A instabilidade genética é um importante evento associado ao carcinoma epidermóide de boca, sendo alterações na região cromossômica 11q constantemente relatadas. Neste estudo, genes localizados na região cromossômica 11q, especificamente os genes CTTN, PPFIA1, SHANK2, TAOS1 e MMP-7, foram investigados quanto a diferenças de expressão de transcritos entre carcinomas epidermóides de boca e suas margens correspondentes. A expressão desses genes foi relacionada com aspectos clínicos e histológicos, com critérios de agressividade estabelecidos, e com a sobrevida dos pacientes. Foram analisadas pela técnica de qRT-PCR 29 amostras congeladas de tumores e 25 margens. Todos os genes apresentaram maiores valores de expressão nos tumores em comparação com as margens, embora apenas o gene MMP-7 tenha exibido valores estatisticamente significantes. A expressão do gene MMP-7 mostrou fraca associação com tumores menos agressivos, e os outros genes apresentaram maiores valores de expressão em tumores mais agressivos, sem significância estatística. Não houve diferença estatística entre a freqüência das variáveis clínicas e histopatológicas com a expressão dos genes estudados, porém o PPFIA1 demonstrou maiores níveis de expressão em tumores de assoalho. Em relação à sobrevida, a expressão elevada de PPFIA1 pode implicar em um maior risco de óbito. Assim, é possível a participação do gene MMP-7 no desenvolvimento da neoplasia, e a relação do PPFIA1 com o risco de óbito, porém a expressão de transcritos dos genes CTTN, SHANK2, TAOS1 e MMP-7 não pode ser relacionada com agressividade tumoral e prognóstico. / Genetic instability is an important event associated with oral squamous cell carcinoma, and alterations in the chromosome region 11q are constantly reported. In this study, genes located on chromosome region 11q, specifically genes CTTN, PPFIA1, SHANK2, TAOS1 and MMP-7, were investigated for differences in the expression of transcripts in oral squamous cell carcinoma and their corresponding margins. The expression of these genes was correlated with clinical and histological aspects, aggressiveness criteria established, and with patient survival. Twenty-nine frozen samples of tumors and 25 samples of margin tissue were analyzed using qRT-PCR. All genes showed a higher expression in tumors, compared with the margins, although only the MMP-7 gene demonstrated statistically significant values. The expression of the MMP-7 gene showed weak association with less aggressive tumors, and the other genes showed higher expression in more aggressive tumors, without statistical significance. There was no statistical difference between the frequency of clinical and histopathological variables and the expression of genes studied, however the PPFIA1 gene demonstrated higher levels of expression in tumors of the floor of mouth. With regard to survival, the high expression of PPFIA1 may imply a greater risk of death. Thus, it is possible that the MMP-7 gene participates in the development of malignancy, and PPFIA1 expression may also be associated with risk of death, however, the expression of transcripts of the CTTN, SHANK2, TAOS1 and MMP-7 genes may not be related to tumor aggressiveness and prognosis.

Os ovos embrionados são estruturas complexas compostas pelo embrião e as membranas de suporte (corioalantóide, amniótica, gema). O desenvolvimento embrionário e suas membranas geram diversos tipos de células que são necessárias para a replicação bem sucedida de uma grande variedade de vírus. Dentre os vírus entéricos, os ovos embrionados foram usados como o principal hospedeiro para o isolamento, cultivo e propagação da grande maioria destes. O presente trabalho descreve o isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF), assim como a caracterização macroscópica do vírus relacionado com problemas entéricos em lotes de aves comerciais no Brasil. Amostras intestinais provenientes de galinhas ou frangos de corte sadias ou com problemas entéricos (diarreia) e que se apresentaram positivas, através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) e da técnica da trancriptase reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR), para Astrovírus de Galinha, Parvovírus de Galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Rotavírus Aviário, Reovírus Aviário, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas e Adenovírus Aviário Tipo 1 foram selecionadas para a realização do isolamento, cultivo e propagação em ovos embrionados SPF. Mortalidade e lesões macroscópicas como hemorragias, edema, nanismo, enrolamento, aspecto gelatinoso e deformações foram encontradas nos embriões, porém as membranas de suporte do ovo não apresentaram alteração. A confirmação viral nas passagens nos ovos foi realizada mediante o uso da PCR ou RT-PCR. Houve a replicação de Astrovírus de galinha, Vírus da Nefrite Aviária, Adenovírus Aviário do Tipo 1, Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas, Parvovírus de Galinha e Reovírus Aviário nos ovos embrionados SPF, inoculados via saco da gema, aos sete dias de idade. No entanto, estes vírus também foram isolados em ovos embrionados de 14 dias de idade. A inoculação pelo saco da gema se mostrou uma ótima via para o isolamento viral. Foram isoladas duas amostras de Parvovírus de Galinha, oito amostras de Astrovírus de Galinha, sete amostras do Vírus da Bronquite das Galinhas, dezesseis amostras de Vírus da Nefrite Aviária, onze amostras de Adenovírus Aviário do Tipo 1 e três amostras de Reovírus Aviário. Nenhuma amostra de Rotavírus Aviário foi isolada. As características macroscópicas apresentadas nos embriões foram similares em todos os vírus isolados. Várias amostras utilizadas não apresentaram lesões e foram negativas na detecção molecular, e foram consideradas amostras negativas no isolamento viral. A positividade nas provas moleculares (PCR e RT-PCR) e a presença de lesões nos embriões determinou o isolamento virale confirmou que os ovos embrionados de galinha são excelentes hospedeiros para o