Orientador: Irene Gyöngyver Heidemarie Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:34:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vido_JoyceRico_M.pdf: 733870 bytes, checksum: d5a56d9b376e9b0ddadbf12bf5c2b264 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A contagem de blastos na medula óssea (MO) é um parâmetro essencial para a classificação e prognóstico das síndromes mielodisplásicas (SMD). No entanto, neste grupo de doenças clonais há um alto grau de atipias de células hematopoiéticas da MO podendo ser difícil classificar com precisão os blastos mielóides. Nosso objetivo foi investigar se a análise de imagem computadorizada de esfregaços de citologia de rotina corados com May-Grünwald-Giemsa seria capaz de caracterizar estas células. Precursores mielóides imaturos foram digitalizados e as imagens segmentadas de forma interativa usando esfregaços de MO: 30 casos de SMD recém-diagnosticados (15 RCMD, 11 AREB, 4 AR / ARSA) e 19 casos de MO normal. A classificação morfológica das células foi feita por consenso de dois observadores. A distribuição da cromatina nuclear foi analisada por variaveis de morfometria geomatrica, variáveis derivadas da matriz de co-ocorrência e dimensão fractal (DF) para verificar sua utilidade na classificação destas células. Entre as 15 variáveis estudadas, todas, exceto área nuclear e homogeneidade local foram capazes de distinguir os blastos de promielócitos normais. Precursores atípicos mielóides que morfologicamente lembravam mieloblastos apresentaram valores intermediários entre blastos e promielócitos de acordo com 5 variáveis e foram classificados como promielócitos por mais 7 variáveis. A área nuclear não foi significativamente diferente entre os diversos tipos de células. Precursores mielóides atípicos imaturos da MO podem ser difíceis de classificar corretamente em citologia de rotina. Eles podem ser blastos com maturação anormal ou promielócitos atípicos. Como mudanças de textura da cromatina nuclear refletem a remodelação dinâmica da cromatina, a análise das variáveis obtidas pode ser útil para classificar objetivamente precursores imaturos mielóides nas SMD / Abstract: Bone marrow (BM) blast count is an essential parameter for classification and prognosis of myelodysplastic syndromes (MDS). However, in this group of clonal disorders a high degree of atypias in bone marrow hemopoietic cells may be found so that it may be difficult to quantify precisely myeloid blasts. Our aim was to investigate whether computerized image analysis of routine cytology would be able to characterize these cells. In May-Grünwald-Giemsa stained BM smears of 30 newly diagnosed MDS (15 RCMD, 11 RAEB, and 4 RA/RARS) patients and 19 cases of normal BM, blasts, promyelocytes and atypic myeloid precursors were digitalized and interactively segmented. The morphologic classification of the cells was done by consensus of two observers. Nuclear morphometry and texture features derived from the co-occurrence matrix and fractal dimension (FD) were calculated. Among the 13 variables studied, all except nuclear area and local homogeneity were able to distinguish blasts from promyelocytes. Atypic myeloid precursors that morphologically resembled myeloblasts showed intermediate values between blasts and promyelocytes according to 5 variables and were classified as promyelocytes by another 7 variables. Nuclear area was not significantly different among the cells. BM atypical immature myeloid precursors may be difficult to classify correctly in routine cytology. They could be abnormally maturing blasts or atypical promyelocytes. As nuclear texture changes reflect chromatin remodeling dynamics, the analysis of the variables obtained by image analysis may be useful to objectively classify immature myeloid precursors in MDS / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T20:45:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis-Alves_SuiellenCarvalho_M.pdf: 2640206 bytes, checksum: 0fe8b3a89ccee8a9cd543d9d74f965c3 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A análise multiparamétrica por citometria de fluxo é útil para o diagnóstico diferencial de Síndromes Mielodisplásicas (SMD) nos casos com poucos elementos displásicos na medula óssea (MO) e cariótipo normal. Vários estudos têm relatado hipogranularidade dos granulócitos, anormalidades no padrão de expressão de antígenos, alterações nas quantidades e expressões anômalas nas células CD34+, assim como uma diminuição das células precursoras-B, além do aumento dos monócitos. No entanto, não há um consenso sobre qual o melhor painel a ser aplicado, pois, os painéis geralmente utilizados incluem um grande número de anticorpos monoclonais (AcMo). Neste estudo, a utilidade de um painel racionalizado (10 AcMo) foi avaliada, em combinações de quatro cores, na rotina laboratorial, permitindo o estudo de diversos parâmetros para o diagnóstico de SMD, podendo sugerir fatores prognósticos. Foi examinado MO de pacientes com diagnóstico recente de SMD. O diagnóstico foi baseado na contagem de sangue periférico, citologia de medula óssea e cariótipo. O critério OMS foi utilizado. Foram analisados: dispersão lateral da luz (side scatter -SSC) e padrão de maturação dos granulócitos e dos monócitos, além dos subtipos presentes na população de células CD34+, sendo estas características comparadas com a MO normal. As combinações de AcMo utilizadas foram: HLA-DR/CD14/CD45/CD33; CD16/CD34/CD45/CD13; CD19/CD34/CD45/CD117 e HLA-R/CD123/CD45/CD33. No mínimo 50.000 eventos/caso foram adquiridos. Este estudo incluiu 24 casos de MO normal e 54 casos de SMD com idade mediana de 62 anos (23-93). Os tipos OMS foram 2 casos de AR, 2 SMD del 5q, 25 CRDM, 8 CRDMSA, 7 AREB-I, 10 AREB-II. Os casos foram grupados em SMD com <5% de blastos (baixo risco) e SMD >5% de blastos (alto risco) para análise e comparados com MO normal. Foram detectadas 16 alterações: 4 nos precursores granulocíticos, 4 nos monócitos, 6 na população de blastos como o aumento das células CD34+, mieloblastos e células imaturas não definidas, diminuição dos precursores de células B, e 2 nas populações minoritárias. O total de número de alterações em casos com < 5% de blastos na MO foram de 6 (2-15) porcentagem de blastos na citologia (r= 0.38; p= 0.001), porcentagem de células CD34+ (r= 0.40; p< 0.001), células CD34+/CD13+ (r= 0.61; p< 0.0001), e com as células imaturas não linfóides CD34+/CD13- e CD34+/CD117- (r= 0.30 p=0.02 e r=0.55 p=0.0003, respectivamente). Os precursores de células-B (r=-0.39; p= 0.001) e a hemoglobina (r= -0.30; p= 0.001) diminuíram de acordo com a extensão do número de alterações. Houve correlação entre o número de alterações com o tipo OMS (r= 0.38; p=0.002) e o IPSS (r=0.27 p=0.02). Mesmo com o uso de um painel restrito de 10 AcMo, concluiu-se que este painel foi suficiente para fazer o diagnóstico em 91% dos casos, e permitiu detectar características associadas com a agressividade dos casos. / Abstract: Flow cytometric analysis is useful for the diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS) in cases of few dysplastic elements in bone marrow (BM) and a normal karyotype. Several studies have reported decreased side scatter (SSC) in the granulocytic gate, abnormalities in the maturation pattern antigens, number and abnormal co-expressions in