Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:03:27Z : No. of bitstreams: 1 jardim_acg_dr_sjrp.pdf: 1650863 bytes, checksum: 6ecdc00802358d3e90fac9c3024108d4 (MD5) / A composição de quasiespécies do vírus da Hepatite C (HCV) pode ter implicações importantes com relação à persistência viral e à resposta a terapia baseada em Interferon. A região NS5A completa foi analisada para avaliar se a composição de quasiespécies do HCV 1a/1b está relacionada à resposta ao tratamento combinado de interferon peguilado (PEGIFN) e ribavirina. Seiscentos e noventa seqüências correspondentes a região não estrutural 5A (NS5A) completa foram geradas a partir de amostras coletadas antes, durante a após a administração da terapia de pacientes respondedores, não respondedores e respondedores ao final do tratamento. Este estudo apresenta evidências de que a homogeneidade da composição de quasiespécies, e a baixa complexidade e diversidade da região NS5A em amostras préterapia estão associados à resposta virológica sustentada. Portanto, a alta diversidade e complexidade de quasiespécies podem fornecer ao vírus melhores oportunidades de evadir a terapia antiviral. Análises filogenéticas não demonstraram o agrupamento das seqüências de acordo os padrões específicos de resposta ao tratamento. Contudo, o agrupamento distinto de seqüências pré e pós-terapia foi observado, sugerindo que um processo adaptativo ocorreu durante o período analisado. Adicionalmente, a dinâmica evolutiva da composição de quasiespécies demonstrou estar sob pressão seletiva purificadora ou purificadora relaxada, o que é condizente com a população de quasiespécies diversificada no pré-terapia, seguida de um aumento em freqüência de quasiespécies predominantes nas amostras pós-tratamento, provavelmente devido a conferirem alguma vantagem ao vírus. Estes resultados sugerem que a diversidade de quasiespécies da região NS5A pode ser importante para o entendimento dos mecanismos de baixa resposta virológica sustentada em pacientes com Hepatite C crônica / The quasispecies composition of Hepatitis C virus (HCV) could have important implications with regard to viral persistence and response to interferon-based therapy. The complete NS5A was analyzed to evaluate whether the composition of NS5A quasispecies of HCV 1a/1b is related to responsiveness to combined interferon pegylated (PEG-IFN) and ribavirin therapy. Six hundred and ninety full-length NS5A sequences were generated from samples collected before, during and after treatment from virological sustained responder, non-responder and the end-of-treatment responder patients. This study provides evidence that homogeneity of quasispecies composition, low diversity and less complexity of the NS5A region pre-therapy are associated with viral clearance. Therefore, higher diversity and complexity of quasispecies could offer the virus a better opportunity of evading anti-viral therapy. Phylogenetic relationships concerning complete NS5A sequences obtained from patients did not demonstrate clustering associated with specific response patterns. However, distinctive clustering of pre/post-therapy sequences was observed, suggesting that an evolutionary process occurred during the time course examined. In addition, the evolution of quasispecies over time was subjected to purifying or relaxed purifying selection. This could explain the initial diversified composition of quasispecies at baseline, followed by an increase in the frequency of a predominant quasispecies in ‘after treatment’ samples of non-responders and end-of-treatment responders, probably because it offers some advantage for the virus. These results suggest that quasispecies diversity of the NS5A region could be important for elucidating the mechanism underlying treatment failure in patients infected with chronic hepatitis C

Orientadores: Fernando Lopes Gonçales Junior, Neiva Sellan Lopes Lopes Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corghi_DanielaBrambila_M.pdf: 459057 bytes, checksum: 1b987bc8d3a81c9e46ae85afcfc30e75 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A hepatite pelo vírus C (HVC) é uma doença amplamente disseminada e de curso geralmente insidioso. Considera-se que 50 a 80% dos indivíduos com HVC aguda evoluirão para cronicidade. Cerca de 50% vão necessitar tratamento específico com algum tipo de interferon combinado, ou não, à ribavirina. O principal objetivo do tratamento da HVC crônica é obter-se uma resposta virológica sustentada (RVS). O interesse no estudo da hepatite C e alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) se deve ao fato de o Sistema HLA apresentar associação com várias patologias. Foram estudados 102 pacientes etnicamente miscigenados, não-aparentados, infectados pelo vírus da hepatite C (VHC), com anti-HIV e HBsAg negativos atendidos no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Foi possível determinar o genótipo do VHC em 98 indivíduos e realizou-se a biópsia hepática em 83 pacientes. A genotipagem dos alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) foi realizada nos 102 pacientes pela técnica de PCR-SSP de baixa resolução. Os 102 pacientes foram tratados com IFN isolado ou associado à ribavirina ou PEG-IFN associado à ribavirina por 6 ou 12 meses de acordo com o genótipo do VHC. Destes 102, 51% dos pacientes apresentaram RVS ao tratamento. Correlacionando-se a presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 com o genótipo do VHC e resposta virológica observou-se associação entre menor porcentual de RVS com a presença dos alelos HLA-DQB1*03 e