators were labelled with 68Ga. The RGD motif and VEGF have high affinity for, respectively, αvβ3 integrin and VEGFR-2 receptor that are overexpressed in angiogenesis process. The 68Ga-labelled scVEGF maintained its functional activity in vitro. A polypeptide conjugate containing phosphocholine, which has affinity for the C-reactive protein released during the inflammatory process, was labelled with 68Ga for the development of an imaging agent for inflammation in vivo. Finally [18F]/19F exchange in fluorine-containing compounds was studied in order to investigate whether the exchange reaction can be of practical use for labelling.

Actuellement, la chirurgie représente la première indication pour la thérapie du cancer. Néanmoins, la résection complète du tissu tumoral, la détection des micrométastases et la préservation des tissus sains pendant l'intervention représentent un enjeu majeur et influencent fortement le pronostic du patient. Les récents développements technologiques en imagerie pour la chirurgie guidée des cancers ont conduit à des résultats précliniques prometteurs et les premiers essais cliniques utilisant des traceurs non-spécifiques confirment déjà le potentiel de ces systèmes pour l'amélioration de la chirurgie. De plus, le diagnostic précoce des tumeurs, ainsi que le développement de thérapies ciblées sont également des axes majeurs de recherche en cancérologie. Dans ce contexte notre équipe a précédemment développé un vecteur synthétique ciblant un récepteur cellulaire l'intégrine αVβ3. Ce vecteur est constitué d'un châssis décapeptidique cyclique RAFT (Regioselectively Addressable Functionalized Template) et présentant deux domaines indépendants permettant de séparer les deux fonctions du vecteur. Sur un domaine, la fonction de ciblage est assurée par la présentation multivalente de ligands -RGD- spécifiques du récepteur. L'autre domaine du vecteur porte les molécules d'intérêt à vectoriser, agents thérapeutiques ou de détection pour l'imagerie médicale. Dans la première partie de ces travaux, nous avons évalué la combinaison de ce vecteur couplé à un fluorophore avec une sonde portative pour imager et guider le chirurgien pendant la chirurgie des fibrosarcomes spontanés chez le chat. Cette étude représente une preuve de concept pour la translation clinique chez l'homme. Les résultats ont montré que l'injection du traceur ne provoquait pas d'effets toxiques chez le chat et permettait un marquage spécifique de la tumeur avec un bon ratio tumeur/tissu sain, qui devrait améliorer la qualité de la résection tumorale en aidant le chirurgien à mieux délimiter les marges du tissu tumoral. Dans la seconde partie de ces travaux nous avons développé un nouveau vecteur bi-fonctionnel dérivé du RAFT-RGD. Au composé d'origine a été ajoutée une séquence peptidique clivable par la matrixmetalloprotease-9, une enzyme surexprimée dans la tumorigénèse. Cette molécule à fluorescence activable a montré une amélioration du ciblage tumoral in vitro et in vivo comparée au RAFT-RGD suggérant un effet additionnel lié au double ciblage. Ces résultats préliminaires encouragent la poursuite de sa caractérisation pour son potentiel de " pro-drug " mais également pour l'étude des interactions entre l'intégrine et l'environment tumoraux.