CD34+ cells besides decreased of B-cell precursors and increased of monocytes. There is no uniformly accepted panel for these analyses that usually comprise a large number of monoclonal antibodies (MoAbs). We examined the utility of a small panel of MoAbs in four-color combinations, used routinely in our laboratory that allows the evaluation of several parameters for the diagnosis of MDS and may suggest prognostic factors. Bone marrow aspiration was performed in the diagnostic routine. The diagnosis was based on peripheral blood counts, BM morphology and karyotype. The WHO criteria were used. We examined: SSC and maturation pattern of granulocytes and monocytes; subsets present in the CD34+ population. These features were compared to the values found in normal BM. Combinations of MoAbs:HLA-DR/CD14/CD45/CD33; CD16/CD34/CD45/CD13; CD19/CD34/CD45/CD117; HLA-R/CD123/CD45/CD33. At least 50 000 events/case were acquired. Data were acquired in a FACS CaliburTM flow cytometer and the Paint-A-Gate software was used for data analysis. Normal BMs: 24 cases; MDS 54 cases. Median age: 62 years (23-93). WHO types: 2 RA, 2 MDS del 5q, 25 RCMD, 8 RCMD-RS, 7 RAEB-I, 10 RAEB-II. We could detect 16 alterations: 4 in granulocytic precursors, 4 in monocytes, increase in CD34+ cells, myeloblasts and not defined immature cells, decrease in B-cell precursors, changes in precursor lymphoid dendritic cells and basophilic precursors. The total number of changes in cases with <5% BM blasts was 6 (2-15) and in RAEB 8 (4-12). The number of alterations had a positive correlation with the WHO type, IPSS, %blasts (cytology) (r=0.38; p=0.001), %CD34+ cells (r=0.40; p=0.001), CD34+/CD13+ cells (r=0.61; p<0.0001), but also non-lymphoid immature cells (CD34+/CD13- r=0.30; p=0.02 e CD34+/CD117- r=0.55; p=0.0003). The B-precursors cells and hemoglobin decreased with the increase of number alterations (r=-0.39; p=0.001 and r=-0.30; p=0.01 respectively). We conclude that our panel, although small, was sufficient to make the diagnosis of MDS in 91% of our cases, and permitted to detect features associated with aggressive cases. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Fabíola Traina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T22:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopim-Ribeiro_Renata_M.pdf: 3643524 bytes, checksum: fec865c6ccea452efda050e40c6f1aa1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias mieloides compreendem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas que se originam de um precursor mieloide comum, em diferentes fases de diferenciação. As alterações celulares que levam ao desenvolvimento de neoplasias podem ocorrer através de mecanismos epigenéticos ou de alterações genéticas. DNMT3A codifica metiltransferases que adicionam grupamentos metil a resíduos de citosina do DNA e TET2 promove a hidroxilação da citosina metilada, o que os caracteriza como elementos importantes no controle epigenético. DNMT3A e TET2 encontram-se frequentemente mutados em neoplasias mieloides, mas o impacto prognóstico destas mutações ainda é controverso. A consequência funcional da mutação de DNMT3A em neoplasias mieloides ainda não foi definida, mas o silenciamento da proteína em células progenitoras murinas favorece a autorrenovação e compromete a diferenciação celular. A mutação de TET2 tem como consequência a perda de função do gene e participa da transformação neoplásica das células mieloides, favorecendo a proliferação da série mielomonocítica. Entretanto, a expressão de TET2 e DNMT3A nestas doenças ainda é pouco elucidada. Assim, os objetivos deste estudo foram (1) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A em células hematopoéticas de indivíduos normais e pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA), (2) correlacionar a expressão de TET2 e DNMT3A com o fenótipo clínico e sobrevida de pacientes com SMD; (3) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A durante a diferenciação celular hematopoética e (4) avaliar o efeito do silenciamento de DNMT3A no fenótipo de linhagens celulares leucêmicas. No presente estudo, verificamos redução na expressão de TET2 em células provenientes de pacientes com SMD e LMA quando comparada à expressão em controles normais (p<.001), e redução em SMD alto risco quando comparada à SMD baixo risco (p=.02). Os resultados em amostras sequenciais de cinco pacientes com SMD indicaram redução da expressão de TET2 no momento da progressão da doença. A análise univariada evidenciou que fatores clínicos tiveram impacto tanto na sobrevida livre de evento como sobrevida global, incluindo a classificação de risco pela OMS 2008 (alto vs. baixo, p<.0001), IPSS (int-2/alto vs. baixo/int-1, p<.0001), hemoglobina (<10 vs. ? 10, p<.05), contagem de leucócitos (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), contagem absoluta de neutrófilos (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) e porcentagem de blastos na medula óssea (? 5 vs. <5 ou ? 10 vs. <10, p<.0004). Além disso, a baixa expressão de TET2 teve impacto negativo na sobrevida livre de evento (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) e na sobrevida global (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). A análise multivariada indicou que a baixa expressão de TET2 (p <.0001), IPSS alto/intermediate-2 (p <.0001), e hemoglobina <10 g/dL (P<.03) são fatores prognósticos para menor sobrevida livre de evento e sobrevida global. Durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD, observamos um aumento significativo da expressão de TET2 (p=. 03). Na avaliação da diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo na expressão de TET2 durante as diferenciações granulocítica (p=.04) e megacariocítica (p=.03); e um aumento não significativo durante a diferenciação eritrocítica. A expressão de DNMT3A foi semelhante entre pacientes com LMA, SMD e controles normais, e não teve impacto significativo na sobrevida dos pacientes com SMD. A expressão de DNMT3A não foi modulada durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD. Nos modelos de diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo da expressão de DNMT3A durante a diferenciação granulocítica, mas não durante a diferenciação eritrocítica e megacariocítica. A redução na expressão de DNMT3A não resultou em alteração significativa na apoptose, na proliferação e no ciclo celular em linhagens leucêmicas HL60 e U937. A expressão gênica e proteica de PTEN não foi modulada em células leucêmicas submetidas à inibição de DNMT3A. Os achados aqui descritos sugerem que, similarmente à presença de mutação no TET2, a baixa expressão de TET2 pode participar do processo de transformação celular em SMD de alto risco e LMA; estudos clínicos deveriam considerar a investigação da expressão gênica de TET2 em conjunto com a pesquisa de mutação TET2 na definição de prognóstico. Os resultados de expressão e função de DNMT3A sugerem que a mutação, e não a expressão, deva ser o principal mecanismo pelo qual o DNMT3A participa da transformação neoplásica e que a função de DNMT3A pode depender da linhagem celular estudada / Abstract: Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies that originate from a common myeloid precursor at different stages of differentiation. Cellular changes that lead to development of malignancies