Made available in DSpace on 2016-12-12T20:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGEF14MA005.pdf: 1422256 bytes, checksum: ea323bec0bba70ce3d434c4a243ab4ce (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Acca sellowiana (Berg) Burret is a fruit tree species native to southern Brazil and northeastern Uruguay, which is attracting great interest due to the high economic potential of its organoleptic fruit. The main mode of transmission of Acca sellowiana is sexual route, so use lots of high quality seeds is one of the most important success factors of a culture. This paper aims to compare three forms of detection of fungi on seeds of Acca sellowiana - treated or not treated superficial disinfection; analyze the effect of fungi on seed quality, determine potential losses in the early development of seedlings of this species, and evaluate the efficiency of fungicides and biological control of fungi associated with seeds, especially Colletotrichum gloeosporioides, and to determine the possible harmful effects of treatments for seed germination. The seeds were from four counties in the state of Rio Grande do Sul (Arroio do Tigre, Cachoeira do Sul, Camaquã e Venâncio Aires) and three counties in the state of Santa Catarina (Concórdia, Lages e São Joaquim). The health test seed culture media Potato Dextrose Agar (PDA), V8 (tomato juice) and the method of "Blotter Test" were tested. For physiological analysis of seed germination test was carried out at 25 °C and a photoperiod of 12 h for 30 days and evaluated the percentage and speed of germination (Germination Speed Index). Initially, seeds were split, with a portion subjected to surface sterilization with 70% alcohol, 1 % sodium hypochlorite with subsequent washing in distilled water and another not. To evaluate the samples was conducted seedling emergence test in the nursery for 60 days. 200 seeds arranged in eight replicates of 25 seeds (4 replicates subjected to sterilization and 4 without sterilization) were used for each source. For control of fungi associated with seeds, we used fungicides capture, carbendazim, carbendazim + thiram, carboxim + thiram and commercial product Trichodermax (at a concentration of 1.5 x 109 viable spores per ml of Trichoderma asperellum product) at recommended doses for large crops. The experiments were conducted from the randomized design, with four replications of 25 seeds per treatment. Data were evaluated at a level of significance α = 0.05. It was concluded that agarized media are more sensitive in the detection of fungi in seeds of Acca sellowiana. Aspergillus sp. C. gloeosporioides, Fusarium sp. Penicillium sp. and Phomopsis sp. are associated with non-germinated seeds of Acca sellowiana, being detrimental to their quality. C. gloeosporioides and Fusarium sp. are transmitted from seeds to seedlings, causing necrotic lesions on cotyledons and poor root formation respectively. The chemical and biological treatments to reduce the incidence of fungal in Acca sellowiana seeds, however, chemical treatments adversely affect the germination of seeds / Acca sellowiana (Berg) Burret (goiaba-serrana) é uma espécie frutífera nativa da região sul do Brasil e nordeste do Uruguai, que vem despertando grande interesse econômico devido ao alto potencial organoléptico de seus frutos. A principal forma de propagação de goiaba-serrana é via sexuada, sendo assim, a utilização de lotes de sementes de alta qualidade é um dos fatores mais importantes para o sucesso da cultura. O presente trabalho teve por finalidade comparar três formas de detecção de fungos em sementes de goiaba-serrana submetidas ou não a assepsia superficial; analisar o efeito de fungos na qualidade das sementes, determinar os danos no desenvolvimento inicial de mudas dessa espécie, e avaliar a eficiência do tratamento de sementes com fungicidas e biológico no controle de fungos associados às sementes, em especial de Colletotrichum gloeosporioides. As sementes foram oriundas de quatro municípios do estado do Rio Grande do Sul (Arroio do Tigre, Cachoeira do Sul, Camaquã e Venâncio Aires) e de três municípios do estado de Santa Catarina (Concórdia, Lages e São Joaquim). No teste de sanidade das sementes foram testados os meios de cultura de Batata-Dextrose-Ágar (BDA), V8 (suco de tomate) e o método de Blotter Test . Para análise fisiológica das sementes foi realizado teste de germinação, a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h, por 30 dias; sendo avaliadas a porcentagem e a velocidade de germinação (Índice de Velocidade de Germinação). Inicialmente, as sementes foram subdivididas, sendo uma parte submetida à assepsia superficial com álcool 70%, hipoclorito de sódio 1% com posterior lavagem em água destilada e outra não. Para avaliação das mudas, foi realizado teste de emergência de plântulas em viveiro, por 60 dias, conduzido em bandejas. Para cada procedência foram utilizadas 200 sementes, dispostas em oito repetições de 25 sementes (4 repetições submetidas a assepsia e 4 sem assepsia). Para o controle de fungos associados às sementes, utilizaram-se os fungicidas captam, carbendazim, carbendazim + tiram, carboxim + tiram e o produto comercial Trichodermax (em uma concentração de 1,5x109 esporos viáveis de Trichoderma asperellum por ml do produto) nas doses recomendadas para culturas de lavoura. Os experimentos foram instalados a partir do delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições de 25 sementes por tratamento. Os dados foram avaliados a um nível de significância α = 0,05. Foi concluído que os meios agarizados são mais sensíveis na detecção de fungos em sementes de goiaba-serrana. Aspergillus sp., C. gloeosporioides, Fusarium sp., Penicillium sp. e Phomopsis sp. associam-se com sementes não germinadas de goiaba-serrana, sendo prejudiciais à sua qualidade. C. gloeosporioides e Fusarium sp. são transmitidos de sementes para plântulas, causando lesões necróticas nos cotilédones e má formação de raízes respectivamente. Os tratamentos químicos e biológico reduzem a incidência de fungos de sementes de goiaba-serrana, no entanto, os tratamentos químicos influenciam negativamente a germinação das sementes