isolamento, cultivo, propagação e caracterização de vírus relacionados com problemas entéricos, no Brasil. As alterações encontradas no embrião sugerem a patogenicidade do vírus e o possível dano que causariam ao desenvolver a doença. Futuros trabalhos determinarão a relação existente entre os vírus isolados neste estudo e aqueles isolados em todo o mundo, estabelecendo homologia ou heterogeneidade entre eles. / The embryonated eggs are complex structures composed by embryo and support membranes (yolk sac, chorioallantoic membrane, amniotic sac). The embryo development and their membranes produced many kinds of cells that are necessary for successful replication of many viruses. Between the enteric viruses, the embryonated eggs have been used as the principal host for isolation, culture and propagation of many of these viruses. The present work describes the isolation, culture, propagation and macroscopic characterization of astrovírus, adenovirus, coronavirus, parvovirus, reovírus e rotavirus, related to enteric problems in commercial flows at Brazil in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Intestinal samples from hens or chickens health or with enteric problems (diarrhea), but showed positive for chicken astrovírus, chicken parvovirus, avian nephritis vírus, avian rotavirus, avian reovirus, bronchitis infectious vírus and fowl adenovirus type 1, through PCR and RT-PRC reactions, were selected for making of isolation, culture and propagation in chicken embryonated eggs specific pathogens free (SPF). Mortality and macroscopic lesions presented in the embryos characterized by hemorrhages, edemas, stunting, enrollment, gelatin features and deformations, however the support membranes not presented any damaged. The viral confirmation in the eggs passages was carry out using the polymerase chain reaction and transcriptase reverse of the polymerase chain reaction. Chicken astrovírus, avian nephritis vírus, fowl adenovirus type 1, bronchitis infectious vírus, chicken parvovirus and avian reovírus grow well in chickens embryonated eggs specific pathogen free SPF, inoculated in the yolk sac on seven days-old, however these viruses were isolated in embryonated eggs of fourteen days-old, too. The inoculation by yolk sac resulted be a optimal route for viral isolation, getting isolate two samples of chicken parvovirus, eight samples of chicken astrovirus, seven samples of bronchitis infectious vírus, sixteen samples of avian nephritis vírus, eleven samples of fowl adenovirus type one and three samples of avian reovirus, but any samples was isolated for avian rotavirus. The macroscopic characteristics presented in the embryos were similar in all of isolated viruses. Many samples used not present lesions and were negative in the molecular detection, considering as negative samples to viral isolation. The positivity in the molecular tests (PCR and RT-PCR) and the presence of injuries in the embryo determinate the presence of enteric vírus and that chicken astrovírus, avian nephritis vírus, fowl adenovirus type 1, bronchitis infectious vírus, chicken parvovirus and avian reovírus were isolated, confirming that the chicken embryonated eggs are excellent host for isolation, culture, propagation and characterization of vírus related with enteric problems at Brazil. The patogenicity presented in the embryo determinate the harmful the vírus are and the possible damage that their will produce in the development of disease. Future works will establish the relation exist between the isolated vírus in this work and the other viruses around the world, and their roll in the enteric disease.

Neste trabalho desenvolvemos métodos analíticos e moleculares para a detecção, isolamento e classificação filogenética de Alicyclobacillus spp. a partir de sucos de laranja e frutos ácidos, pelas técnicas: RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD, seqüenciamento do 16S rRNA e análise por métodos eletroforéticos. A sensibilidade na detecção dos A. acidoterrestris foi melhorada por meio de reações de nested RT-PCR, utilizando primers internos (amplicon de 191 bp) que foram desenhados a partir do primeiro amplicom de 294 bp. O limite de detecção foi estudado com as reações RT-PCR e nested RT-PCR, sendo capazes de detectar concentrações de 0,1 UFC mL-1 para culturas puras e 2 UFC mL-1 em sucos de laranja artificialmente inoculados. A inibição de esporos de A. acidoterrestris também foi estudada para monitorar a diminuição da viabilidade com tratamento térmico e Sapindus saponaria (200 mg L-1), utilizando RT-PCR e nested RT-PCR. Com o tratamento térmico de 99 oC por 1 h o grau de inibição dos esporos foi de 96,3%. Enquanto que, com a fração purificada de S. saponaria (200 mg L-1) incubada à 45 oC por 2 dias foi de 93,6%, mas com incubação de 99 oC por 1 h foi de 98,7%, na mesma concentração de saponina. Todas as análises de quantificação de produtos de RT-PCR e nested RT-PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em microchip no Bioanalyzer 2100 (Agilent), com os kits DNA 500 e DNA 1000 LabChip®, obtendo-se maior sensibilidade nos microchips. A classificação molecular de dezenove cepas, isoladas a partir de diferentes sucos e frutos ácidos, foram estudadas utilizando RAPD-PCR e eletroforese capilar em microchips. Utilizando cinco primers aleatórios nas reações de RAPD, foi possível estudar os polimorfismos analisados nos microchips. Segundo as análises eletroforéticas, as cepas de suco concentrado e diluído de laranja (1, 2, 6) suco concentrado de limão (lim) e suco de laranja in natura (T2, T3), apresentaram similaridades genéticas com a A. acidoterrestris. O estudo de análise filogenética baseada na comparação de seqüências de DNA da região variável do gene 16S rRNA de Alicyclobacillus acidoterrestris, foi utilizado para identificar e agrupar onze cepas isoladas de superfícies e sucos de frutos ácidos. Na árvore filogenética gerada pelo método neighbor joining e bootstrap 1000x, as cepas analisadas mostraram similaridades de 99% entre