HLA-DQB1*06 em pacientes infectados pelo genótipo 3. Observou-se associação entre a presença do alelo HLA-DRB1*04 e maior freqüência de cirrose hepática nos pacientes com HVC crônica. Encontrou-se uma freqüência 2,7 vezes maior do alelo HLA-DRB1*07 nos indivíduos infectados pelo VHC do que na população geral. Observamos associação estatisticamente significante entre a presença do alelo HLA-DQB1*02 e infecção pelo VHC quando comparado ao grupo controle. Houve concomitância da presença dos alelos HLA-DRB1*13 e HLA-DQB1*02 nos pacientes que não apresentaram RVS. Não encontramos associação entre presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 quando comparamos pacientes com RVS e pacientes sem RVS. Este trabalho permitiu estabelecer relações entre o Sistema HLA e a hepatite C em pacientes brasileiros / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) infection becomes chronic in most cases, with only 10-20% of those infected not developing persistent viraemia. The knowledge of host factors that influence the course of the disease is still limited. The immune response to HCV may be an important determinant of disease resolution and can be influence by a number of host factors. We investigated the distribution of HLA class II alleles in patients with chronic hepatitis C using a low-resolution PCR-sequence-specific-primer method to assess whether MHC class II alleles are associated with HCV infection and with their response to interferon therapy. One hundred and two unrelated white Brazilian patients with confirmed chronic HCV infection were included in this study. Fifty-two patients with sustained viral response after therapy (responder) and 50 patients without sustained viral response (non-responder) after completion of therapy were included in this study. The HLA-DRB1*07 allele was significantly more frequent in chronic hepatitis C patients than in controls. The higher frequencies of HLA-DRB1*13 and HLA-DQB1*02 in these patients were not significantly different after P correction. There was no significant difference between the phenotype frequencies of HLA-DRB1 and HLA-DQB1 alleles in responder with non-responder patients. We found that HLA-DRB1*07 is associated with chronic HCV infection / Mestrado / Mestre em Farmacologia

La Ribavirine est un analogue nucléosidique de la guanosine constitué d'un ribose et d'un noyau triazole. Cet antiviral, synthétisé en 1970, possède une activité contre différents virus comme le virus respiratoire syncytial chez les enfants en détresse respiratoire, les virus des hépatites B et E, ainsi que contre certains cancers et leucémies. Elle est surtout connue pour son utilisation dans le traitement de l'hépatite C, en combinaison avec l'Interféron. Cependant, l'efficacité de cette thérapie est limitée à certains génotypes du virus et les effets secondaires résultants sont nombreux. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver d'autres analogues actifs contre l'hépatite C et moins toxiques afin d'offrir un traitement aux 170 millions d'individus atteints de cette maladie chronique et pouvant évoluer vers des cirrhoses et des cancers du foie. Par une méthodologie d'alcynylglycosylation médiée à l'indium suivie d'une cycloaddition 1,3 dipolaire, des C-nucléosides analogues de la Ribavirine ont été synthétisés. L'un deux, SRO-91, a montré une activité antivirale comparable à celle de la Ribavirine vis-à-vis de l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C. L'objectif de cette thèse est donc de synthétiser d'autres C-nucléosides analogues sur le modèle de SRO-91. Des modifications ont été effectuées autant sur le ribose que sur le noyau triazole. Concernant les transformations du ribose, nous nous sommes intéressés à la position C2', notamment en introduisant une quaternisation avec différents groupements (CH3, CF3, F …) ou bien en désoxygénant cette position. Cette thèse décrit les différentes stratégies explorées pour la synthèse de plusieurs de ces C-nucléosides dont les activités antivirales seront étudiées ultérieurement. / Ribavirin is a nucleosidic analogue of guanosine composed of a ribose and a triazole ring. This antiviral compound, synthesized in 1970, exhibits an activity against a broad-range of viruses such as respiratory syncytial virus in respiratory distress children, hepatitis B and E viruses as well as some cancers and leukemia. It is especially known for its use in hepatitis C treatment in combination with Interferon. However, the efficiency of this therapy is limited to a few genotypes of the virus and leads to numerous side effects. Therefore, finding new efficient and less toxic analogs is necessary to treat the 170 million individuals that are chronically infected and at risk of developing cirrhosis and liver cancer. Thanks to a methodology of indium mediated alcynylglycosylation followed by a 1,3-dipolar cycloaddition, C-nucleosides analogs of Ribavirin have been synthesized. Among them, SRO-91, showed a comparable activity to Ribavirin towards hepatitis C virus ARN polymerase. This thesis' objective is to synthesize other C-nucleosides analogs based on SRO-91 model. Modifications have been made on the triazole ring as well as on the ribose. In regards to the ribose transformations, we have been interested into the C2' position, in particular by introducing a quaternisation with different moieties (CH3, CF3, F …) or by deoxygenating this position. This thesis describes the different strategies explored for the synthesis of some of these C-nucleosides whose antiviral activities will be studied later.