O uso de antimicrobianos de forma terapêutica, preventiva e promotora de crescimento trouxe inúmeras vantagens para a avicultura mundial, entretanto a utilização excessiva dos antimicrobianos e de maneira indevida tem estimulado um aumento no número de micro-organismos resistentes. Entre eles, destaca-se o Campylobacter jejuni, bactéria frequentemente associada a enterites em humanos, sendo o frango a principal reservatório e fonte de transmissão deste patógeno para o homem. A transmissão de bactérias resistentes entre animais e seres humanos pode resultar em infecções multirresistentes e insucesso no tratamento terapêutico, sendo a exposição continua destes micro-organismos a esses medicamentos o fator mais importante na origem da resistência. Diante desse cenário, objetivou-se nesse trabalho investigar e caracterizar, através de métodos fenotípico e genotípico, a susceptibilidade antimicrobiana de 54 isolados de C. jejuni coletados em diferentes etapas do processamento da carne de frango de matadouro-frigoríficos da região do Rio Grande do Sul. Para a determinação do MIC, os isolados foram testados frente aos seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico, ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina e tetraciclina. Dos 54 isolados de C. jejuni, 94,4% foram resistentes a ciprofloxacina, 83,3% ao ácido nalidíxico, 51,8% a tetraciclina e 48% a eritromicina. Todos os isolados foram sensíveis a gentamicina e ao cloranfenicol. Doze isolados foram resistentes a três classes diferentes de antibióticos, sendo assim considerados multi-resistentes. Para verificar a presença da mutação gênica da Região Determinante de Resistência à Quinolona (RDRQ) no gene gyrA, foi realizado sequenciamento gênico de 31 isolados considerados resistentes por métodos fenotípicos. Todos os isolados possuíam a mutação Tre-86-Ile na RDRQ do gene gyrA, que confere resistência às fluoroquinolonas, confirmando a predominância dessa mutação em Campylobacter spp. resistentes a esses antimicrobianos. A ocorrência do gene de resistência à tetraciclina foi verificada por PCR. Dos 28 isolados considerados resistentes por métodos fenotípicos, 42,8% possuíam o gene tet(O), que confere resistência as tetraciclinas. Os resultados mostram um alto nível de resistência antimicrobiana em C. jejuni evidenciando a necessidade da implementação de políticas de uso prudente de antimicrobianos na medicina veterinária. / The use of antimicrobials in a therapeutic, preventive and growth promoting way has brought numerous advantages to the world poultry industry; however, the excessive and undue use of antimicrobials has stimulated an increase in the number of resistant microorganisms. Among them, we highlight Campylobacter jejuni, a bacterium frequently associated with enteritis in humans, with chicken being the main reservoir and source of transmission of this pathogen to man. The transmission of resistant bacteria between animals and humans can result in multi resistant infections and failure in therapeutic treatment, and the continued exposure of these microorganisms to these drugs is the most important factor in the source of resistance. Therefore, the aim of this study was to investigate and characterize, through phenotypic and genotypic methods, the antimicrobial susceptibility of 54 C. jejuni isolates collected at different stages of the processing of chicken meat from slaughterhouse in Rio Grande do Sul. For MIC determination, strains were tested against the following antimicrobials: nalidixic acid, ciprofloxacin, chloramphenicol, erythromycin, gentamicin and tetracycline. Of the 54 isolates of C. jejuni, 94.4% were resistant to ciprofloxacin, 83.3% to nalidixic acid, 51.8% to tetracycline and 48% to erythromycin. All isolates were sensitive to gentamicin and chloramphenicol. Twelve strains were resistant to three different classes of antibiotics, thus being considered multi resistant. To verify the presence of the gene mutation of the Quinolone Resistance Determinant Region (QRDR) in the gene gyrA, gene sequencing of 31 strains considered resistant by phenotypic methods was performed. All strains had the Tre-86-Ile mutation in the QRDR of the gyrA gene, which confers resistance to fluoroquinolones, confirming the predominance of this mutation in Campylobacter spp. resistant to these antimicrobials. The occurrence of tetracycline resistance gene was verified by PCR. Of the 28 strains considered resistant by phenotypic methods, 42.8% had the tet(O) gene. The results show a high level of antimicrobial resistance in C. jejuni that evidences the need for implementation of policies in the prudent use of antimicrobials in veterinary medicine.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a frequência dos fatores de virulência em amostras de Escherichia (E.) coli isoladas de leitões desmamados. Para a classificação de cepas de E. coli do patotipo ETEC, foram coletados suabes retais de leitões com idade entre 25-40 dias (fase de creche) com sinal clínico de diarreia, em granjas dos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, totalizando 456 amostras. Para isolamento e caracterização bacteriana, foram utilizados métodos fenotípicos e moleculares. Foi realizada a análise estatística da frequência dos fatores de virulência e dos virotipos, para as fímbrias F4, F5, F6, F18, F41 e toxinas LT, STa, STb e STx2e. Das 456 amostras analisadas, 287 apresentaram crescimento significativo de E. coli. As maiores frequências observadas foram para as fímbrias F4 e F18 e para as enterotoxinas LT, STa e STb. Os virotipos mais frequentes foram F18-STa, F4-LT-STa-STb, F4-STa, F4-LT-STb e F18-STa-STx2e. Noventa e três amostras (32,4%) não apresentaram nenhum gene dos fatores analisados. Foi observada a associação significativa entre amostras positivas para a fímbria F4 e as toxinas LT, STa e STb; entre a fímbria F18 e as toxinas STa e STx2e; entre a fímbria F5 e todas as toxinas. Os genes de toxinas mais detectados (LT, STb) apresentaram associação significativa (P<0,02). A beta-hemólise foi observada em 47,4% das amostras e houve associação (P<0,0001) entre as amostras hemolíticas e os fatores de virulência F4, F18, STa e STx2e. Em relação à consistência das fezes, observou-se associação entre as fezes com consistência líquida e F4 e STa. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a ETEC é um importante agente etiológico de diarreia em leitões desmamados. Em diversas amostras (32,4%) não foram detectados fatores de virulência, sugerindo a ação de outros fatores e/ou agentes desencadeantes de diarreia. E além destes, existem várias hipóteses para explicar esta discrepância, as quais foram revisadas neste trabalho. / The frequency of virulence factors in strains of Escherichia (E.) coli isolated from weaned piglets was assessed. For classification of the strains of enterotoxigenic pathotypes of E. coli, rectal swabs were collected from 25-40 days old nursery piglets with clinical signs of diarrhea in the states of Rio Grande do Sul, Santa Catarina and Paraná, totaling 456 samples. For isolation and bacterial characterization of the samples, phenotypic and molecular tests were used. The results of frequency of virulence factors and virotypes to fimbriae F4, F5, F6, F18, F41 and toxins LT, STa, STb and STx2e were submitted to statistical analysis. Out of 456 samples, 287 showed significant growth of E. coli. The highest frequency was observed for F4 and F18 fimbriae and LT, STa and STb enterotoxins. The most prevalent virotypes were F18-STa, F4-LT-STa-STb, STa-F4, F4-LT-STa-STb and F18-STx2e. Ninety-three samples (32.4%) were negative for virulence genes. There was a significant association between positive samples for F4 fimbriae and enterotoxins LT, STa and STb; between the F18 fimbriae and STa and STx2e; between F5 fimbriae and all enterotoxins. The most frequent toxins (LT, STb) presented significant association (P<0.02). Beta-hemolysis was observed in 47.4% of the samples and there was a association (P<0.0001) between hemolysis and fimbriae F4, F18, STa and STx2e. Regarding stool consistency, it was observed a association between liquid consistency and F4 and STa. Based on the results, it can be concluded that ETEC is an important agent of diarrhea in weaned pigs. In several samples (32.4%) virulence factors were not detected, suggesting the action of other factors and/or agents inducing diarrhea. And besides these, there are other hypotheses to explain this discrepancy, which were reviewed in this work.

Pasteurella multocida, apesar de ser uma bactéria que compõe a microbiota respiratória, sob algumas circunstâncias pode manifestar-se como um agente patogênico primário ou secundário, causando doença em aves e outros animais. Como agente primário, P. multocida leva a grandes perdas econômicas, causando cólera em aves, rinite atrófica em suínos e septicemia hemorrágica em bovinos e bubalinos. P. multocida é uma espécie heterogênea, e a patogenicidade dos isolados pode ser amplamente variável. A suscetibilidade do hospedeiro à essas cepas varia consideravelmente entre espécies. Inoculações experimentais de P. multocida em camundongos e aves são comumente usadas para avaliar a patogenicidade de diferentes cepas, mas os resultados são geralmente subjetivos e pouco mensuráveis. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma nova metodologia para classificar a patogenicidade de cepas de P. multocida, através da formulação de um índice padrão. Para determinar esse índice, foram usadas 97 amostras de P. multocida, isoladas de cólera em aves e rinite em suínos. Cem microlitros (105 UFC) de uma cultura bacteriana contendo 106 UFC/mL, de cada isolado de P. multocida foram inoculados, por via intraperitoneal, em 10 pintos de um dia. Além da mortalidade causada pela inoculação, o tempo de morte e as lesões macroscópicas foram avaliados. Diferenças significativas foram observadas entre isolados de aves e suínos em relação aos índices de patogenicidade. O número de lesões e a porcentagem de bactérias recuperadas dos animais inoculados também variaram de acordo com a origem do isolado. A partir dos indices observados, os isolados foram distribuídos em três classes de patogenicidade: alta, média e baixa. O índice de patogenicidade desenvolvido neste trabalho permite a mensuração e classificação da patogenicidade de isolados de P. multocida e pode ser uma alternativa aos modelos subjetivos de triagem de patogenicidade usados até o momento. / Pasteurella multocida, despite being a bacteria that makes up the respiratory microbiota, under some circumstances can manifest as primary or secondary pathogenic agent, causing disease in birds and other animals. As primary agent, P. multocida leads to large economic losses, causing fowl cholera in birds, atrophic rinitis in swine and haemorragic septicemia in cattle and buffalos. P. multocida is a heterogeneous specie, and the pathogenicity of the samples can be widely variable. Host susceptibility to these strains varies considerably between species. Experimental inoculations of P. multocida in mice and birds are commonly used to evaluate the pathogenicity of the different strains, but the results are generally subjective and difficult to evaluate them. The aim of this work was to establish a new methodology to classify the pathogenicity of a specific strain, through the formulation of a standard score. To determine this score, we used 97 samples of P. multocida, from fowl cholera in birds and rhinitis in swine. One-hundred microliters (105 CFU) of bacterial culture containing 106 CFU/mL of each P. multocida isolate were inoculated, by intraperitoneal route, in 10 one-day-old chicks. Besides mortality caused by the inoculation, time of death and gross lesions were also evaluated. Significant differences were observed between avian and swine isolates in relation to pathogenicity scores. The number of lesions and the percentage of bacteria recovered from the inoculated animals also varied according to the origin of the isolate. From the observed scores, the isolates were distributed into three pathogenicity classes: high, medium and low. The pathogenicity score developed here allows the measurement and classification of the pathogenicity of P. multocida isolates and can be an alternative to subjective current models of pathogenicity screening used so far.