todas elas, observando-se uma maior similaridade do controle A. acidoterretris (C2) com a cepa isolada de suco concentrado de limão (lim), e uma boa discriminação entre controles das espécies A. acidocaldarius, A. cicloheptanicus, A. sendaiensis e Sulfobacillus acidophilus. / In this work, we developed analytical and molecular methods for detection, isolation and phylogenetic classification of Alicyclobacillus spp. from orange juice and acid fruits using RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD and sequencing of 16S rRNA techniques and electrophoretic methods of analysis. The sensitivity on the detection of A. acidoterrestris in orange juice was improved by nested RT-PCR, using internal primers (amplicon of 191 bp) that were designed after sequencing the first amplicon (294 bp). The detection limit was studied with RT-PCR and nested RT-PCR assay, it was able to detect concentrations of 0.1 UFC mL-1 for media culture and 2 UFC mL-1 in inoculated orange juice. The inhibition in spores from A. acidoterrestris was also studied to monitoring the diminution of viability with heat treatment and Sapindus saponaria (200 mg mL-1), using RT-PCR and nested RT-PCR assays. The inhibition by heat treatment at 99 oC for 1 h was 96.3%. However, incubation with S. saponaria at 45 oC for 2 days inhibited 93,6%, however, with incubation of 99 oC for 1 h was 98,7%, in the same concentration of saponin. The quantification of the RT-PCR and nested RT-PCR amplification product were accomplished by capillary electrophoresis in microchips using the Bioanalyzer 2100 in conjunction with the LabChip (TM) DNA 500 and DNA 1000. The molecular classification of nineteen strains isolated from different juice and acidic fruit, were studied using RAPD-PCR and capillary electrophoresis in microchips. Using five random primers in the RAPD assay, it was possible to study the polymorphisms analyzed in microchips. According to electrophoresis analyses, the strains from concentrated and diluted orange juices (1, 2, 6), lemon concentrated juice (lim) and natural orange juice (T2, T3), showed genetic similarities with the A. acidoterrestris. The study of the phylogenetic analyses based on DNA comparison sequences of the variable region of 16S rRNA gene from Alicyclobacillus acidoterrestris, was utilized for the identification and grouping of eleven strains isolated from surface and juice of acid fruits. In the phylogenetic tree produced by neighbor joining and bootstrap 1000, the strains showed similarities of 99% among all strains, showing a high similarity of A. acidoterrestris with a strain isolated from lemon concentrate juice (lim), and a good discrimination between the species A. acidocaldarius, A. cycloheptanicus, A. sendaiensis and Sulfobacillus acidophilus.

INTRODUÇÃO: Em grandes cidades, como São Paulo, a pequena porcentagem de matas existentes é representada pelos parques municipais. Estas áreas, além de representarem ambientes de lazer para as pessoas, albergam uma enorme diversidade biológica, desde mosquitos até aves e mamíferos. A interação destas espécies favorece a circulação de Flavivirus, causadores de importantes doenças humanas, que têm nas aves um importante reservatório. Atribui-se às aves migratórias o papel de carreadoras dos vírus, já que as mesmas percorrem longas distâncias para completar seu ciclo biológico. A chegada de aves do Hemisfério Norte ocorre em alguns Parques, o que favoreceria a dispersão de alguns vírus, como o Vírus do Nilo Ocidental, já que nestas áreas estão presentes mosquitos potencialmente vetores. OBJETIVOS: identificar infecção por Flavivírus nas aves dos parques municipais de São Paulo. MÉTODOS: De Março de 2012 a Janeiro de 2013, foram coletadas amostras de swab de cloaca, orofaringe e sangue de aves capturadas em redes de neblina de duas áreas do município de São Paulo: Parque Anhanguera e Fazenda Castanheiras/APA Bororé Colônia. As aves foram anilhadas e liberadas após a coleta do material. Foi realizada técnica de RT-PCR em tempo real, utilizando iniciadores genéricos que amplificam fragmento do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento. RESULTADOS: Foi capturado um total de 231 aves, em sua maioria da Ordem Passeriformes. De um total de 463 amostras, nenhuma amostra apresentou presença de RNA viral. DISCUSSÃO: Em se tratando de alguns Flavivírus, os passeriformes são considerados os reservatórios mais competentes no ciclo de transmissão, pois atingem altos níveis de viremia. Cabe ressaltar que algumas espécies desta ordem, de ocorrência na cidade de São Paulo, já foram identificadas como portadoras dos vírus Rocio e Ilhéus. A ausência de positividade é esperada, pois embora altamente sensível, a técnica de PCR depende do estado de viremia das aves, que é curta. CONCLUSÃO: Os parques municipais são áreas que aproximam aves, mosquitos e humanos, pelo papel ambiental e de lazer que os mesmos representam. Este fato classifica estas áreas como locais com potencial de transmissão de Flavivirus, o que torna importante a continuação este estudo, aumentando as áreas de abrangência, para conhecer os Flavivírus circulantes e realizar vigilância para vírus que podem ocasionar problemas de Saúde Pública / INTRODUCTION: In big cities, as São Paulo, the little percentage of existing forests is represented by the municipal parks. These áreas, besides acting as entertainment environments to the users, promote a huge biodiversity, including mosquitoes, birds and mammals. These species interaction promotes Flavivirus circulation, viruses responsible for important human diseases. The avian species are important reservoirs for these viruses, specially the migrating birds that can fly for long distances, carrying these viruses to several areas. In some parks, the arrival of migrating birds from the North Hemisphere is documented, fact that can support some viruses dispersion, for example, the West Nile Vírus, considering that in these areas potencial vector for this virus can be found. OBJECTIVES: detect Flavivirus infection in birds captured in municipal parks of São Paulo city. METHODS: from March, 2012 to January, 2013, oropharyngeal and cloacal swabs, and blood samples were collected from birds captured in mist-net webs located in two municipal areas: Anhanguera Park and Castanheiras Farm/APA Bororé Colônia. The birds were ringed and released after samples collection. The real time RT-PCR was performed, using generic primers which amplify NS5 gene fragment. Positive samples were forwarded to sequence analysis. RESULTS: a total of 231 birds were capture, in which the majority belongs to Passeriforms order. Of 463 samples collected, all samples were negative for the viral RNA presence. DISCUSSION: when talking about Flaviviruses, the passeriforms are considered the most competent reservoirs in the transmission cycle, because they can achieve great viremia levels. Some passeriforms species, endemic in São Paulo city, were identified as Rocio and Ilhéus viruses carriers in previous studies. The negativity is expected, once the Real Time RT-PCR, although highly sensitive, depends on the viremia duration, which is short in avian species. CONCLUSION: the public parks are areas which encloses birds, mosquitoes and the human being, for the environmental and entertainment role they play. This fact classifies these parks as areas with great potencial of Flavivirus transmission, ressalting the great importance to continue this study, increasing the number of areas, to detect the circulating Flavivirus and to perform surveillance for viruses which can cause public health problems

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora sÃo plantas laticÃferas. Em seus fluidos laticÃferos, foram encontradas proteÃnas do tipo osmotina. A literatura reporta que osmotinas sÃo proteÃnas relacionadas com mecanismos de defesa vegetal em situaÃÃes de estresse biÃtico e/ou abiÃtico. Entretanto, ainda hà vÃrias inconsistÃncias nessa afirmaÃÃo. Nesse contexto, tÃcnicas in vitro de cultura de tecidos vegetais foram aplicadas como modelo para auxiliar na compreensÃo de como as cÃlulas de calos de C. procera e C. grandiflora respondem ao estresse salino, em termos bioquÃmicos, e se o nÃvel de transcritos para a osmotina seria aumentado em resposta à exposiÃÃo a NaCl. Para induÃÃo desse estresse, NaCl foi adicionado à formulaÃÃo nutritiva de Murashige e Skoog (MS), em concentraÃÃes crescentes (0, 20, 40, 60 e 80 mM). Os resultados mostram que os calos cultivados com NaCl a 80 mM tiveram o crescimento e o teor de umidade reduzidos, respectivamente, em 33% e 10%, em C. procera e de 83% e 39%, em C. grandiflora, em comparaÃÃo ao seu tratamento controle. Nessas mesmas condiÃÃes, foi observado um aumento nas concentraÃÃes dos Ãons Na+ e Cl- de, respectivamente, 98,9% e 98%, em C. procera, e de 98,8% e 96%, em C. grandiflora. Foi tambÃm observada diminuiÃÃo no teor de K+ nos calos tratados com NaCl a 80 mM. Essa reduÃÃo foi de 43%, em C. procera, e de 18% em C. grandiflora, quando comparado ao tratamento controle. Os calos tratados com NaCl a 80 mM, apresentaram uma tendÃncia de acÃmulo de prolina e aÃÃcares solÃveis, alcanÃando, respectivamente valores, 26% e 37% maiores em calos de C. procera, e 55,4% e 45% maiores, em calos de C. grandiflora, que aqueles em condiÃÃes controle. O aumento na atividade das enzimas que degradam H2O2 foi observado em calos de C. grandiflora submetidos a estresse salino, sugerindo um possÃvel dano oxidativo. Esse aumento foi de 73%, para a ascorbato peroxidase, e de 62% para a peroxidase do guaiacol, nos calos tratados com NaCl a 80 mM, em relaÃÃo ao controle. NÃo foi observada qualquer alteraÃÃo significante na atividade das enzimas do sistema antioxidativo em razÃo do estresse salino em calos de C. procera. Em relaÃÃo à transcriÃÃo da osmotina, foi avaliado o perfil de seus transcritos nos intervalos de tempo de 0, 2, 12, 24, 48 horas e de 4, 7, 14 e 28 dias sob estresse. Os transcritos de osmotina foram observados a partir de 12 horas de contato dos calos com NaCl a 80 mM, em ambas as espÃcies. Contudo, nos extratos proteicos dos calos de C. procera e C. grandiflora cultivados em condiÃÃes controle e de 80 mM de NaCl, nÃo foi detectada a presenÃa da proteÃna osmotina quando avaliado pelos ensaios de eletroforese, Dot blotting e espectrometria de massas. Assim, a avaliaÃÃo do estresse salino utilizando como modelo de estudo cÃlulas in vitro foi eficiente, fornecendo informaÃÃes do comportamento celular de duas espÃcies laticÃferas, mostrando suas alteraÃÃes fisiolÃgicas, bioquÃmicas e moleculares. Os resultados sugerem que o estresse salino favoreceu o aumento da transcriÃÃo do gene da osmotina em calos das duas espÃcies em estudo e permite propor uma possÃvel relaÃÃo das osmotinas dessas espÃcies com a tolerÃncia à salinidade. A falha em detectar as proteÃnas correspondentes aos genes propicia a concepÃÃo de vÃrias novas hipÃteses a serem validadas. / Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora are laticiferous plants. It was found osmotin protein. The literature shows that the osmotinas are associated to plant defence mechanisms in situations of biotic or abiotic stress. However, there are still several inconsistencies in this hypothesis. In this context, it was used in vitro tissue culture techniques as model to assist in the understanding of how the C. procera and C. grandiflora callus cells respond to salt stress in biochemical terms, and whether the transcripts level for osmotin has raised in response to exposure to NaCl. It was added NaCl to the culture medium of Murashige e Skoog (MS) in increasing concentrations (0, 20, 40, 60 e 80 mM). The results show that callus treated with 80 mM NaCl have reduced the growth and the humidity percentage of respectively 33% and 10% in C. procera and 83% and 39% in C. grandiflora compared to the control treatment callus. Under the same conditions, it was seen an increase in ions concentrations of Na+ and Cl-, 98.9% and 98% in C. procera and 98.8% and 96% in