Empreintes moléculaires pour la libération contrôlée des analogues de nucléosides : la ribavirine pour le traitement du virus Influenza A par voie pulmonaire et l’adénosine-5’-monophosphate.Nous nous sommes concentrés dans un premier lieu au développement de différentes formulations de MIPs enbulk sous forme hydrogels afin de mettre en place des systèmes de libération contrôlée de la ribavirine sous différents stimuli. Ensuite, nous nous sommes basés sur l’approche de « Dummy-template » en utilisant la 2’,3’,5’-tri-O-acétylribavirine afin de diminuer la polarité de la ribavirine et ainsi accéder à differents solvants aprotique pour mieux stabiliser le complexe de pré-polymèrisation. Cette étude a été faite en utilisant de nouveaux monomères synthétisés au sein du laboratoire et en les comparants avec un monomère commercial tel que l’acide méthacrylique. Ces différents MIPs ont montré des différences d’adsorption vis à vis de la ribavirine mais aussi des profils et des cinétiques de relargage différents et dépendant du milieu de libération ou de la température.Dans un deuxième temps, nous avons transposé certaines formulations utilisant la 2’,3’,5’-tri-O-acétyl-ribavirine comme molécule template vers la synthèse de billes imprimées. Les MIPs sphériques obtenus ont permis d’avoir la géométrie et le diamètre recherchés pour être administrés par voie pulmonaire. L’incorporation de différents co-monomères ont permis de modifier l’architecture de ces billes en les rendant thermosensibles ou fluorescentes.Finalement, nous avons, cette fois, synthétisé des polymères imprimés pour la libération contrôlée de l’adénosine-5’-monophosphate. Dans cette étude, nous avons étudié la libération à partir de la forme sphérique obtenue par polymérisation en émulsion de pickering inverse. / This thesis report presents the synthesis of new polymeric cargos associated with molecular imprinting technology for the controlled release of nucleoside analogs: ribavirin for the treatment of pulmonary influenza A and adenosine 5'-monophosphate.At first, we focused on the development of different formulations of bulk MIPs in hydrogel form with the aim of setting up controlled release systems for ribavirin under different stimuli. Then, we carried out a "Dummy-template"approach using 2 ', 3', 5'-tri-O-acetyl-ribavirin in order to reduce the polarity of ribavirin so that we could explore different aprotic solvents to better stabilize the pre-polymerization complex. This study was accomplished by the use of new monomers synthesized within the laboratory and by comparing them with a commercial monomer such as methacrylic acid.These different MIPs showed differences in adsorption with respect to ribavirin but also different release profiles and kinetics depending on the release medium or the temperature.Secondly, we transposed the best formulations using 2 ', 3', 5'-tri-O-acetyl-ribavirin as template molecule towards the synthesis of imprinted beads. The spherical MIPs obtained showed desired geometry and diameter to be administeredby the pulmonary route. The incorporation of various co-monomers allowed to modify the architecture of these beads bymaking them thermosensitive or fluorescent.Lastly, this time, we have synthesized imprinted polymers for the controlled release of adenosine-5'-monophosphate. In this part, we studied the release from the spherical shape obtained by inverse Pickering emulsion polymerization.

No description available.