Quatro tipos de meios de transporte comerciais (Amies, Amies com carvão, Cary Blair e Stuart) e suabes sem meio foram avaliados quanto à capacidade de conservar S. hyicus por 10 dias de armazenamento sob duas temperaturas (ambiente [20-25ºC] e refrigerada [4-8ºC]). Não foram encontrados na literatura trabalhos que avaliassem o efeito da temperatura e de meios de transporte na sobrevivência desta bactéria. Foi usado o Roll-Plate Method para o teste, utilizando uma amostra padrão de S. hyicus (ATCC 11249), de acordo com as normas do NCCLS (2003). Durante o período de 10 dias, as amostras foram armazenadas nas duas temperaturas e a seguir os suabes foram plaqueados em Ágar Tween 80 com contagem das colônias a cada 24 horas. As amostras conservadas em todos os meios de transporte apresentaram desempenho significativamente superior (P ≤ 0,05) quando mantidas em refrigeração. A conservação no Amies refrigerado foi superior a todos os outros tipos de meios e suabes (P ≤ 0,05). Na temperatura ambiente, o meio Amies e os suabes mantidos sem meio de transporte foram similares (P > 0,05), sendo os melhores nesta temperatura. Adicionalmente, o meio Amies refrigerado demonstrou alta performance até nove dias de armazenamento e os suabes sem meio até três dias. Coletivamente, a alta performance em meio Amies refrigerado indicou ser este o mais adequado para o transporte de amostras de S. hyicus. No entanto, devido à resistência à dessecação da bactéria e em função da praticidade e baixo custo, poderiam também ser indicados suabes sem meio de transporte, mantidos na temperatura ambiente. Esta forma de envio seria viável quando a previsão de tempo para o transporte ao laboratório for menor que 48 horas, pois nesta forma de conservação houve sobrevivência adequada até 72 horas. / Four commercial transport media (Amies, Amies with charcoal, Cary Blair and Stuart) and swabs without transport medium were assessed regarding their capacity to preserve S. hyicus for periods of up to 10 days at two different temperatures (room temperature [20-25ºC] and refrigerated [4-8ºC]). We did not find in the literature information on the effect of temperature and transport media for the survival of this bacteria. The Roll-Plate Method was used with a reference strain of S. hyicus (ATCC 11249), following recommendation of NCCLS (2003). The samples were stored for 10 days in two temperatures and after that, swabs were plated in Tween 80 Agar, counting bacterial colonies at each 24 hours. Samples held in all transport media showed significantly better performance (P ≤ 0.05) in refrigeration. Storage in refrigeration in Amies medium performed better than all other transport media and swabs (P ≤ 0.05). In room temperature, Amies medium and swabs without transport medium worked similarly (P > 0.05), and presented the bests results in this temperature. Additionally, refrigerated Amies medium showed high performance for up to nine storage days and swabs without transport medium for up to three days. Collectively, the high performance in refrigerated Amies medium indicated that this is the most suitable medium for shipping of S. hyicus. However, considering S. hyicus resistance to desiccation, easiness of transportation and low cost, swabs without transport medium could also be indicated, when stored at room temperature. This form of shipment could be viable when the time predicted to transport to the laboratory would be smaller than 48 hours, since this form of preservation showed survival for up to 72 hours.