may occur through epigenetic mechanisms or genetic alterations. DNMT3A encodes methyltransferases that add methyl groups to cytosine residues in DNA, TET2 promotes hydroxylation of methylated cytosine, and both proteins are important elements in epigenetic control. TET2 and DNMT3A are recurrently mutated in myeloid malignancies, but the prognostic consequence of TET2 and DNMT3A mutation is still controversial. The functional consequences of DNMT3A mutation has not been defined, but the protein silencing in murine progenitor cells promotes self-renewal and reduces cell differentiation. TET2 mutation results in loss of function and participates in the neoplastic transformation of myeloid cells, favoring the proliferation of granulomonocytic cells. However, the expression of TET2 and DNMT3A in these diseases has been rarely addressed. Then, the aims of this study were (1) to evaluate TET2 and DNMT3A gene expression in hematopoietic cells from healthy individuals and from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML); (2) to correlate TET2 and DNMT3A expression with clinical phenotype and outcomes of MDS patients; (3) to investigate TET2 and DNMT3A expression during hematopoietic cell differentiation; and (4) to evaluate the effect of DNMT3A silencing in the phenotype of leukemia cell lines. In this study, the expression of TET2 was decreased in cells from patients with MDS and AML compared to healthy donors (p<.001) and reduced high-risk MDS compared to low risk MDS (p=.02). The results in sequential samples from five patients with MDS indicate reduced expression of TET2 at the time of disease progression. By univariate analysis, clinical factors that significantly affected both event free survival (EFS) and overall survival (OS) included risk stratification by WHO 2008 (high vs. low, p<.0001), IPSS (int-2/high vs. low/int-1, p <.0001), hemoglobin (<10 vs. ? 10, p<.05), white blood cell counts (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), absolute neutrophil counts (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) and bone marrow blast percentage (? 5 vs. <5 or ? 10 vs. <10, p<.0004). Furthermore, low TET2 expression negatively impacted both EFS (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) and OS (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). Multivariate analyses indicated that low TET2 expression (p <.0001), along with IPSS high/intermediate-2 risk group (p <.0001), and hemoglobin <10 g/dL (p<.03) were independently prognostic for worse EFS and OS. During erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with low-risk MDS, we observed an increased expression of TET2 (p=.03). During cell differentiation of leukemic cell lines, we observed a significantly increase in the expression of TET2 during granulocytic and megakaryocytic differentiation (p=.04 and p=.03, respectively); there was also an increased expression during erythrocytic differentiation, but this was not statistically significant. The expression of DNMT3A was similar between patients with AML, MDS and healthy donors, and it did not impact survival outcomes in MDS patients. DNMT3A expression was not modulated during erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with MDS. In leukemic cell lines models of differentiation, we observed a significantly increase in the DNMT3A expression during granulocytic differentiation, but not in erythrocytic and megakaryocytic differentiation. The DNMT3A silencing did not result in significant changes in apoptosis, proliferation and cell cycle in leukemic cell lines HL60 and U937. PTEN gene and protein expression was not modulated in leukemic cell lines submitted to inhibition of DNMT3A. The findings reported here suggest that, similarly to the presence of TET2 mutations, the low expression of TET2 can participate in the process of cell transformation in high risk MDS and AML. Clinical studies should consider the investigation of TET2 expression together with the studies of TET2 mutation to defining prognosis. Our results of expression and function suggest that DNMT3A mutation, instead of the expression, should be the main mechanism by which DNMT3A participates in neoplastic transformation and that DNMT3A function may vary according to the cell line studied / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis-Alves_SuiellenCarvalho_D.pdf: 1989355 bytes, checksum: c49ffc9bdc49263faef580e3f36d751a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A imunofenotipagem é reconhecida como uma importante ferramenta para o diagnóstico das síndromes mielodisplásicas (SMD). O sistema de pontuação por citometria de fluxo descrito recentemente (FCSS) é útil para o diagnóstico diferencial, bem como para o prognóstico de SMD. Avaliamos se a inclusão de valores quantitativos de expressões anormais em células CD34+ e monócitos nesta pontuação poderia melhorar o seu valor diagnóstico. O FCSS modificado (FCSS -R) abrange 9 alterações granulocíticas, 8 monocíticas e 6 de células CD34+. A análise imunofenotípica foi realizada em células de medula óssea (MO) de 56 pacientes com SMD (76% com blastos na medula óssea <5%), 33 casos de citopenias reacionais e 41 doadores de medula óssea saudáveis de transplante alogênico (controles normais). As duas pontuações foram aplicadas em todos os casos. Embora tenhamos encontrado o desvio à esquerda assíncrono na maturação dos granulócitos, a diminuição das hematogônias e o aumento de monócitos CD16+, bem como casos isolados de co-expressões anormais no amadurecimento de precursores mielomonocíticos em citopenias reacionais, alterações qualitativas e quantitativas nos sub tipos de células mielóides CD34+ foram mais específicas de SMD. Ambas as pontuações permitiram discriminar SMD de citopenias reacionais, mas, de acordo com a área sob a curva ROC, o FCSS -R foi mais sensível (53% para FCSS e 94% para FCSS -R). Ambas as pontuações apresentaram especificidade de 100%. A inclusão de valores quantitativos de expressões anormais nas células CD34+ e monócitos em FCSS melhorou a sensibilidade de FCSS-R para o diagnóstico diferencial entre SMD e citopenias periféricas reacionias / Abstract: Immunophenotyping has been recognized as an important tool for diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS). The recently described flow cytometry scoring system (FCSS) is useful for the differential diagnosis as well as prognosis of MDS. We examined if the inclusion of quantitative values of abnormal expressions in CD34+ cells and monocytes in this score could improve its diagnostic value. The modified FCSS (FCSS-R) covers 9 granulocytic, 8 monocytic and 6 CD34+ cell abnormalities. Immunophenotypic analyzes were performed on bone marrow (BM) cells of 56 patients with MDS (76% with bone marrow blasts <5%), 33 cases of reactive cytopenias and 41 healthy bone marrow donors for allogeneic BM transplantation (normal controls). The two scores were applied in all cases. Although asynchronous shift to the left in the maturing granulocytes, decrease in hematogones and increase in CD16+ monocytes as well as isolated cases of abnormal co-expressions in maturing myelomonocytic precursors could be found in reactive PB cytopenias, the most important differences with MDS were seen in the subsets of myeloid CD34+ cells. Both scores allowed to discriminate