Le RAFT-RGD radiomarqué avec un émetteur β- comme nouvel agent de radiothérapie interne vectorisée. L'intégrine αvβ3 est fortement impliquée en oncogenèse à travers son rôle dans la néoangiogenèse tumorale, dans la prolifération et la survie des cellules cancéreuses et dans le processus métastatique. L'intégrine αvβ3 est exprimée faiblement dans la plupart des tissus. Par contre, elle est fortement exprimée par les cellules endothéliales activées lors de l'angiogenèse et par les cellules de nombreux types de cancers invasifs. Ces caractéristiques font de l'intégrine αvβ3 une excellente cible pour l'imagerie et la thérapie de ces tumeurs. Le RAFT-RGD (Regioselectively Addressable Functionalized Template-(cyclo-[RGDfK])4) est un derivé polypeptidique constitué de quatre peptides cyclo-RGD (spécifiques de l'intégrine αvβ3) fixés sur un groupe porteur RAFT. Le RAFT-RGD cible spécifiquement l'intégrine αvβ3 in vitro et in vivo et permet la détection par imagerie nucléaire ou par fluorescence de tumeurs exprimant αvβ3 sur des modèles précliniques. Le RAFT-RGD un excellent vecteur potentiel pour cibler les tumeurs exprimant αvβ3 et pour y délivrer des traitements, que ce soit des molécules de chimiothérapie ou des radionucléides de thérapie. Cette étude est la première à évaluer le potentiel thérapeutique du RAFT-RGD radiomarqué avec un émetteur β- sur un modèle de souris Nude porteuses de tumeurs exprimant l'intégrine αvβ3. Une injection de 37 MBq de 90Y-RAFT-RGD ou de 177Lu-RAFT-RGD permet de ralentir significativement la croissance de tumeurs exprimant l'intégrine αvβ3 par rapport aux souris contrôles non traitées ou traitées avec la même activité de la molécule de contrôle non spécifique de la cible, le RAFT-RAD. En comparaison, une injection de 30 MBq de 90Y-RAFT-RGD ne permet pas de ralentir la croissance de tumeurs n'exprimant pas l'intégrine αvβ3. Le RAFT-RGD présente un bon potentiel pour le traitement de tumeurs exprimant l'intégrine αvβ3 lorsqu'il est radiomarqué avec des émetteurs β-. Mots clés : intégrine αvβ3, RAFT-RGD, ciblage tumoral, radiothérapie interne vectorisée.

La thrombose est le plus important processus pathologique sous-jacent à de nombreuses maladies cardiovasculaires, qui sont responsables d’une mortalité élevée dans le monde entier. Dans cette thèse, la conception assistée par ordinateur de nouveaux agents antithrombotiques capables d’inhiber deux types de récepteurs situés à la surface des plaquettes a été appliquée. Le premier - αIIbβ3 - est responsable de l’interaction des plaquettes activées avec le fibrinogène pour former des caillots, tandis que le second – le thromboxane A2 – est responsable de l’activation des plaquettes par l’un des agonistes excrétés par les plaquettes activées. Afin d’atteindre cet objectif, différents types de modèles ont été développés en utilisant les informations expérimentales disponibles et la structure des complexes protéine-ligand, comprenant des modèles QSAR, des pharmacophores 3D basés sur la structure de la protéine ou du ligand, des pharmacophores 2D, des modèles basés sur la forme et sur le champ moléculaire. L’ensemble des modèles développés ont été utilisés en criblage virtuel. Cette étude a abouti sur la suggestion de nouveaux antagonistes potentiels des récepteurs αIIbβ3 et thromboxane A2. Les antagonistes de αIIbβ3 suggérés pouvant se lier soit à la forme ouverte soit à la forme fermée du récepteur ont été synthétisés et testés expérimentalement. L’expérience montre qu’ils font preuve d’une forte activité; de plus, certains des composés conçus théoriquement sont plus efficaces que le Tirofiban, qui est un médicament commercialisé. Les antagonistes recommandés du récepteur thromboxane A2 ont déjà été synthétisés mais les tests biologiques n’ont pas encore été complétés. / Thrombosis is the most important pathological process underlying many cardiovascular diseases, which are responsible for high mortality worldwide. In this theses the computer-aided design of new anti-thrombotic agents able to inhibit two types of receptors located on the surface of the platelets has been applied. The first one - αIIbβ3 - is responsible for the interaction of activated platelets with fibrinogen to form clots, whereas the second one - thromboxane A2 - is responsible for platelet activation by one of agonists excreted by activated platelets. To achieve this, different types of models have been developed using experimentally available information and structure of protein-ligand complexes. This concerns: QSAR models, structure-based and ligand-based 3D pharmacophore models, 2D pharmacophore models, shape-based and molecular field-based models. The ensemble of the developed models were used in virtual screening. This study resulted in suggestion of new potential antagonists of αIIbβ3 and thromboxane A2 receptors. Suggested antagonists of αIIbβ3 able to bind either open or closed form of the receptor have been synthesized and tested experimentally. Experiments show that they display high activity; moreover some of theoretically designed compounds are more efficient than Tirofiban – the commercialized drug molecule. The recommended antagonists of thromboxane A2 receptor have been already synthesized but biological tests have not been completed yet.