Membros termofílicos do gênero Campylobacter são reconhecidos como importantes enteropatógenos para o ser humano e animais. A grande diversidade ecológica destes microorganismos em diferentes habitats tais como: água, animais e alimentos predispõem ao aparecimento de novos fatores de virulência. Este trabalho teve por objetivo detectar os genes codificantes da Toxina Distensiva Citoletal (CDT) por meio da técnica de PCR, pesquisar a atividade de hemolisinas e a influência de soluções quelantes e de íons nesta atividade. Foram utilizadas 45 amostras de C. jejuni de origem avícolas para pesquisa de atividade hemolítica, cultivadas em Caldo Triptona de Soja (TSB). Após o crescimento bacteriano, as amostras foram semeadas em Ágar tríptico de soja (TSA) contendo 5% de sangue de ovino, equino e bovino, sendo cada sangue testado isoladamente. Para verificar a influência de agentes quelantes e solução de íons na atividade hemolítica, as amostras de C. jejuni foram cultivadas em TSB contendo separadamente os quelantes EDTA, ácido acético, soluções de íons CaCl2 , MgCl2 e FeCl3, em atmosfera de microaerofilia. Quanto à atividade de hemolisina de Campylobacter jejuni em placas de TSA – sangue, foi possível observar que houve hemólises em 48,89% das amostras quando utilizado sangue eqüino, em 40% em sangue de bovino e em 31,11% quando de ovino. Quanto à influência de agentes quelantes e íons em caldo TSB na atividade de hemolisinas em amostras de Campylobacter jejuni semeadas em placas de TSA – sangue ovino, foi observada atividade hemolítica em 26,67% quando utilizado CaCl2, 15,55% (FeCl3), 22,22% (EDTA), 11,11% (MgCl2) e apenas 2,22% (ácido acético). No tocante à atividade hemolítica, o TSA - sangue bovino apresentou 15,55% (CaCl2), 24,44% (FeCl3), 26,26% (EDTA), 20% (MgCl2) e 11,11% (ácido acético). A atividade hemolítica para o sangue equino foi de 24,44% (CaCl2), 22,22% (FeCl3), 28,89% (EDTA), 28,89% (MgCl2) e 8,89% (ácido acético). Para detecção dos genes cdtA, cdtB e cdtC através da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), foram utilizadas 119 amostras de C. jejuni de origem avícolas. Foi possível observar que 38% possuíam os três genes, e foram identificados somente os genes cdtA e cdtC em 19% do total de amostras, sendo que o gene cdtB foi encontrado em 14%, o gene cdtC foi observado em 12%, os genes cdtA e cdtB em somente 1%, os genes cdtB e cdtC em 1% e para cdtA em 1%. Observou-se que os resultados são dignos de atenção, pois demonstraram em amostras avícolas a presença de estirpes de C. jejuni com potencial virulento. A atividade hemolítica apresentou significativo aumento quando utilizado sangue de origem equina. A mesma foi diminuída quando utilizados agentes quelantes ou íons, nos três tipos de sangue. / Thermophilic members of the Campylobacter genus are recognized as important enteropathogenics for humans and also for other animals. The great diversity of ecological habitats in different organisms such as water, food, and animals may promote new virulence factors. This study aimed at detecting the distending cytolethal toxin (CDT) encoding genes by PCR, studying the activity of hemolysin and also the influence of chelation solutions and ions. A total of 45 samples of C. jejuni from poultry origin, grown in Tryptone Soy Broth (TSB) were used for investigating hemolytic activity. After bacterial growth, samples were plated on Tryptic Soy Agar (TSA) containing 5% sheep, equine or bovine blood, being each blood tested individually. In order to check the influence of chelation agents and ions solution on the hemolytic activity, samples of C. jejuni strains were grown in TSB containing chelation agents individually: EDTA, acetic acid, CaCl2 ion, MgCl2 and FeCl3 solutions, all in microaerophilic atmosphere. Regarding the detection of Campylobacter jejuni hemolysin activity on TSA plates, blood hemolysis were observed in 48.89 % of samples when equine blood was used; in 40% of samples when bovine blood was used and in 31.11 % when the blood used was of sheep origin. The influence of ions and chelation agents in hemolysin activity in TSB when Campylobacter jejuni was plated on TSA with sheep blood can be described as: hemolytic activity was observed at 26.67% of samples when CaCl2 was used, at 15.55 % for FeCl3, 22 22 % for EDTA, 11.11 % for MgCl2 and only 2.22% when acetic acid was used. The hemolytic activity detected when bovine blood - TSA was used indicated 15.55% for CaCl2, 24.44% for FeCl3, 26.26 % for EDTA, 20 % for MgCl2 and 11.11% for acetic acid. In terms of the hemolytic activity when equine blood was used, the results indicated 24.44% for CaCl2, 22.22 % for FeCl3, 28.89 % for EDTA, 28.89 % for MgCl2 and 8.89% for acetic acid. Finally, regarding the detection of cdtA, cdtB and cdtC through PCR, 119 samples of C. jejuni from poultry origin were used. The results indicated that all three genes were present in 38 % of the samples, whereas only two genes were identified in 19 % of samples, while the cdtB gene was singly found in 14%, the cdtC gene was independently observed in 12%, cdtA and cdtB genes together were found in 1% of the samples; the cdtB and cdtC genes associated were detected in 1%, while cdtA alone answered for 1% of detections. The results also showed the presence of C. jejuni strains with virulence potential. The hemolytic activity increased significantly when blood of equine origin was used, and that this activity was reduced when ions or chelating agents were used in combination with the three types of blood cells.