A presente investigação teve por objetivo estudar o papel do eixo GH-IGF-IGFBP no tecido hepático e nos linfócitos T e B de pacientes portadores do vírus da hepatite C, em terapia com INF-alfa e ribavirina nos períodos pré e pós-tratamento. Dados da literatura têm evidenciado o envolvimento do IGF-I na modulação da resposta imune, bem como sua atuação como fator de crescimento para células imunológicas, além de apresentar valor preditivo na avaliação da reserva hepática desses pacientes. O número final de pacientes abordados perfez o total de 80. Destes, 39 iniciaram tratamento conforme protocolo estabelecido pela equipe clínica. Quatro pacientes foram excluídos durante o curso do tratamento, sendo 2 por óbito e 2 por transtorno depressivo grave com ideação suicida. Dos 35 pacientes que concluíram o tratamento, 18 apresentaram resposta virológica ao final do tratamento. Destes, 15 pacientes (43%) obtiveram resposta virológica sustentada (RVS). As médias das U.A. (unidades arbitrárias) das enzimas AST e ALT foram estatisticamente diferentes entre os períodos pré e pós-tratamento, tanto para os pacientes que apresentaram RVS quanto para aqueles que não apresentaram tal resposta. No grupo de pacientes com RVS, observou-se que a média dos níveis basais de AST foi menor quando comparada à do grupo de pacientes sem RVS. A média das concentrações plasmáticas basais de IGF-I livre no grupo de pacientes com RVS foi estatisticamente maior quando comparada à do grupo de pacientes não respondedores. As médias das concentrações de IGFBP3 circulante no período pós-tratamento foram estatisticamente diferentes entre os grupos com e sem RVS. Um aumento do conteúdo de mRNA do gene do IGF-IR foi observado em tecido hepático de todos os pacientes com HCC quando comparado com o tecido hepático normal. Este resultado foi confirmado por análise imuno-histoquímica para o IGF-IR. Nos pacientes que apresentaram RVS a magnitude de expressão de mRNA do IGF-IR em amostras de tecido hepático após o tratamento foram estatisticamente menores em relação ao basal. Tal fato não foi observado no grupo de pacientes não respondedores. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a média do conteúdo de mRNA do IGF-I em tecido hepático dos grupos de pacientes com e sem RVS, pré ou pós-tratamento. A média do conteúdo de mRNA do IGF-I em linfócitos T no grupo de pacientes com RVS foi estatisticamente maior em relação à do grupo de pacientes não respondedores quando se consideram os períodos pré e pós-tratamento conjuntamente. Não se observou diferença estatisticamente significativa entre as médias do conteúdo de mRNA do IGF-IR nos grupos com e sem RVS, pré ou pós-tratamento. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias do conteúdo de mRNA de IGF-I e IGF-IR em linfócitos B de pacientes portadores do VHC, com e sem RVS e nos períodos pré e pós-tratamento. A diminuição de expressão de mRNA do IGF-IR em tecido hepático, observada no grupo de pacientes com RVS, sugere uma melhora da doença hepática. A hipótese de que um efeito do INF-? sobre os componentes do sistema IGF possa contribuir para este achado não pode ser descartada, porém, é provável que este efeito não seja tão importante, pois não se observou diferença nos níveis de expressão do IGF-IR hepático no grupo de pacientes não respondedores. Embora a supra-regulação (\"up-regulation\") do IGF-IR possa participar da regeneração hepática, é preciso elucidar se o aumento da expressão do IGF-IR na HCC resulta da ativação direta do gene pelo VHC ou se é uma conseqüência da agressão ao parênquima. As concentrações plasmáticas de IGF-I livre >1,35 ng/mL puderam ser consideradas preditivas da resposta ao tratamento da hepatite C com uma razão de probabilidade (\"odds ratio\") de 17,33±1,02 (Limite de confiança: 2,26-127,34) / The current investigation aimed to study the role of the GH-IGF-IGFBP axis in liver tissue and in T and B lymphocytes in patients with hepatitis C virus (HCV) before and after therapeutic regimen based on interferon alfa-2a or alfa-2b (3 million U SC 3x/wk) and ribavirin (1000-1200 mg qid). It has been shown that IGF-I plays an important role in the modulation of the immune response, besides its role as a growth factor for the immunologic cells. It also presents a predictive value in the evaluation of the hepatic reserve of these patients. Among 80 patients enrolled for this investigation, 39 began treatment with interferon-? and ribavirin, according to an established protocol. Two patients were excluded during treatment due to severe depressive disorders accompanied by suicidal thoughts and 2 patients died. Of the 35 patients who concluded the treatment, 18 eventually presented virological response. Of these, 15 (43%) maintained