C. grandiflora respectively. It was also seen a reduction in K+ level in callus treated with 80 mM NaCl, 43% in C. procera and 18% in C. Grandiflora, when compared to the control. The callus treated with 80 mM NaCl, showed a tendency of the proline accumulation and soluble sugars, increasing 26% and 37% in C. procera callus and 55.4% and 45% in C. grandiflora callus, respectively, when compared to control conditions. The increase in the activity of enzymes that break H2O2 has been observed in C. grandiflora callus under the salt stress, suggesting a possible oxidative damage, this increase was 73% in the ascorbate peroxidase activity and 62% in guaiacol peroxidase activity when compared to the activity of enzymes of the control callus with the treaty in 80 mM NaCl. None connection was seen between changes in the activity of the enzymes of the oxidative system and the salt stress in C. procera callus. It was evaluated the behaviour of osmotin in the osmotin transcription at 0, 2, 12, 24, 48 hours and at 4, 7, 14, 28 days of callus contact under stress. The osmotin transcripts were observed from 12 hours of contact of callus in 80mM NaCl in both species. However, it was not found osmotin by electrophoresis assays, dot blotting and mass spectrometry in the protein extracts of C. procera and C. grandiflora callus grown in control conditions and in 80 mM NaCl. Thus, the salt stress evaluation using in vitro cell model study was effective, providing cellular behaviour information for these two laticifers plants species showing their physiological, biochemical and molecular changes. The results suggest that the induced salt stress has favoured the increase of osmotin gene expression in both cases and suggests a possible relationship between osmotin of these species with the protection to salinity conditions. The failure to detect the proteins corresponding to genes provides the conception of several new hypotheses to be validated.

O gênero Hantavírus está incluído na família Bunyaviridae que são vírus emergentes associados a roedores que podem infectar o homem causando graves doenças. Nas Américas, os Hantavírus causam uma síndrome pulmonar e cardiovascular (SPCVH) com alta letalidade. Cerca de 1600 casos de SPCVH já foram notificados no Brasil causando mais de 600 óbitos. Sete espécies de Hantavírus são conhecidas no Brasil incluindo o vírus Araraquara que circula nas regiões de cerrado do país associado ao roedor Necromys lasiurus. Para o desenvolvimento de uma RT-PCR em tempo real para detecção e quantificação de Hantavírus, mostramos as etapas para o desenvolvimento de uma one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I para Hantavírus Araraquara que se mostrou específica para o gênero e capaz de detectar até 10 cópias por mL de RNA viral na amostra. Além disso, realizamos um estudo filogenético utilizando algoritmos bayesianos, com 190 sequências completas do gene da nucleoproteína, oriundas de 30 países durante um período de 25 anos (1985-2010) que encontravam-se disponíveis no GenBank (NCBI). Baseando-se em uma taxa média de 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) substituições nucleotídicas por sítio/ano, foi possível inferir que os Hantavírus teriam aproximadamente 1917 anos. O processo de dispersão dos Hantavírus pelo mundo teria ocorrido há aproximadamente 500 anos, e a introdução destes vírus nas Américas teria ocorrido há 549 anos (95% HPD 1555-341 anos), via América Central ou México, originando os Hantavírus adaptados aos roedores da subfamília Neotominae, e pelo Brasil surgindo há 406 anos (95% HPD 1150-250 anos) os Hantavírus associados a roedores da subfamília Sigmodontinae, e posteriormente dispersaram para todo o continente sul-americano. O trabalho contribui de forma relevante para o diagnóstico das infecções por Hantavírus com a one-step RT-PCR em tempo real SYBR Green I e também, contribui para o entendimento da filogenia e história destes vírus, oferecendo subsídios ao entendimento sobre como teria ocorrido o espalhamento dos Hantavírus pelo mundo. / The genus Hantavirus is included in the family Bunyaviridae are viruses emerging carried by rodents, which can infect humans causing serious illness. In the Americas, the Hantavirus causing a pulmonary syndrome (HPS) with high lethality. About 1,600 cases of HPS have been reported in Brazil, cause over 1600 deaths. Seven species of Hantavirus are known in Brazil, including Araraquara virus circulating in Cerrado regions (or Savannah regions) of the related in rodents Necromys lasiurus. The development of a real-time RT-PCR for detection and quantitation of Araraquara virus, here we show the steps for developing a one-step SYBR Green real-time RT-PCR for virus Araraquara which proved to be specific for the genus and capable of detecting up to 10 copies of viral RNA per ml in the sample. Furthemore, we performed a phylogenetic analysis using Bayesian algorithms, with 190 complete sequences of the nucleoprotein gene, originating from 30 countries over a 25 year period (1985-2010) that were available in GenBank (NCBI). Based on an average rate of 6.8 x 10-4 (2.5 x 10-4 - 1 x 10-3) nucleotide substitutions per site/year, it was possible to infer that the Hantavirus would be about 1917 years old. The Hantavirus spreading in the world have occurred for nearly 500 years, and the introduction of these viruses have occurred in the Americas 549 years ago (95 years% HPD 1555-341) bye Central America or Mexico, causing the Hantavirus adapted to rodents subfamily Neotominae, and Brazil emerged 406 years ago (95% HPD 1150-250 years) the Hantavirus associated with rodents subfamily Sigmodontinae, and subsequently disseminated to South America. The work contributes significantly to the diagnosis of Hantavirus infections with one-step SYBR Green real-time RT-PCR and also contributes to an understanding of the phylogeny and evolutionary history of these viruses, offering subsidies have occurred understanding of how the Hantavirus spread of the worldwide.

Orientador: Clarice Weis Arns, Renata Servan de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HelenaLage_D.pdf: 2290087 bytes, checksum: 244512a14adbf81da5ab74893d3c12b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente primário da rinotraqueíte dos perus (TRT). O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. Também está associado à síndrome da cabeça inchada (SHS) em galinhas e é responsável por significativas perdas econômicas em sua produção. O presente estudo foi dividido em três partes. A primeira parte do trabalho consistiu em avaliar a beta-actina, gene utilizado como controle interno das técnicas moleculares de detecção viral, das células chicken embryo related (CER). Para isso, foi realizado o sequenciamento dos amplicons gerados pelo PCR do gene da beta-actina. A beta-actina das células BHK21 e CER foram detectadas utilizando oligonucleotídeos hamster-específicos. Além disso, pela análise filogenética as células CER e BHK21 apresentaram uma alta similaridade genética (p>0.996). Estes resultados sugerem que as células CER não deveriam ser mais consideradas como células aviárias. A segunda parte do estudo consistiu em comparar a especificidade e limite de detecção de duas novas técnicas de RT-PCR convencional (genes da nucleoproteína (N) e da proteína de fusão -F) e de duas novas técnicas de real time RT-PCR (RRT-PCR; genes F e N) com um RT-PCR (gene da glicoproteína -G) previamente estabelecido para a detecção do AMPV. Todos estes métodos foram capazes de detectar os isolados AMPV subtipo A (AMPV/A). As técnicas RRT-PCR (genes F e N) foram capazes de amplificar os maiores limites de detecção (diluições 10-5 e 10-5, respectivamente). Além disso, o RRT-PCR gera resultados rápidos e sensíveis, o que o torna uma ferramenta alternativa para o isolamento viral. Na terceira parte, foi realizado o silenciamento gênico de AMPV pela aplicação de seqüências curtas e específicas de RNA (siRNAs, do inglês short interfering RNA) para regiões alvo do genoma viral. Assim, foram desenhadas moléculas de siRNA contra os genes N e F do AMPV. Três dias após a infecção viral, o efeito do siRNA na replicação viral foi verificado por titulação viral, RRT-PCR e RT-PCR. Os títulos virais das células CER transfectadas com o siRNA/N apresentaram queda de até 99,9% em relação ao controle. A produção de mRNAs para os genes N, F e G do AMPV também apresentou uma redução de até 99,7%. Desta forma, a molécula de siRNA contra o gene N foi capaz de inibir a replicação do AMPV in vitro. Em estudos futuros, a associação de siRNAs tendo como alvo o complexo da RNA polimerase deve ser avaliada como uma eficiente ferramenta para evitar o escape viral na terapia antiviral / Abstract: Avian metapneumovirus (AMPV) is the primary causative agent of severe rhinotracheitis in turkeys. AMPV belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. It is associated with swollen head syndrome in chickens and is the source of significant economic losses to animal food production. The present study is divided in three parts. In the first part, the chicken embryo related (CER) cells beta-actin was evaluated. The CER beta actin gene was amplified by RT-PCR, and the amplicon was sequenced. The BHK21 and CER beta-actins were detected using hamster-specific primers. The results showed that such cells are closely related to BHK21 (p > 0.966), having a p-distance of 0.7 from chicken embryo fibroblasts. This confirms that CER cells are phylogenetically closely related to BHK21 cells. The second part of the study, we compared the specificity and detection limits of two newly designed conventional RT-PCRs (F and N genes) and two newly defined real time RT-PCR (RRT-PCR; (F and N genes), with an established RT-PCR (G gene) for AMPV detection. All the RT-PCR tested assays were able to detect the six isolates. The higher detection limits were observed at 10-5- fold and 10-5-fold dilutions of the N- and F- based RRT-PCR, respectively. Important to note that RRT-PCR assays generate fast and sensitive results, becoming a feasible alternative for virus isolation. In the third part, the silencing of AMPV by targeting its viral regions was promoted. We designed specific short interfering RNA (siRNA) targeting the nucleoprotein (N) and fusion (F) genes. Three days after the virus infection, the effect of siRNA in the virus replication was verified by virus titration, real time RT-PCR, and RT-PCR assays. AMPV titers presented reduction by 99.9%, when compared to the siRNA/F and siRNA/GFP treated samples. Also, real time RT-PCR results presented reduction of AMPV N, F and G mRNAs by 99.7%, when transfected with siRNA/N. Therefore, an siRNA sequence targeting the N gene was able to inhibit the AMPV production in vitro. In future studies, a combination of siRNAs targeting the RNA-polymerase complex may be used as a tool to study AMPV-infected cells or as an antiviral therapy / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacvao Silvio R C Barbosa 2008.pdf: 717228 bytes, checksum: d0896c3b0c9fa5a05f9d7107c2e59def (MD5) Previous issue date: 2008-05-30 / The fungus Sclerotinia sclerotiorum can interact with a great range of vegetable species as well as to obey to the discharge especificity and patogenic specialization . It is capable to digest the cellular wall of host plants using for such a series of biochemical mechanisms and morfogenetics that optimize the invasion. Several enzymes are produced during the interaction plant-host and among them they stand out the family of the poligalacturonases (PGs) and them beta glucanases. PGs catalyze the hydrolysis of the connection glycosídic bond - 1,4 and them beta glucanases liberate glucans and oligossacarídeos during the hydrolysis. Our work tried to characterize, besides the pH, the action of these enzymes, as well as the gene expression during the interaction with bean (Phaseolus vulgaris) and under different cultivation means, pectin 1%, wall extract 1% and glucose 1%. The activities were measured by the method DNS where the amount was measured of you sugar reducers in