A Doença Infecciosa da Bolsa de Fabrício (DIB) é uma doença viral altamente contagiosa que afeta as galinhas nas primeiras semanas de vida. Ela pode causar altas taxas de morbidade e mortalidade dependendo da cepa viral envolvida no surto. Como o vírus é muito resistente no ambiente, a vacinação é requerida em alta pressão de infecção. Devido às variações no grau de virulência das vacinas disponíveis para o controle da DIB, o presente estudo objetivou avaliar a patogenicidade e imunogenicidade de três vacinas comerciais: as vacinas recombinante, complexo-imune e intermediária. Quatro grupos com 55 aves specific pathogen free (SPF) cada foram imunizadas no primeiro dia e desafiadas aos 25 dias com a cepa muito virulenta G11 para verificar o grau de proteção conferido pelas vacinas. As aves foram examinadas, sangradas, eutanaziadas e necropsiadas aos 25, 30 e 35 dias de idade. As bolsas de Fabrício (BF) foram coletadas, pesadas, mensurados seus diâmetros e pesos relativos e submetidas ao exame histopatológico para verificar a presença de lesões. Amostras de soro foram submetidas ao teste de ELISA para quantificação dos anticorpos contra a DIB. Aos 23 dias de idade, as aves SPF foram submetidas à prova de hipersensibilidade cutânea à fitohemaglutinina para avaliar o efeito das vacinas sobre a imunidade celular. Os resultados mostraram que a vacina complexo-imune induziu a maior redução no peso relativo e diâmetro e o maior grau de lesões nas BF. A vacina recombinante foi a que apresentou os melhores resultados, preservando a integridade tecidual e celular das BF. A vacina intermediária apenas induziu um discreto grau de atrofia nas BF. As análises sorológicas, antes do desafio, revelaram que as três vacinas testadas induziram com a mesma intensidade a imunidade humoral das aves SPF, apresentando semelhantes títulos de anticorpos. A avaliação da imunidade celular mostrou que a resposta à fitohemaglutinina das aves SPF imunizadas com as vacinas recombinante e complexo-imune foi menor do que as aves do grupo não vacinado. Nas condições em que o experimento foi conduzido verificou-se que a vacina complexo-imune é a mais patogênica, causando lesões em maior número e severidade nas BF. Todas as vacinas, quando administradas no primeiro dia, são eficazes em proteger as aves SPF contra o desafio com a cepa muito virulenta G11. / Infectious Bursal Disease (IBD) is a highly contagious viral disease that affects chickens in their first weeks of life. It may cause high morbidity and mortality depending on the strain involved in the outbreak. As the virus is very resistant to the environment, vaccination is required under high pressure of infection. Hence, due to variations in the degree of the virulence of vaccines available to control DIB, this study aimed to evaluate the pathogenicity and immunogenicity of three vaccines against Infectious Bursal Disease (IBD): recombinant, immune-complex and intermediate vaccines. Four experimental groups, with fifty-five specific pathogen free (SPF) chickens each, were vaccinated on the first day and challenged on the twenty-fifth day with the very virulent G11 strain in order to verify the protection conferred by the vaccines. The Chickens were examined, bled, euthanized and necropsied on the twenty-fifth, thirtieth and thirty-fifth days of age, and the Bursas of Fabricius (BF) were collected, weighed, having their diameter and relative weight measured, were subjected to histological examination to verify the presence of lesions, Serum samples were subjected to ELISA for the quantification of antibodies against IBD. On the twenty-third day of age, the chickens were submitted to cutaneous basophil hypersensitivity test at phytohemagglutinin to evaluate the immunosuppressive effect of the vaccines on the cell-mediated immunity. The results indicated that the immune-complex vaccine induced not only the greatest reduction in relative weight and diameter, but also the greatest lesion degree on the BF. The recombinant vaccine showed the best results, preserving the tissue and cellular integrity of the BF. The intermediate vaccine induced only a slight degree of atrophy on the BF. The intermediate vaccine induced only a slight degree of atrophy on the BF. The serological analyses, before the challenge, revealed that the three tested vaccines induced humoral immunity of SPF chickens with the same intensity, presenting similar antibody titers. In addition, the evaluation of the cellmediated immunity demonstrated that the cellular reaction to phytohemagglutinin of the immunized SPF chickens with the recombinant and immune-complex vaccines was smaller than the unvaccinated group. Thus, these results have indicated that, under the conditions of the experiment, the immune-complex vaccine is the most pathogenic, causing the highest atrophy degrees on the BF. Therefore, all vaccines, when administered on the first day, are considered effective to protect SPF chickens against the challenge with the very virulent G11 strain.