sustained virological response (SVR). The levels of AST and ALT enzymes in both pre and post-treatment periods were statistically different for both patients with SVR and those who did not present such response. In the group with SVR, aminotransferases basal levels were statistically lower when compared to the group of patients without SVR. In the group of non-responsive patients, the average of the scores of parenchyma activity was statistically lower in post-treatment period when compared to pre-treatment period. Furthermore, comparing post-treatment periods in both groups with and without SVR, the average of the scores of parenchyma activity was statistically lower in the group without SVR when compared to the group with SVR. Mean plasma concentrations of free IGF-I before treatment in patients who eventually achieved SVR was statistically higher in comparison to the group of non-responsive patients. Mean plasma concentrations of IGFBP3 were statistically higher in the group with RVS when compared to the group of patients without SVR. An increase of IGF-IR mRNA content was observed in hepatic tissue from all patients with CHC in comparison to normal liver. These results were confirmed by immunohistochemical analysis for the IGF-IR. IGF-IR mRNA content in liver tissue samples from patients who achieved SVR after treatment was statistically lower than that observed before treatment There was not statistical difference between IGF-I mRNA content in hepatic tissues from both groups of patients with and without SVR, in pre and post-treatment periods. IGF-I mRNA expression in T lymphocytes from patients with SVR was statistically higher in comparison to the non-responsive group of patients, considering both pre and post-treatment periods altogether. No statistical difference was observed in IGF-IR mRNA expression in both groups of patients with and without SVR, in pre and post-treatment periods. The statistical analysis did not disclose any statistically significant differences in IGF-I or IGF-IR mRNA expressions in B lymphocytes from patients with or without SVR, in pre and post-treatment periods. A decrease in hepatic IGF-IR mRNA content observed in patients who achieved SVR after therapy, suggested an improvement in hepatic damage. The hypothesis that the INF-? affects components of the IGF system contributing to these findings could not be discarded. However, it is unlike that these effects would play relevant role because any differences were observed in the hepatic IGF-IR mRNA expression in non-responsive patients. It remains to be elucidated whether IGF-IR up-regulation would be involved in hepatocyte regeneration or CHC would result from direct activation of IGF-IR gene by HCV and/or as a consequence of chronic aggression to hepatic parenchyma. Plasma concentration of free IGF-I >1.35 ng/ml was considered to be a predictive response to the treatment of hepatitis C with a probability ratio (odds ratio) of 17.33±1.02 (confidence interval: 2.26 -127.34)

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Pacientes com Hepatite C frequentemente tendem a produzir autoanticorpos. No teste fator antinúcleo em células HEp-2 (ANA-HEp-20), esses autoanticorpos geram diversos padrões de imunofluorescência, sendo o nuclear pontilhado fino o mais frequente deles. Recentemente, tem sido descrito um novo padrão de ANA-HEp-2 em pacientes com HCV, denominado padrão Rods e Rings (R&R), caracterizado por anéis e bastões. Objetivos: Avaliar as características clínicas, virológicas e padrão de resposta terapêutica dos pacientes que apresentam autoanticorpos que geram o padrão R&R, bem como proceder a uma avaliação preliminar dos aspectos celulares e moleculares desse novo sistema de autoantígenos. Métodos: Amostras de soro coletadas de 1998 até 2008 de 597 pacientes foram submetidas ao teste de ANA-HEp-2 em lâminas Euroimmun ou INOVA e classificados como R&R positivos quando apresentaram fluorescência sob forma de bastões de 3 a 10μm de comprimento e anéis de 2 a 5μm de diâmetro no citoplasma das células HEp-2. Entre os pacientes testados, 342 tinham HCV e 200 tinham outras doenças hepáticas crônicas ou autoimunes reumáticas, além de 55 pacientes co-infectados com HCV+HIV. As informações clínicas, virológicas e terapêuticas foram coletadas de bancos de dados atrelados às amostras de soro dos pacientes. Células HEp-2, 3T3 e MH22A foram cultivadas normalmente e/ou submetidas à tratamentos in vitro (tripsina e ribavirina) e com dois métodos alternativos de fixação, para estudo das estruturas do R&R por imunofluorescência indireta simples ou com técnicas de dupla-marcação com amostras R&R-positivas e anticorpos antitubulina-alfa e anti-CTP-sintase. Resultados: Dos 342 pacientes com HCV, 