the middle and the gene expression through electrophoretic profiles analyzed after the technique of RT-PCR. The results showed variation of the activity of PGs in the interaction being the middle with pectin with larger expression of them. Them beta 1,3 and beta 1,4 glucanases were expressed in both culture means proposed, however there was larger production of beta 1,3 during the invasion. The variation of the expression of such enzymes in different culture means suggests complexity of specific biochemical roles for your production raising new approaches for the recognition of the roads that they promote the development of the disease / O fungo Sclerotinia sclerotiorum, pode interagir com uma grande gama de espécies vegetais bem como obedecer à alta especificidade e especialização patogênica. Ele é capaz de digerir a parede celular de plantas hospedeiras utilizando para tal uma série de mecanismos bioquímicos e morfogenéticos que otimizam a invasão. Várias enzimas são produzidas durante a interação planta-hospedeiro e dentre elas se destacam a família das poligalacturonases (PGs) e as beta glucanases. As PGs catalisam a hidrólise da ligação glicosídica α- 1-4 e as beta glucanases liberam glucanas e oligossacarídeos durante a hidrólise. Nosso trabalho procurou caracterizar, além do monitoramento do pH, a ação destas enzimas, bem como a expressão gênica durante a interação com feijão ( Phaseolus vulgaris ) e sob diferentes meios de cultivo, pectina a 1%, extrato de parede celular de plantas de feijoeiro a 1% e glicose 1%. As atividades foram medidas pelo método DNS onde mediu-se a quantidade de açucares redutores no meio e a expressão gênica através de perfis eletroforéticos analisados após a técnica de RT-PCR. Os resultados mostraram variação da atividade das PGs na interação sendo o meio com pectina com maior expressão delas. As beta 1,3 e beta 1,4 glucanases foram expressas em ambos os meios de cultura propostos, contudo houve maior produção de beta 1,3 durante a invasão. A variação da expressão de tais enzimas em diferentes meios de cultura sugerem complexidade de rotas bioquímicas específicas para sua produção suscitando novas abordagens para o reconhecimento dos caminhos que promovem o desenvolvimento da doença.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese doutorado total.pdf: 1236976 bytes, checksum: e7099549621a6ea8ce476ffa5cba2cc1 (MD5) Previous issue date: 2007-04-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The arboviruses represent serious problems of public health in Brazil, in particular in the Amazon area. Four arboviruses have shown to be particularly important, namely dengue, yellow, Oropouche and Mayaro, since they cause severe human disease with high mortalities and are involved in periodic outbreaks. The mapping of the main arboviruses in the Rondonia State is necessary, as well as the knowledge of their biological cycles, in order to define control measures with the understanding of their period and mechanisms of transmission. It is also necessary to improve diagnostic procedures by viral isolation and molecular characterization by RT-PCR, with the primers selected for identification of these viruses, directly from the serum or tissue fluids of patients, or indirectly from cell cultures inoculated with patient s materials. In the present manuscript are presented results of arbovirus isolation and characterization procedures from two hundred and sixty six samples of blood colleted from patients with suspected of arboviruses infections in the following Rondonia State s cities: Ariquemes, Cacoal, Colorado D´Oeste, Jarú, Ouro Preto D´Oeste, Porto Velho, Theobroma and Vilhena. The samples were inoculated in C6/36 monolayers and after seven days the cellular supernatants were collected for RNA extraction by Trizol® method. The RNA extracted was used for RT-PCR with primers selected from the specialized literature s data. The universal primer was selected for identify Flavivirus, Alphavirus genera and Simbu serogroup. Specific primers were also used to identify the four serotypes of dengue virus and yellow fever virus. The amplicons were submitted to electrophoresis in agarose gel 1,7% and visualized in ultra violet light. For genetic sequencing was used the interruption of extention of chain of nucleotide by dideoxynucleotide technique. The ABI PRISM 310 Genetic Analyser (PE Biosyntesis) was used for sequencing the dengue virus serotype 1, the Personal Seq 4X4 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), for sequencing the dengue virus serotype 3 and the Mega BACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA) for sequencing the Cacipacore virus. One hundred fourteen samples were indentifyed by RT-PCR. The results of identification of positive collected samples from different periods of 2003 to 2005 was the following: 70 patients with dengue serotype 1, one patient with dengue serotype 2, 42 patients with dengue serotype 3 and one patient com Cacipacore virus. The genetic sequencing performed of dengue virus serotypes 1 and 3 samples analyzed by software Clustal W showed 98% of similarity with others dengue virus isolated and sequenced in southeastern areas of Brazil. The Cacipacore virus sample isolated fom the Theobroma patient was the first sample isolated from human infections and presented 91% of similarity with others virus samples isolated in Brazil from migratory birds. We concluded from, our studies, that the epidemiologic surveillance, using molecular methods associated to serological ones is more accurate and precise than serological methods alone. It must be added the easiness of the procedure and the speed for getting the result in contrast with complicated methodologies like hemaglutination inhibition or complement fixation methodologies that need double samples and eventually give cross-reacting results with others arboviruses. The selected primers, for Multiplex-RT-PCR and for nested-RT-PCR used in this work, identify the main arboviruses circulating not only in the Rondonia State that can be used in other centers