MDS from reactive cytopenias, but, according to the area under the ROC curve FCSS-R was more sensitive (53% for FCSS and 94% for FCSS-R). Both scores had a specificity of 100%. The inclusion of quantitative values of abnormal expressions in CD34+ cells and monocytes in FCSS improved the sensibility of FCSS for the differential diagnosis between MDS and reactive peripheral cytopenias / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T16:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palodetto_Bruna_M.pdf: 1523635 bytes, checksum: 0dc5f0194b2dd973ee8eaeac9a384983 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças hematopoiéticas caracterizadas pela hematopoiese ineficaz resultando em citopenia no sangue periférico; cerca de 30% das SMDs evolui para leucemia mielóide aguda secundária. Leucemias agudas (LA) são doenças malignas do sangue caracterizadas por acúmulo de blastos podendo ser classificadas em mielóide agudas (LMA), quando há envolvimento de mieloblastos, ou linfóides agudas (LLA), quando há envolvimento de linfoblastos. A sobrevida média dos pacientes com leucemia aguda ainda é muito baixa e muitos deles são resistentes ao tratamento ou apresentam recaída. O melhor entendimento sobre os mecanismos de progressão da mielodisplasia e da resposta ao tratamento em leucemias agudas poderia melhorar a taxa de resposta ao tratamento e aumentar a sobrevida dos pacientes. O metabolismo e o efluxo de drogas são mecanismos de defesa responsáveis pela proteção contra agentes tóxicos e estão envolvidos na biotransformação de diversos xenobióticos. O metabolismo de drogas pode ser divido em duas fases (Fase I: Oxidação; Fase II: Conjugação), sendo ambas mediadas por enzimas metabolizadoras de drogas. O efluxo de drogas é outro mecanismo de proteção contra tóxicos, similar ao metabolismo de drogas, porém mediado por proteínas de membrana. Essas proteínas são polimórficas e esses polimorfismos alteram a atividade enzimática, podendo modificar a resposta ao tratamento e a sua resistência. O gene CYP2B6 codifica uma enzima da fase I do metabolismo responsável pela ativação dos fármacos. Esse gene possui o polimorfismo G15631T onde há troca do aminoácido (Gln172His) resultando em perda da atividade enzimática. Os genes GSTM1, GSTT1 e NQO1 codificam enzimas da fase II do metabolismo, responsáveis pela conjugação com outras substâncias para facilitar a excreção. Os genes GSTM1 e GSTT1 possuem um polimorfismo que causa deleção homozigota do gene; e o gene NQO1 possui o polimorfismo C609T que resulta em troca do aminoácido codificado (Pro187Ser). Esses polimorfismos levam a perda da atividade enzimática. O gene MDR-1 codifica a P-glicoproteína que é uma proteína de membrana responsável pelo efluxo de drogas. Esse gene possui o polimorfismo C3435T que apesar de ser silencioso (Ile1142Ile) diminui a expressão de P-glicoproteína. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar a influência dos polimorfismos CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T e MDR-1 C3435T no risco de leucemias agudas e SMD, na progressão de SMD e resposta ao tratamento de leucemia aguda. Foram analisados 90 pacientes com leucemia aguda (66 LMA e 24 LLA), 68 pacientes com SMD e 100 controles normais utilizando os métodos de PCR-RFLP e Multiplex. Não houve diferença estatística na freqüência dos polimorfismos entre pacientes e grupo controle. Em SMD encontramos maior frequência de deleções de GST em pacientes que progrediram comparados aos pacientes que não progrediram: 50% e 21% (P=0,019). Também encontramos menor frequência do alelo polimórfico T do polimorfismo MDR-1 C3435T em pacientes que progrediram comparada a dos pacientes que não progrediram: 50% e 81% (P=0,012). Na resposta ao tratamento de leucemias agudas, encontramos uma tendência à maior frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com falha de indução quando comparados a pacientes com remissão em leucemias agudas, em geral, (P=0,093) e pacientes somente com LMA (P=0,125); e quando comparamos falha de indução com o grupo controle em leucemias agudas, em geral, (P=0,101) e somente em LMA (P=0,08). Observamos a mesma tendência quando comparamos a frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com óbito precoce versus a população normal (P=0,058). Em conclusão, estes resultados sugerem que os polimorfismos não estão relacionados ao risco de leucemia aguda e SMD, embora a amostra aqui analisada possa ter sido insuficiente; as deleções GST e o polimorfismo MDR-1 C3435T estão envolvidos na progressão de SMD e o polimorfismo NQO1 C609T tem uma tendência a estar relacionado à falha de indução e ao óbito precoce em pacientes com leucemias agudas, em geral, e somente LMA / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of hematopoietic disorders characterized by ineffective hematopoiesis resulting in peripheral blood cytopenia, about 30% of MDS patients progresses to acute myeloid leukemia. Acute leukemia (AL) are malignant blood diseases characterized by accumulation of blasts and they can be classified into acute myeloid (AML), when there is myeloblasts involvement or acute lymphoid (ALL), when there is lymphoblasts involvement. The median survival of acute leukemia patients is very low and many of them are resistant to treatment or relapsed. The better understanding of the myelodysplasia progression mechanisms and the acute leukemia response to treatment could improve the treatment response rate and patients survival. The metabolism and drug efflux are defense mechanisms responsible for protection against toxic agents and are involved in the biotransformation of various xenobiotics. The drug metabolism can be divided into two phases (Phase I: Oxidation; Phase II: Conjugation), both being mediated by drug metabolizing enzymes. The drug efflux is a similar mechanism of protection but is mediated by membrane proteins. These enzymes are polymorphic and these polymorphisms alter the enzyme activity and may modify treatment response and resistance. The CYP2B6 gene encodes a phase I enzyme responsible for drug activation. This gene has the G15631T polymorphism where there is exchange of the amino acid (Gln172His) resulting in loss of enzyme activity. The GSTM1, GSTT1 and NQO1 genes encoding phase II metabolizing enzymes that are responsible for combining with other substances to facilitate drug excretion. GSTM1 and GSTT1 genes have a polymorphism that causes homozygous deletion of the gene; and the NQO1 gene has the C609T polymorphism that results in amino acid changes (Pro187Ser). These polymorphisms lead to loss of enzyme activity. The MDR-1 gene encodes P-glycoprotein (P-gp) which is a membrane protein responsible for drug efflux. This gene has the C3435T polymorphism that despite being silent (Ile1142Ile) leads to lower P-gp expression. The aim of this study was to identify the influence of CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T and MDR-1 C3435T polymorphisms in acute leukemia and MDS risk, MDS progression and acute leukemia response to treatment. We analyzed 90 patients with acute leukemia (66 AML and 24 ALL), 68 MDS patients and 100 normal controls using the PCRRFLP and Multiplex methods. There was no statistical difference in the frequency of polymorphisms between patients and control group. In MDS we found higher frequency of GST deletions in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 21% (P = 0.019). We also found less frequently polymorphic allele T of MDR-1 C3435T polymorphism in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 81% (P = 0.012). In acute leukemia response to the treatment, we found a trend toward a higher frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with induction failure compared to patients in remission, with acute leukemia in general, (P = 0.093) and AML patients only (P = 0.125); and induction failure when compared with the control group in acute leukemia in general (P = 0.101) and only in AML patients (P = 0.08). We observed the same trend when comparing the frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with early death versus normal population (P = 0.058). In conclusion, these results suggest that theses polymorphisms are not related to acute leukemia and MDS risk, although the sample analyzed here may have been insufficient; GST deletions and MDR-1 C3435T polymorphism are involved in MDS progression and NQO1 C609T polymorphism has a tendency to be related to induction failure and early death in patients with acute leukemia, in general, and AML only / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:19:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 XavierFerrucio_JulianaMartins_D.pdf: 4222784 bytes, checksum: e2845997ddb128f2d29a2cabc667da17 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A hematopoiese, processo pelo qual a célula-tronco hematopoiética (CTH) dá origem a todas as células do sangue, é regulada através do seu contato com diversos tipos celulares que compõem o estroma da medula óssea, mantendo o balanço entre autorrenovação e diferenciação das CTHs, processos também regulados por vias de sinalização como a via Hedgehog e proteínas reguladoras de citoesqueleto como RhoGTPases. Sendo assim, os objetivos gerais do trabalho foram investigar a via Hedgehog na medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásica (SMD) e a função da ARHGAP21 na autorrenovação das CTH. Através de imunohistoquímica de bióspias de medula óssea de pacientes com SMD em comparação com anemia megaloblástica (usada como controle) observamos o aumento de células marcadas para os ligantes Sonic e Dessert Hedgehog e células positivas para c-Kit nas amostras de SMD. Em seguida, analisamos a expressão gênica dos membros da via Hedgehog em células totais de medula óssea de pacientes SMD e doadores normais. Não houve diferença na expressão de Patched (PTCH) em SMD em comparação com doadores saudáveis, porém quando as amostras são classificadas de acordo com a WHO 2008, observamos aumento significativo de PTCH nos pacientes com <5% de blastos na medula óssea (AR, ARSA e CRDM). As expressões tanto de GLI1 como de SUFU foram reduzidas nos pacientes SMD e no grupo de pacientes com ARSA, CRDM e CRDU quando comparados aos doadores normais. A expressão de SUFU também foi reduzida em grupo de pacientes SMD com > 5% de blastos na medula óssea (AREB-1 e 2). Observamos aumento de 7 vezes na expressão de SMO no grupo de SMD e de 14 vezes no grupo AREB-1 e 2 em comparação com doadores normais. Análises de sobrevida de Cox demonstraram que o aumento na expressão de SMO e a redução na expressão de PTCH são fatores independentes na sobrevida global dos pacientes com SMD. Além disso, confirmamos o aumento da ativação da via Hedgehog em células CD34+ de pacientes com SMD através do aumento da expressão dos alvos da via: GLI1, BMI1 e Nanog. Nossos dados indicam que a via Hedgehog está desregulada na medula óssea dos pacientes com SMD e o possível envolvimento dessa via na progressão da doença. Através do modelo murino Arhgap21+/- estudamos a importância dessa proteína na hematopoiese normal e observamos que esses animais apresentam redução nas diferenciações eritroide e megacariocítica juntamente com aumento da mobilização mielóide. Observamos ainda o aumento na frequência das CTHs de curta e longa duração na medula óssea dos heterozigotos. Esse aumento foi responsável pela maior recuperação no número de neutrófilos após indução de estresse hematopoiético nos animais Arhgap21+/-. Durante o transplante seriado de células de medula óssea observamos menor reconstituição após 4 semanas, juntamente com menor reconstituição a longo prazo nos animais que receberam células dos heterozigotos, sugerindo menor autorrenovação das CTHs nas células com redução da Arhgap21. O nicho medular dos animais Arhgap21+/- demonstrou redução no suporte inicial da hematopoiese o que foi relacionado à maior produção de ROS após irradição subletal dos heterozigotos. Juntos, esses resultados indicam que a ARHGAP21 tem importante papel na hematopoiese normal, pois participa de processos como a diferenciação, mobilização e autorrenovação das CTHs / Abstract: Hematopoiesis is a process by which hematopoietic stem cell (HSC) gives rise to all blood cells and it is regulated by HSC contact with different cell types that compose the bone marrow stroma and maintain the balance between HSC self-renewal and differentiation, processes that are also regulated by signaling pathways such as the Hedgehog and regulatory proteins of the cytoskeleton as RhoGTPases. The overall aims of this work were to investigate the Hedgehog pathway in myelodysplastic syndrome (MDS) bone marrow and the ARHGAP21 role in hematopoiesis. Immunohistochemistry assays revealed that MDS bone marrow biopsies showed increased Sonic and Dessert Hedgehog together with c-kit positive stained cells compared to megaloblastic anemia (used as control).We also analyzed gene expression of the Hedgehog pathway members in total cells from MDS bone marrow and healthy donors. There was no difference in Patched (PTCH) expression in MDS compared to healthy donors, however, when MDS samples were classified according to WHO 2008, we observed a significant increase in PTCH1 expression in MDS patients <5% bone marrow blast (RCUD, RCMD, ARSA). GLI1 and SUFU expressions were significantly reduced in the MDS patients and in the group of patients with RCUD, RCMD, ARSA, when compared to healthy donors. SUFU expression was also decreased in MDS patients > 5% bone marrow blast (RAEB-1 and RAEB-2) compared to controls. We also observed 7-fold increase of SMO transcripts in the MDS group and 14-fold increase in RAEB-1 and RAEB-2. Cox survival analyses showed that increased SMO and decreased PTCH expression were considered as independent factors influencing the survival of these patients. We also confirmed the enhanced Hedgehog activation in CD34+ cells from MDS patients through increased expression of the pathway targets: GLI1, BMI1 and Nanog. Together, our data indicate that the Hedgehog pathway is deregulated in MDS bone marrow and the possible role of that pathway in disease progression. Arhgap21+/- murine model study showed the importance of this protein in normal hematopoiesis as these animals showed alterations in erythroid and megakariocyte differentiation along with increased myeloid mobilization. We also observed increased short and long term HSC frequency in the heterozygous bone marrow. This increase was responsible for enhanced neutrophil reconstitution during induced hematopoietic stress in Arhgap21+/-. Serial bone marrow transplantation assay showed lower chimerism in peripheral blood 4 weeks after the transplant together with lower long term reconstitution in animals who received Arhgap21+/- bone marrow, indicating decreased HSC self-renew from heterozygous cells. Bone marrow niche of Arhgap21+/- animals showed a reduction in initial support hematopoiesis and this result was correlated with the increased ROS production from Arhgap21+/- bone marrow after sublethally irradiation. Taken together, our data indicate that ARHGAP21 has an important role in hematopoiesis regulating process such as differentiation, mobilization and self-renewal of HSC / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baratti_MarianaOzello_D.pdf: 9890862 bytes, checksum: f7eb8503519cc264f616a79dc48baf4f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMDs) constituem um grupo heterogêneo de desordens hematopoéticas, caracterizadas por exibirem hematopoese ineficaz com evidências de displasia da medula óssea resultando em citopenias no sangue periférico. Tecnologia de microarranjo tem permitido o refinado mapeamento da atividade transcricional do genoma humano. RNAs não codificadores (ncRNAs) transcritos de regiões intrônicas de genes conhecidos estão envolvidos em vários processos relacionados com controle transcricional e pós-transcricional da expressão gênica, interações com cromatinas, modificação de histonas e também estão se tornando evidentes em vários tipos de cânceres. Caracterização de ncRNAs em células progenitoras e células estromais de pacientes com SMD representa uma estratégia aparentemente importante para o entendimento da regulação gênica nesta doença. Neste estudo, o perfil de expressão gênica de células CD34+ e estromais de pacientes com SMD do subgrupo anemia refratária com sideroblastos em anel (ARSA) foi comparado com o de indivíduos saudáveis, usando oligoarranjos de 44 kilobases contendo íntrons e éxons, o qual incluiu sequências para genes codificadores, RNAs sense e antisense totalmente e parcialmente intrônicos. Em células CD34+ de pacientes com SMD-ARSA, 216 genes foram diferencialmente expressos (q-value ? 0,01) em comparação com indivíduos saudáveis, dos quais 65 (30%) eram transcritos não codificadores. O gene DMT1, um transportador de ferro, foi encontrado hiperexpresso em células CD34+ de SMD-ARSA. Em medula óssea total de 34 pacientes, a expressão foi mais evidente no subgrupo de pacientes com SMD de baixo risco/INT-1. Ensaios de imuno-histoquímica corroboram os dados encontrados na análise de expressão gênica e demonstram que DMT1 se encontra mais expresso nas células eritroblásticas. A hiperexpressão de DMT1 pode estar relacionada com o homeostase do ferro anormal nas SMDs. Em células estromais de SMD-ARSA, 12 genes foram diferencialmente expressos (q-value ? 0,05) em comparação com indivíduos saudáveis, dos quais 3 (25%) eram transcritos não codificadores. O gene SEMA3A, um membro secretado da família das semaforinas, foi encontrado hiperexpresso em células estromais de SMD-ARSA e na medula óssea total de 34 pacientes; sua hiperexpressão foi mais evidente em pacientes com SMD de alto risco/INT-2 e em pacientes com leucemia mieloide aguda (n=19). Ensaios funcionais demonstraram que SEMA3A está envolvido com aumento da adesão, diminuição da diferenciação e apoptose de células leucêmicas cocultivadas com células estromais HS27 hiperexpressando SEMA3A e age de maneira parácrina sobre as células precursoras. Pela primeira vez, o perfil diferencial de ncRNA em células CD34+ e células estromais entre SMD-ARSA e indivíduos saudáveis foi demonstrado, sugerindo que ncRNA pode ter um importante papel durante o desenvolvimento das síndromes mielodisplásicas / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group heterogeneous of hematological disorders characterized by ineffective hematopoiesis with morphological evidence of marrow cell dysplasia resulting in peripheral blood cytopenia. Microarray technology has permitted a refined high-throughput mapping of the transcriptional activity in the human genome. Noncoding-RNAs (ncRNAs) transcribed from intronic regions of genes are involved in a number of processes related to post-transcriptional control of gene expression, and chromatins interaction, and histone modification and they are becoming evident in several cancers. Characterization of ncRNAs in progenitor cells and stromal cells of MDS patients could be strategic for understanding gene expression regulation in this disease. In this study, gene expression profiles of CD34+ and stromal cells of MDS patients with refractory anemia with ringed sideroblasts (RARS) subgroup were compared those of healthy individuals, using 44 kilobases combined introns and exons oligoarrays, which included probes for protein-coding genes, for sense and antisense strands of totally and partially intronic noncoding RNAs. In CD34+ cells of MDS-RARS patients, 216 genes were significantly differentially expressed (q-value ? 0.01) in comparison to healthy individuals, of which 65 (30%) were noncoding transcripts. The DMT1 gene, an iron-transporter, was found up-regulated in CD34+ cells of MDS-RARS. In the total bone marrow of 34 patients, the expression of DMT1 was more evident in the subgroup of low risk/INT-1 MDS patients. The immunohistochemistry assay confirms the data obtained in the gene expression assay and show that DMT1 is more expressed in erythroid cells. The higher expression of DMT1 can be related with abnormal iron homeostasis in MDS. In stromal cells of MDS-RARS, 12 genes were significantly differentially expressed (q-value ? 0.05) in comparison to healthy individuals, of which 3 (25%) were noncoding transcripts. The SEMA3A gene, a secreted member of the semaphorins family, was found up-regulated in stromal cells of MDS-RARS and in the total bone marrow of 34 patients; further, the higher expression was more evident in high risk/ INT-2 subgroup of MDS patients and acute myeloid leukemia patients (n = 19). Functional assays demonstrated that SEMA3A is related to adhesion increase, differentiation decrease, and apoptosis of leukemia cells cocultivated with HS27 stromal cells higher expressing SEMA3A, also acting in a paracrine fashion in the precursors cells. These results demonstrated, for the first time, in CD34+ cells and stromal cells the differential ncRNA expression profile between MDSRARS and healthy individuals, suggesting that ncRNAs may play an important role during the development of myelodysplastic syndromes / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Lilian Maria de Castilho, Jeane Eliete Laguila Visentainer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:14:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guelsin_GlauciaAndreiaSoares_D.pdf: 3524338 bytes, checksum: 77312cdc47d244e00235a67d7f52c666 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A síndrome mielosplásica (SMD) correponde a um grupo de distúrbios clonais heterogêneos decorrente de um defeito intrínseco das células progenitoras hematopoéticas, resultando em insuficiência da medula óssea, desencadeando anemia com dependência de transfusões sanguíneas e infecções decorrentes da neutropenia. Embora a terapia transfusional seja segura, muitos desses pacientes correm risco de complicações relacionadas à sobrecarga de ferro e à aloimunização contra antígenos de grupos sanguíneos, que muitas vezes dificulta a busca de sangue compatível para esses pacientes, além estar associada a reações hemolíticas transfusionais tardias e formação de auto-anticorpos. A compatibilidade para antígenos Rh e K tem sido utilizada na tentativa de reduzir a formação de anticorpos em pacientes que recebem transfusões crônicas, mas a fenotipagem estendida, incluindo os antígenos Fya e Jka, também tem sido recomendada. Este estudo teve como objetivos avaliar o perfil transfusional dos pacientes com SMD, propor um protocolo de compatibilidade molecular para seleção de sangue fenótipo compatível e avaliar uma possível associação dos alelos HLA com a susceptibilidade ou proteção a aloimunização eritrocitária. Foram analisados 61 pacientes portadores de SMD, sendo 18 pacientes não transfundidos e 43 pacientes submetidos à terapia transfusional com e sem formação de anticorpos. Realizamos genotipagem para os alelos de grupos sanguíneos RHD, RHCE, FY, DO, CO, DI, SC, GYPA, GYPB, LU, KEL, JK e LW e para os alelos HLA classe I e classe II nas amostras dos pacientes e comparamos os resultados com grupos- controle. Com relação ao perfil transfusional dos pacientes estudados, a maioria recebe transfusões sanguíneas regulares e 44% encontra-se aloimunizada. Os principais aloanticorpos detectados foram contra antígenos Rh e K. Verificamos que a genotipagem é superior a fenotipagem para determinação dos antígenos de grupos sanguíneos e que a compatibilidade molecular para Rh e K seria suficiente para evitar a aloimunização eritrocitária na maioria dos pacientes. Nossos resultados também mostraram uma associação entre o alelo HLA-DRB1*13 e a proteção à aloimunização contra antígenos de grupos sanguíneos em pacientes com SMD / Abstract: The myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of heterogeneous clonal disorder caused by an intrinsic stem cell defect with propensity to the bone marrow failure that results in the transfusion dependence and neutropenic infection. Although blood transfusion is generally safe, many of those patients are at risk of transfusion-related complications such as iron overload and RBC alloimmunization that often makes finding compatible RBC products difficult and is also associated with delayed hemolytic transfusion reactions (DHTRs) and autoantibody formation. Matching for Rh and K antigens has been used in an attempt to reduce antibody formation in patients receiving chronic transfusions but an extended phenotyping matching including Fya and Jka antigens has also been recommended. This study was aimed to identify the transfusion profile of the patients with myelodysplastic syndrome (MDS), an efficient transfusion protocol of genotype matching and a possible association of HLA class alleles with susceptibility or protection to RBC alloimmunization. We evaluated 61 patients with MDS, 18 not transfused and 43 undergoing transfusion therapy with and without antibody formation. We performed genotyping for RHD, RHCE, FY, DO, CO, DI, SC, GYPA, GYPB, LU, KEL, JK e LW and for HLA class I and class II alleles in the patient DNA samples and compared the results with a control group. We verified that the majority of patients have regular transfusions and 44% are alloimmunized to RBC antigens. Blood group genotyping was superior to phenotyping to determine the antigen profile in those patients and molecular matching for Rh and K would be enough for most of the patients. Our results also showed a significant association of HLA-DRB1*13 with protection to RBC alloimmunization in patients with MDS / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientador: Carmen Sílvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:57:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ClaudiaEstela_D.pdf: 2258187 bytes, checksum: 7cac2852cc031e31eba1a31c62d9dda2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Anemia de Fanconi (AF) é uma alteração genética caracterizada por múltiplas anomalias congênitas, anormalidades hematológicas e predisposição a uma variedade de tumores. A incidência mundial da AF em todo o mundo é de aproximadamente três por milhão e a frequência de heterozigotos é estimada em um para 300 na Europa e Estados Unidos. É uma doença causada por mutações em genes relacionados ao sistema de reparo. Até o momento foram descritos 16 genes que podem estar multados. São eles: FANCA, FANCB, FANCC, FNCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM, FANCN, FANCO, FANCP E PANCQ. Os grupos mais frequentes são o FANCA e FANCC. De qualquer modo devido a essa heterogeneidade gênica, o diagnóstico molecular dessa alteração é complexo. Com o intuito de testar uma estratégia diagnóstica, o presente trabalho se propôs a identificar as mutações mais frequentes no gene FANC por PCR e digestão enzimática e investigar mutações no gene FANCA, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase seguida de digestão enzimática da mutação Brasileira e posterior sequenciamento dos 43 éxons em 60 pacientes portadores de Anemia de Fanconi DEB positivos. Foram detectados 19 pacientes (27,94%), como sendo do grupo C e 16 pacientes como grupo A (23,53%). A mutação ?3788-3790 do gene FANCA teve uma frequência alélica de 15,4%. Foram encontradas 3 mutações intrônicas, 1 mutação sinônima e 1 mutação de sentido trocado no gene FANCA. Não foram encontradas correlações com as manifestações hematológicas, renais, baixo peso, malformações congênitas de membros, machas e pigmentação de pele, sexo e idade / Abstract: The Fanconi Anemia (FA) is a genetic disorder characterized by multiple congenital and hematological abnormalities and predisposition to a variety of tumors. The worldwide incidence of AF is approximately three per million and the frequency of heterozygotes is estimated at one in 300 in Europe and the United States. It is a disease caused by mutations in genes involved in the repair system. So far have been described 16 genes that may be mutated. They are: FANCA , FANCB , FANCC , FNCD1 , FANCD2 , FANCE , FANCF , FANCG , FANCI , FANCJ , FANCL , FANCM , FANCN , FANCO , FANCP And PANCQ . The most common groups are the FANCA and FANCC. However due to this genetic heterogeneity, molecular diagnosis of this change is complex. In order to test a diagnostic strategy, the present study aimed to identify the most frequent mutations in the FANC gene by PCR and restriction enzyme digestion and investigate mutations in the FANCA gene, using the polymerase chain reaction followed by enzymatic digestion of the mutation Brazilian and subsequent sequencing of the 43 exons in 60 patients with Fanconi Anemia positive DEB. 19 patients (27.94%) were detected as group C and 16 patients as group A (23.53%). The ?3788 - 3790 mutation in the FANCA gene had an allelic frequency of 15.4%. Three intronic mutations, one synonymous mutation and one mutation changed direction in FANCA gene were found. No correlation with hematologic, renal, low weight manifestations of congenital malformations members, butches and skin pigmentation, age and sex were found / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

As Síndromes mielodisplásicas (SMD) são doenças clonais da célula progenitora hematopoética, cursando com citopenias, medula óssea displástica e tendência à evolução para leucemia. As SMD secundárias estão associadas a fatores de risco como doenças congênitas (Anemia de Fanconi), doenças hematológicas adquiridas (aplasia medular, HPN), exposição à quimioterápicos (alquilantes, inibidores de topoisomerase II) e radioterapia e substâncias químicas (benzeno, petróleo). Agentes imunossupressores associados ou não a fatores hemopoéticos particularmente utilizados para tratamento da Aplasia medular também se associam à SMD secundária. A OMS recentemente adotou o termo síndrome mielodisplásica/neoplasia mielóde (SMD/NM) relacionada à terapêutica para englobar casos de neoplasias mielóides que preencham critérios morfológicos não somente de SMD, mas também de leucemia mielóide aguda (LMA) ou neoplasias mieloproliferativas. O objetivo do trabalho foi analisar dados clínicos, morfológicos e citogenéticos de 42 portadores de SMD/NM secundária em uma coorte de pacientes diagnosticados no SH-HCFMUSP no período de 1987 a 2008. Vinte e três pacientes (54,8%) eram homens, com mediana de idade de 53,5 (4-88) anos. 45,2% eram portadores de doenças onco-hematológicas, 26,2% de anemia aplástica, 14,3% de tumores sólidos e 14,3% de outras doenças (auto-imunes e transplante de órgãos sólidos). 33% dos pacientes utilizaram exclusivamente QT, 26% combinação QT e RT, 2% RT isolada e 28% agentes imunossupressores. Cinco (11,9%) pacientes haviam sido submetidos a TCTH autólogo para tratamento de doença oncohematológica prévia. A mediana da latência entre a doença primária e a SMD secundária foi de 85 meses (23- 221 meses). Oito pacientes foram submetidos ao TCTH alogênico aparentado para tratamento da SMD secundária. Anemia, neutropenia, plaquetopenia e blastos circulantes foram observados em 64,3%, 54,8%, 78,6% e 26,2% dos casos respectivamente. Cerca de 1/3 dos aspirados medulares apresentavam hemodiluição, 29,7% apresentavam hipocelularidade global, 62,2% apresentavam contagem de blastos superior a 5% e 14,3% sideroblastos em anel acima de 15%. Displasia da série eritróide, granulocítica e megacariocítica foi observada em 79,4%, 77,1% e 68,2% dos casos respectivamente. A histologia medular realizada em 22 casos revelou hipocelularidade global, ALIPs e nódulos linfóides em 9,1%, 23,8% e 40,9% dos casos. A detecção por imunoistoquímica de células CD34>1%, CD117>1%, agrupamento de células CD34+ e de CD117+ e da proteína p53+ foi observada respectivamente em 77,2%, 82,3%, 59%, 29,4% e 33,3% dos casos. Anormalidades clonais foram observadas em 84,3% dos casos, com grande predomínio das não balanceadas (96%), sendo 37% com monossomia 7, 44,4% cariótipos complexos e 18% com outras anormalidades . A mediana de sobrevida de sobrevida global foi de 5,7 meses, pacientes submetidos ao TCTH alogênico para tratamento da SMD/NM secundária tiveram mediana de 40 meses (p=0,007). Fatores associados à pior sobrevida incluíram: doença oncohematológica prévia, baixa contagem plaquetária, elevação de DHL e ferritina, presença de células CD117+ agrupadas, imunoexpressão positiva da p53, citogenética anormal, IPSS intermediário II ou alto risco. Nenhum parâmetro estudado do aspirado medular se associou à sobrevida. Houve tendência à associação da imunoexpressão positiva de p53 a cariótipo anormal e IPSS de maior risco. Não se observou associação entre a presença de ALIP, porcentagem de blastos na morfologia medular e células CD34+ e CD117+. Estes dados reforçam a importância da análise citogenética e da imunoistoquímica da biópsia de medula óssea para diagnóstico e prognóstico das SMD secundárias e do TCTH alogênico no seu tratamento. Mais estudos com maior número de casos devem ser realizados para confirmar a importância do escore IPSS na SMD secundárias, provavelmente substituindo a porcentagem de blastos ao aspirado medular, pela presença de células precursoras detectadas por imunoistoquímica / Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal hematopoietic stem cell disorders, characterized by cytopenias, dysplastic bone marrow (BM) and propensity to progress to acute myeloid leukemia. Secondary MDS are associated with risk factors such as congenital disorders (Fanconis anemia), acquired bone marrow failures, exposure to chemotherapy (alkylating agents, topoisomerase II inhibitors) agents and radiation and chemicals (benzene, petroleum). Immunosuppressive agents associated with hematopoietic growth factors are also associated with secondary MDS. The WHO classification has recently adopted the term therapy-related myeloid neoplasms for cases of myeloid malignancies that fulfill morphological criteria not only for MDS but also for AML or myeloproliferative neoplasms.The aim of the study was to analyze clinical, morphological and cytogenetic features of 42 patients with secondary MDS/MN in a cohort of patients diagnosed at our institution from 1987 to 2008. 23 patients (54.8%) were male, median age 53.5 (4-88) years. 45.2% had primary hematologic malignancies, 26.2% aplastic anemia, 14.3% solid tumors and 14.3% other diseases (autoimmune diseases and solid organ transplantation). 33% had undergone chemotherapy alone, 2% RT alone, 26% both modalities and 28% immunosuppressive agents. Five (11.9%) patients had undergone autologous HSCT for treatment of previous malignancies. The median latency between the primary disease and secondary MDS/MN was 85 (23-221) months. Eight patients underwent allogeneic HSCT (allo- HSCT) for treatment of related secondary MDS. Anemia, neutropenia, thrombocytopenia and peripheral blasts were observed in 64.3%, 54.8%, 78.6% and 26.2%, respectively. BM aspirates was poorly representative in 1/3 of cases, 29.7% global hypocellularity, 62.2% more than 5% of blast counts and 14.3% more than 15% of ring sideroblasts. Dysplasia in erythroid, granulocytic and megakaryocytic series was observed in 79.4%, 77.1% and 68.2%, respectively. Twenty two BM biopsies were performed. Global hypocellularity, ALIP and lymphoid nodules were shown in 9.1%, 23.8% and 40.9%. The immunohistochemistry showed more than 1% of CD34+ and CD117+ cells, clusters of CD34+ and CD117+ and immunoexpression of p53 protein in 77.2%, 82.3%, 59%, 29.4% and 33.3%, respectively. Clonal abnormalities were observed in 84.3% of cases with high prevalence of unbalanced (96%) rearrangements. 37% showed monosomy 7 and 44.4% complex karyotypes. The median overall survival was 5.7 for all patients and 40 months for patients treated with allo-HSCT (P=0.007). Hematologic malignancies, low platelet count, serum high LDH and ferritin, detection of CD117+ clusters, positive immunoexpression of p53, abnormal cytogenetics, intermediate-II or high-risk IPSS groups were associated with poor survival. No parameter studied from bone marrow aspirate had impact in survival. p53 expression was associated to abnormal karyotype (P=0.092) and IPSS risk (P=0.054). There was no association between the presence of ALIP, BM blast counts and immunoexpression of CD34+ and CD117+. Our study shows that cytogenetic analysis and BM immunohistochemistry are very important in diagnosis and prognosis, and that allo-HSCT could improve the survival of secondary MDS/MN. More studies with larger numbers of cases should be conducted to confirm the importance of the IPSS for secondary MDS, probably replacing the bone marrow aspirate blast counts by the immunohistochemistry detection of precursor cells