51 (15%) apresentaram o padrão R&R, enquanto que dos 200 pacientes com outras doenças hepáticas ou autoimunes, apenas um apresentou o padrão R&R (p<0.0001). Dos pacientes com HCV, 174 eram tratados e 168 não tratados. Dos 174 tratados, 49 (28%) apresentaram o padrão R&R contra apenas dois (1%) dos não tratados (p<0.0001). De 134 tratados e com informação adequada sobre a medicação utilizada, 108 tomavam interferon-α e ribavirina e 23 tomavam apenas interferon-α. Quarenta e um (38%) dos 103 que tomavam interferon-α e ribavirina apresentaram o padrão R&R contra nenhum (0%) dos 23 que tomavam apenas interferon-α (p= 0.0001). Quanto aos outros padrões de ANA-HEp-2, dos 23 pacientes que tomavam apenas interferon-α, 12 (52%) foram positivos enquanto apenas 27 (25%) dos que tomavam interferon-α e ribavirina foram positivos (p= 0.010). 9% dos pacientes co-infectados com HCV+HIV apresentaram o padrão R&R. Não encontramos relação entre a presença do padrão R&R e o genótipo do vírus, a carga viral e os dados demográficos dos pacientes com HCV. A porcentagem de respondedores ao tratamento foi ligeiramente menor nos pacientes que apresentaram o R&R, porem sem atingir nível de significância estatística (p=0,150). Lâminas ANA-HEp-2 de algumas marcas comerciais que não Euroimmun e INOVA e aquelas elaboradas no próprio laboratório não apresentaram as estruturas do R&R. Quando tratadas in vitro com ribavirina ou tripsina, as células HEp-2 ou 3T3 e MH22A de camundongo cultivadas expressaram vários anéis e bastões reconhecidos pelas amostras de soro R&R-positivas. Não observamos colocalização das estruturas R&R com microtúbulos e observamos fraca colocalização dos anéis e bastões com CTP-sintase. Conclusões: Autoanticorpos associados ao padrão R&R ocorreram em íntima associação ao uso de interferon-α e ribavirina em pacientes com hepatite HCV, independentemente de serem portadores do HIV. Não houve associação às características demográficas dos pacientes, ao perfil de resposta terapêutica, ao genótipo do HCV ou à carga viral. As estruturas em anéis e bastões associadas ao padrão R&R não ocorrem nas condições normais avaliadas, podendo ser induzidas in vitro pela exposição à ribavirina ou à tripsina. Há algum grau de conservação filogenética dos autoantígenos associados ao padrão R&R. Evidências preliminares indicam a presença da enzima CTP-sintase nas estruturas em anéis e bastões reconhecidas pelos autoanticorpos humanos. / Introduction: Patients with Hepatitis C frequently produce autoantibodies. In the antinuclear antibody assay on HEp-2 cells (ANA-HEp-2) these autoantibodies generate several immunofluorescence patterns, and the nuclear fine speckled pattern is the most common. A novel ANA-HEp-2 pattern has been recently reported, characterized by the presence of rods and rings in the cytoplasm. Objectives: To study the clinical and virological features, as well as the profile of therapeutic response of patients presenting autoantibodies generating the rods and rings (R&R) ANA-HEp-2 pattern and to perform a preliminary analysis of the cellular and molecular aspects of this novel autoantigen system. Methods: Serum samples obtained from 1988 to 2008 from 597 patients were processed in the ANA-HEp-2 assay on Euroimmun or INOVA slides and classified as R&R-positive when presenting immunofluorescence as 3-10μm long rods and 2-5μm diameter rings in the cytoplasm of HEp-2 cells. Among the tested patients, 342 had HCV, 200 had other chronic liver diseases or rheumatic autoimmune diseases, and 55 had HCV and HIV. Clinical, virological, and treatment information was obtained from the clinical data bank. Human HEp-2, and murine 3T3, and MH22A cell lines were cultured as usual and under special stimuli (exposure to trypsin or ribavirin), and prepared with alternative fixation protocols for processing in single or double indirect immunofluorescence with human anti-R&R serum and antibodies to tubulin and to CTP-synthase. Results: Among the 342 HCV patients, 51 (15%) presented the R&R pattern as opposed to only one among the 200 patients with other liver diseases and autoimmune rheumatic diseases (p<0.001). Among the HCV patients, 174 had been treated and 168 had received no treatment. Among the 174 treated patients, 49 (28%) presented the R&R pattern as opposed to only two (1%) of the 168 non-treated HCV patients (p<0.001). Among 134 HCV treated patients with detailed information on the treatment protocol, 108 used interferon-α and ribavirin and 23 used only interferon-α. Forty-one (38%) of the R&R pattern as opposed to none of the 23 patients receiving only interferon-α (p=0.0001). In contrast, 12 (52%) of the 23 patients receiving only interferon-α presented other non-R&R ANA-HEp-2 patterns as opposed to only 27 (25%) of the 108 patients under interferon-α and ribavirin (p=0.01). 