of research in the region north region of Brazil. Our results also emphasize the agility of the method consisting in the direct use of patient s serum for the RT-PCR procedure which reduces the time for getting a diagnosis. / As arboviroses representam graves problemas de saúde pública no Brasil, particularmente na Região Amazônica. Quatro arboviroses têm-se mostrado especialmente relevantes, a saber: dengue, febre amarela, Oropouche e Mayaro, pois causam doenças humanas graves, com mortalidade relativamente elevada e são responsáveis por surtos epidêmicos. O mapeamento e caracterização dos principais arbovírus registrados no Estado de Rondônia são necessários para identificar quais estão circulando, definir o período de transmissão e seu diagnóstico através de isolamento viral e caracterização molecular pela técnica de RT-PCR, Isso foi realizado neste estudo com a seleção de primers para a identificação desses vírus tanto isolados a partir do soro do paciente quanto a partir de culturas celulares semeadas com soro dos pacientes. No presente trabalho, é apresentado resultado de isolamento e caracterização de arbovírus a partir de duzentas e sessenta e seis amostras de sangue coletadas de pacientes com suspeitas de arbovirose nas cidades de Ariquemes, Cacoal, Colorado D Oeste, Jarú, Ouro Preto D Oeste, Porto Velho, Theobroma e Vilhena. As amostras foram inoculadas em culturas de células C6/36 e após sete dias os fluídos celulares foram recolhidos e submetidos à extração de RNA pelo método do TRIzol®. O RNA extraído foi utilizado para RT-PCR com os primers selecionados na literatura especializada. Os primers universais para Flavivirus, Alphavirus, para os quatro sorotipos de dengue, para o sorogrupo Simbu e especifico para febre amarela foram testados nessas amostras. Os amplicons foram submetidos à corrida eletroforética em géis de agarose 1,7% e visualizados em transiluminador ultravioleta. Para o seqüencimento gênico utilizou-se a técnica de interrupção da cadeia por dideoxinucleotídios. Foram utilizados os seqüenciadores ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosynthesis, USA), para seqüenciar o vírus dengue sorotipo 1, o Personal Seq 4X4 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o genoma do vírus da dengue sorotipo 3 e o Mega BACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o vírus Cacipacoré. Cento e quatorze amostras foram identificadas após a realização da RT-PCR. Os resultados de isolamento e caracterização das amostras virais foi o seguinte: 70 pacientes com dengue sorotipo 1, um paciente com dengue sorotipo 2; 42 pacientes com dengue sorotipo 3 e um paciente com o vírus Cacipacoré. A seqüência gênica dos vírus da dengue sorotipos 1 e 3 foram analisadas pelo programa Clustal W e apresentaram 98% de semelhança com aqueles isolados em regiões do sudeste do Brasil. Note-se que a amostra isolada de vírus Cacipacoré representa o primeiro isolamento do vírus de seres humanos e seu seqüenciamento apresentou 91% de similaridade com o de amostras isoladas precedentemente de aves migratórias selvagens. Concluiu-se nestes estudos que a vigilância epidemiológica, associando métodos moleculares e sorológicos de caracterização viral são mais precisos do que aquela feita apenas por técnicas sorológicas. Soma-se a isso o grau de relativa facilidade para se obter o resultado, não sendo uma metodologia que implica em interpretação complexa como a Inibição da Hemaglutinação ou Fixação do Complemento, técnicas que necessitam de amostras pareadas e eventualmente podem fornecer reações cruzadas entre diferentes viroses. Os primers escolhidos tanto para Multiplex-RT-PCR, quanto para Nested-RT-PCR usados neste trabalho, identificam as principais arboviroses circulantes no Estado de Rondônia, e podem ser usados em outros centros de pesquisas na região norte. Os resultados destes estudos mostram que a agilidade do uso direto do soro de pacientes com suspeitas de arboviroses como fonte de material para a RT-PCR recomendam o uso dessa técnica, pois diminui o tempo na obtenção do resultado.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar astrovírus em amostras fecais coletadas de crianças com e sem diarréia, em São Paulo, Brasil, e divididas em dois grupos, EPM e HU, de acordo com a origem. A detecção foi realizada utilizando-se RT-PCR, com primers específicos. Os resultados para as amostras EPM mostram que 66/234 (28,2%) foram positivas para astrovírus. Para as amostras HU, 18/187 (9,6%) foram positivas. A genotipagem foi realizada com a técnica de nested/RT-PCR. De 66 amostras positivas (EPM), 19 (28,7%) foram caracterizadas como HAstV-1, 4 (6,0%) como HAstV-2, 2 (3,0%) como HAstV-3, 1 (1,5%) como HAstV-5 e 3 (4,5%) como HAstV-8. Das 18 positivas do HU, 1 (5,5%) amostra foi caracterizada como HAstV-1, 7 (38,8%) como HAstV-2 e 1 (5,5%) como HAstV-8. As amostras genotipadas em ambos os grupos foram submetidas ao seqüenciamento de nucleotídeos para confirmação dos resultados. Detecção e genotipagem de astrovírus em casos de diarréias pediátricas são técnicas são importantes e descrevem como esse vírus está circulando em São Paulo, Brasil. / The purpose of this study was to characterize astrovirus in faecal samples collected from children with and without diarrhea in São Paulo city, Brazil, and grouped into two distinct groups, EPM and HU. Detection was carried out using RT-PCR with specific primers. Results for EPM set showed that 66/234 (28,2%) were positive. In the HU set of samples, 18/187 (9,6%) were positive for astrovirus. Genotyping was carried out with nested/RT-PCR. Out of 66 astrovirus positive EPM samples, 19 (28,7%) were characterized as HAstV-1, 4 (6,0%) as HAstV-2, 2 (3,0%) as HAstV-3, 1 (1,5%) as HAstV-5 and 3 (4,5%) as HAstV-8. Among 18 astrovirus positive HU samples, 1 (5,5%) was characterized as HAstV-1, 7 (38,8%) as HAstV-2 and 1 (5,5%) as HAstV-8. Genotyped samples were confirmed by nucleotide sequencing. Detection and genotyping of astrovirus in pediatric diarrhea are important and describes how this virus is circulating in São Paulo, Brazil.