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a influência do uso precoce de antimicrobianos na microbiota intestinal, resposta imune e ocorrência de diarreias em bezerras recém-nascidas. Foram selecionadas 26 bezerras Holandesas distribuídas de acordo com a aplicação (ATB+) ou não (ATB-) de tulatromicina (2,5 mg/Kg - SC) até 12h de vida. Capítulo 1 Este capítulo avaliou a influência do uso precoce de antimicrobiano na sanidade de bezerras holandesas recém-nascidas, por meio do exame clínico geral. As diarreias foram detectadas por sistema de escore e matéria seca (%) nas fezes, além do escore respiratório e palpação externa da região umbilical. O desempenho das bezerras foi determinado pela estimativa do ganho de peso. As bezerras ATB- apresentaram maior frequência de mucosas esbranquiçadas (P=0,066) e inflamações umbilicais no ATB- em D3-5 (P=0,063) e D13-15 (P= 0,066). A frequência de escore fecal 2 e 3 foi semelhante entre os grupos, observando-se pico no D13-15. Os valores médios para matéria seca (%) foram menores no ATB+ no D7-9 (P=0,063) e D27-30 (P=0,084). O agente etiológico das diarreias foi o Cryptosporidium e/ou rotavírus. O ganho de peso diário (GPD) foi igual entre grupos, observando-se intensa redução no GPD em D13-15. Capítulo 2 O objetivo deste capítulo foi avaliar a influência do uso precoce de antimicrobianos na colonização bacteriana intestinal, por meio da detecção de material genético dos principais grupos bacterianos por meio do PCR em tempo real. Não foram observadas diferenças entre os grupos para bactérias totais e C. perfringens. As bezerras ATB- apresentaram maior quantidade de Bifidobacterium, nas fezes no D3-5 (P=0,002) e D7-9 (P=0,018). A população de Lactobacillus também apresentou tendência (P=0,097) para maior número de cópias de DNA no grupo ATB-. Ao contrário, a Escherichia coli apresentou tendência para maiores valores no grupo ATB+ no D20-23 (P=0,052) e D27-30 (P=0,072). Capítulo 3 O objetivo deste capítulo foi avaliar a influência do uso precoce de antimicrobianos no perfil inflamatório de bezerras holandesas recém-nascidas por meio de provas hematológicas, imunológicas, bioquímicas e eletroforéticas. Observou-se tendência para menores valores de hemoglobina (P=0,071), CHCM (P=0,057) e ferro sérico (P=0,051) no D3-5 no ATB-. Neste momento, a frequência de anemias também foi maior no ATB- (P=0,016). O número de neutrófilos (P=0,051) e a produção espontânea de EROs foi maior no ATB-, enquanto o número de linfócitos foi maior no ATB+ (P=0,061) no D7-9. Estes dados são condizentes com as análises imunes, no qual a proporção de populações de mononucleares 1 e 2 expressando o CD62L+ apresentou tendência para maior valor no ATB+ em D3-5 (P=0,098) e D7-9 (P=0,083). Após as diarreias (D13-15), os granulócitos (P=0,043) e mononucleares (P=0,089) das bezerras ATB+ apresentaram maior intensidade de fluorescência para expressão CD62L no D20-23. O grupo ATB+ também apresentou maiores teores de beta-globulina (P=0,057), gama-globulina (P=0,069) e haptoglobina (P=0,032) no D13-15. O uso precoce de tulatromicina influenciou na microbiota intestinal, imunidade inata e ocorrência de doenças no período neonatal. / The general goal of this research was to evaluate the influence of early antimicrobial use in the gut microbiota, immune response and occurrence of diarrhea in neonate heifers. It was screened 26 neonate Holstein heifers distributed according to the application (ATB+) or not (ATB-) of tulathromycin (2.5mg/Kg - SC) from birth until 12 hours of life. Chapter 1 This chapter evaluated the influence of early use of antimicrobial in the health of neonate Holstein heifer by general clinical examination. Diarrheas were detected using score system and fecal dry matter (%), besides of respiratory score and external palpation of navel region. The performance of calves was evaluated by daily weight gain. Heifers ATB- had high frequency of paleness mucous (P=0.066) and umbilical inflammation in ATB- group on D3-5 (P=0.063) and D13-15 (P= 0.066). The frequency of fecal score 2 and 3 was similar between groups, observing peak of diarrhea on D13-15. The mean values of fecal dry matter were low in ATB+ group on D7-9 (P=0.063) and D27-30 (P=0.084). The main etiologic agent of diarrheas was Cryptosporidium and/or rotavírus. The daily weight gain (DWG) was similar between groups, observing intense decrease of DWG on D13-15. Chapter 2 The aim of this chapter was to evaluate the influence of early use of antimicrobial in the microbial gut colonization by detection of genetic bacterial material using real time PCR. It was not found difference between groups for total bacteria and C. perfringens. The calves from ATB- group had high quantity of Bifidobacterium in the fecal material on D3-5 (P=0.002) and D7-9 (P=0.018). The Lactobacillus population had a tendency (P=0.097) to have high number of DNA copies in the ATB- group. On the other hand, Escherichia coli had tendency to high values in ATB+ group on D20-23 (P=0.052) and D27-30 (P=0.072). Chapter 3 The aim of this chapter was to evaluate the influence of early use of antimicrobial in the inflammatory profile of neonate Holstein heifers by hematological, immunological and biochemical tests, besides electrophoresis. It was possible to observe lower values of hemoglobin (P=0.071), CHCM (P=0.057) and serum iron (P=0.051) in ATB- group on D3-5. In this moment, the frequency of anemia also was high in ATB- group (P=0.016). The number of neutrophils (P=0.051) and spontaneous ROSs was high in ATB- group, while the number of lymphocytes was high in ATB+ group (P=0.061) on D7-9. These data were according to immune analysis, where the proportion of mononuclear population 1 and 2 expressing CD62L+ had a tendency for high values in ATB+ group on D3-5 (P=0.098) and D7-9 (P=0.083). After diarrhea (D13-15), granulocytes (P=0.043) and mononuclear cells (P=0.089) showed high fluorescence intensity of CD62L in ATB+ heifers on D20-23. ATB+ group also had high rate of beta globulin (P=0.057), gamma globulin (P=0.069) and haptoglobin (P=0.032) on D13-15. The early use of tulathromycin had influence on gut microbiota, innate immunity and occurrence of disease in the neonatal period.

A Salmonella sp permanece com um dos mais importantes patógenos transmissores de enfermidades veiculadas através dos alimentos em todo mundo. A carne de aves está entre as principais causadoras das toxinfecções alimentares quando contaminadas pelo gênero Salmonella. Neste estudo foram isolados 280 sorovares de Salmonella das carcaças de frango e peru através do Programa de Redução de Patógenos (PRP-MAPA) na região sul do país. A maior prevalência ocorreu para a Salmonella Enteritidis (55,7%). Nas carcaças de frango, a S. Enteritidis alcançou 63,3% dos isolados, porém nas carcaças de peru este sorovar não passou dos 14,0%. Entre os estados do sul (PR, SC e RS), não houve diferenças nos isolados de S.Enteritidis. Foram 25 os sorovares de Salmonella sp isolados das carcaças de aves. Destes apenas 14 em perus e 23 nos frangos. A S. Tennessee e Salmonella enterica subespecie enterica (O: 4,5), foram isoladas somente em carcaças de perus e a S. Hadar foi a mais prevalente, 18,6%. Nos testes de difusão em placas, foram desafiadas 178 cepas frente a 24 antimicrobianos. Todas as cepas de Salmonella sp foram resistentes a bacitracina e a penicilina e 78,2% apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano quando excluídas as drogas anteriormente citadas, sendo que todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico, polimixina B, ciprofloxacina e norfloxacina. A maior taxa de resistência das amostras foi observada frente ao ácido nalidíxico de 52,2%, seguido da nitrofurantoína (28,8%), neomicina (14,6), tetraciclina (12,4%) e canamicina (10,1%). Nas amostras isoladas de perus estes índices foram maiores para o ácido nalidíxico (62,8%), tetraciclina (34,9%) e neomicina (30,2%), havendo diferenças significativas para os dois últimos quando comparados aos isolados de frango. Embora o índice de resistência a enrofloxacina de 2,2% no segmento aves seja baixo, chama atenção que, por tratar-se de um antimicrobiano quimicamente modificado a taxa de resistência nas amostras de perus tenha sido de 9,3%.O sorovar S. Enteritidis apresentou a maior taxa de resistência ao ácido nalidíxico (72,0%) e menor para tetraciclina (1,1%). Por outro lado, foi comprovada a presença de cepas multiresistentes em 46,1% dos isolados das carcaças de aves, principalmente nas amostras de perus nos sorovares S. Hadar e S. Saintpaul, que foram resistentes no mínimo a quatro e no máximo onze antimicrobianos. Este estudo demonstrou qual a prevalência e o perfil de resistência aos antimicrobianos dos sorovares de Salmonella sp isoladas das carcaças de aves na região Sul do Brasil e devido a sua importância em saúde animal e saúde pública, pode sugerir a criação de um Programa Nacional de Monitoramento da Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos. / Salmonella sp remains as one of the most important foodborne pathogens worldwide. Poultry meat is among the most frequently involved foods regarding human food poisoning cases. In this study, two hundred and eighty Salmonella isolates were detected from broiler and turkey carcasses submitted to the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA)´s Pathogens Reduction Program (PRPMAPA) in Southern Brazil. Twenty five Salmonella serovars were isolated in the poultry carcasses, being 14 in turkey and 23 in broilers. The most prevalent serovar was Salmonella Enteritidis (57,7%). In broiler carcasses, S. Enteritidis reached a 63,3% prevalence, while in turkeys carcasses this serovar presented a comparatively lower index (14,0%). Among the Brazilian Southern States (PR, SC and RS) there were no significative differences in the percentage of isolated S. Enteritidis. S. Tennessee and Salmonella enterica subspecies enterica (O: 4,5) were isolated in turkeys, but not in broiler carcasses. S. Hadar was most prevailing in turkeys (18,6%). Regarding the diffusion test applied to 178 isolates, they were challenged against 24 antimicrobials. As expected, all isolates were resistant to bacitracin and penicillin, while 78,2% presented resistance to at least one antimicrobial drug when the ones above were excluded. All samples were sensitive to amoxicillin + clavulanic acid, polymixin B, cyprofloxacin and norfloxacin. The highest resistance rate was observed against nalidixic acid (52,2%), followed by nitrofurantoin (28,8%), neomycin (14,6%), tetracycline (12,4%) and canamycin (10,1%). In turkeys the rates were higher to nalidixic acid (62,8%), tetracycline (34,9%) and neomycin (30,2%) showing significant differences for the latter two when compared to the ones isolated in broilers. S. Enteriditis isolates showed a higher resistance to nalidixic acid (72,0%) and lower to tetracycline (1,1%). Presence of multiresistant isolates was proven in 46,1% of the isolated poultry carcasses, mainly in the turkey samples related to the presence of S. Hadar and S. Saintpaul serovars, which were resistant to at least four to a maximum of eleven antimicrobials. This study was able to demonstrate the prevalence and the antimicrobial resistance profile of Salmonella serovars isolated from poultry carcasses in Southern Brazil. These findings reinforce the need for the creation of a National Antimicrobial Resistance Monitoring Programme in Brazil, which will be able to contribute to an overdue controlled use of these drugs in food producing animals.