9% of the patients with HCV and HIV presented the R&R pattern. There was no association between the occurrence of the R&R pattern and HCV genotype, viral load, and demographic features. The frequency of sustained virologic response was slightly lower in the R&R-positive patients but the difference did not reach statistical significance (p=0.15). ANA-HEp-2 slides from brands other than Euroimmun and INOVA, as well as in-house produced slides did not express the R&R structures. When treated in vitro with ribavirin or trypsin, HEp-2 cells and murine 3T3, and MH22A cell lines expressed prominent R&R structures recognized by human HCV serum samples. There was partial weak colocalization of CTP-synthase in the R&R structures but no colocalizadion of microtubule. Conclusions: autoantibodies associated with the R&R pattern were strongly associated with the use of interferon-α and ribavirin in patients with HCV, independently of co-infection with HIV. There was no association with demographic characteristics, the profile of therapeutic response, HCV genotype, and viral load. The rods and rings structures associated with the R&R pattern did not occur under normal conditions, but could be induced in vitro by exposure to ribavirin or trypsin. There is some degree of phylogenetic conservation of the autoantigens associated to the R&R pattern. Preliminary evidence indicates the presence of CTP-synthase in the cytoplasmic rods and rings structures recognized by human autoantibodies from HCV patients. / FAPESP: 2009/03796-5 / FAPESP: 2010/50710-6 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A presente investigação teve por objetivo estudar o papel do eixo GH-IGF-IGFBP no tecido hepático e nos linfócitos T e B de pacientes portadores do vírus da hepatite C, em terapia com INF-alfa e ribavirina nos períodos pré e pós-tratamento. Dados da literatura têm evidenciado o envolvimento do IGF-I na modulação da resposta imune, bem como sua atuação como fator de crescimento para células imunológicas, além de apresentar valor preditivo na avaliação da reserva hepática desses pacientes. O número final de pacientes abordados perfez o total de 80. Destes, 39 iniciaram tratamento conforme protocolo estabelecido pela equipe clínica. Quatro pacientes foram excluídos durante o curso do tratamento, sendo 2 por óbito e 2 por transtorno depressivo grave com ideação suicida. Dos 35 pacientes que concluíram o tratamento, 18 apresentaram resposta virológica ao final do tratamento. Destes, 15 pacientes (43%) obtiveram resposta virológica sustentada (RVS). As médias das U.A. (unidades arbitrárias) das enzimas AST e ALT foram estatisticamente diferentes entre os períodos pré e pós-tratamento, tanto para os pacientes que apresentaram RVS quanto para aqueles que não apresentaram tal resposta. No grupo de pacientes com RVS, observou-se que a média dos níveis basais de AST foi menor quando comparada à do grupo de pacientes sem RVS. A média das concentrações plasmáticas basais de IGF-I livre no grupo de pacientes com RVS foi estatisticamente maior quando comparada à do grupo de pacientes não respondedores. As médias das concentrações de IGFBP3 circulante no período pós-tratamento foram estatisticamente diferentes entre os grupos com e sem RVS. Um aumento do conteúdo de mRNA do gene do IGF-IR foi observado em tecido hepático de todos os pacientes com HCC quando comparado com o tecido hepático normal. Este resultado foi confirmado por análise imuno-histoquímica para o IGF-IR. Nos pacientes que apresentaram RVS a magnitude de expressão de mRNA do IGF-IR em amostras de tecido hepático após o tratamento foram estatisticamente menores em relação ao basal. Tal fato não foi observado no grupo de pacientes não respondedores. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a média do conteúdo de mRNA do IGF-I em tecido hepático dos grupos de pacientes com e sem RVS, pré ou pós-tratamento. A média do conteúdo de mRNA do IGF-I em linfócitos T no grupo de pacientes com RVS foi estatisticamente maior em relação à do grupo de pacientes não respondedores quando se consideram os períodos pré e pós-tratamento conjuntamente. Não se observou diferença estatisticamente significativa entre as médias do conteúdo de mRNA do IGF-IR nos grupos com e sem RVS, pré ou pós-tratamento. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias do conteúdo de mRNA de IGF-I e IGF-IR em linfócitos B de pacientes portadores do VHC, com e sem RVS e nos períodos pré e pós-tratamento. A diminuição de expressão de mRNA do IGF-IR em tecido hepático, observada no grupo de pacientes com RVS, sugere uma melhora da doença hepática. A hipótese de que um efeito do INF-? sobre os componentes do sistema IGF possa contribuir para este achado não pode ser descartada, porém, é provável que este efeito não seja tão importante, pois não se observou diferença nos níveis de expressão do IGF-IR hepático no grupo de pacientes não respondedores. Embora a supra-regulação (\"up-regulation\") do IGF-IR possa participar da regeneração hepática, é preciso elucidar se o aumento da expressão do IGF-IR na HCC resulta da ativação direta do gene pelo VHC ou se é uma conseqüência da agressão ao parênquima. As concentrações plasmáticas de IGF-I livre >1,35 ng/mL puderam ser consideradas preditivas da resposta ao tratamento da hepatite C com uma razão de probabilidade (\"odds ratio\") de 17,33±1,02 (Limite de confiança: 2,26-127,34) / The current investigation aimed to study the role of the GH-IGF-IGFBP axis in liver tissue and in T and B lymphocytes in patients with hepatitis C virus (HCV) before and after therapeutic regimen based on interferon alfa-2a or alfa-2b (3 million U SC 3x/wk) and ribavirin (1000-1200 mg qid). It has been shown that IGF-I plays an important role in the modulation of the immune response, besides its role as a growth factor for the immunologic cells. It also presents a predictive value in the evaluation of the hepatic reserve of these patients. Among 80 patients enrolled for this investigation, 39 began treatment with interferon-? and ribavirin, according to an established protocol. Two patients were excluded during treatment due to severe depressive disorders accompanied by suicidal thoughts and 2 patients died. Of the 35 patients who concluded the treatment, 18 eventually presented virological response. Of these, 15 (43%) maintained sustained virological response (SVR). The levels of AST and ALT enzymes in both pre and post-treatment periods were statistically different for both patients with SVR and those who did not present such response. In the group with SVR, aminotransferases basal levels were statistically lower when compared to the group of patients without SVR. In the group of non-responsive patients, the average of the scores of parenchyma activity was statistically lower in post-treatment period when compared to pre-treatment period. Furthermore, comparing post-treatment periods in both groups with and without SVR, the average of the scores of parenchyma activity was statistically lower in the group without SVR when compared to the group with SVR. Mean plasma concentrations of free IGF-I before treatment in patients who eventually achieved SVR was statistically higher in comparison to the group of non-responsive patients. Mean plasma concentrations of IGFBP3 were statistically higher in the group with RVS when compared to the group of patients without SVR. An increase of IGF-IR mRNA content was observed in hepatic tissue from all patients with CHC in comparison to normal liver. These results were confirmed by immunohistochemical analysis for the IGF-IR. IGF-IR mRNA content in liver tissue samples from patients who achieved SVR after treatment was statistically lower than that observed before treatment There was not statistical difference between IGF-I mRNA content in hepatic tissues from both groups of patients with and without SVR, in pre and post-treatment periods. IGF-I mRNA expression in T lymphocytes from patients with SVR was statistically higher in comparison to the non-responsive group of patients, considering both pre and post-treatment periods altogether. No statistical difference was observed in IGF-IR mRNA expression in both groups of patients with and without SVR, in pre and post-treatment periods. The statistical analysis did not disclose any statistically significant differences in IGF-I or IGF-IR mRNA expressions in B lymphocytes from patients with or without SVR, in pre and post-treatment periods. A decrease in hepatic IGF-IR mRNA content observed in patients who achieved SVR after therapy, suggested an improvement in hepatic damage. The hypothesis that the INF-? affects components of the IGF system contributing to these findings could not be discarded. However, it is unlike that these effects would play relevant role because any differences were observed in the hepatic IGF-IR mRNA expression in non-responsive patients. It remains to be elucidated whether IGF-IR up-regulation would be involved in hepatocyte regeneration or CHC would result from direct activation of IGF-IR gene by HCV and/or as a consequence of chronic aggression to hepatic parenchyma. Plasma concentration of free IGF-I >1.35 ng/ml was considered to be a predictive response to the treatment of hepatitis C with a probability ratio (odds ratio) of 17.33±1.02 (confidence interval: 2.26 -127.34)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal