[pt] A maioria das pesquisas científicas publicadas sobre sequenciamento da produção na indústria automobilística consideram os pedidos já alocados em um dia ou turno de trabalho, desconsiderando especificidades do planejamento da cadeia de suprimentos. Esta dissertação procura contribuir no campo do planejamento da produção, propondo um modelo matemático de programação inteira mista que aborda de maneira integrada dois problemas de otimização fundamentais da cadeia: o problema de seleção de pedidos e o problema de sequenciamento de carros em uma única linha de montagem. A fim de abordar questões bem próximas a realidade, incluindo apresentação de experimentos numéricos com o modelo proposto, utilizou-se como cenário o segmento de caminhões, dentro da indústria automotiva. Considerou-se, como objetivo no modelo, além das abordagens tradicionais (minimizar sobrecarga de trabalho, troca de cores e violação de restrições), a demanda dos clientes com relação a prazos de entrega do pedido – principal reforço para uma indústria que pretende cada vez mais migrar para um ambiente de produção orientado pela demanda. / [en] Most published scientific research on production sequencing in the automotive industry consider orders already allocated in a day or shift, disregarding specificities of supply chain planning. This paper aims to contribute in production planning field, proposing a mathematical model of mixed-integer programming that addresses in a integrated way two fundamental problems from chain: the problem of order selection and car sequencing problem on a single assembly line. In order to approach practical issues, including presentation of numerical experiments from proposed model, the truck segment within the automotive industry was used as scenario. It was considered as objective in the model, beyond traditional approaches (minimize work overload, color changing and violation of restrictions), customer demand with respect promised due dates, the main reinforcement for an industry that increasingly want migrate to a production environment driven by demand.

Deficiência intelectual (DI) é um distúrbio frequente do neurodesenvolvimento que afeta ~1% da população mundial e a causa genética é desconhecida em grande parte dos casos. O sequenciamento de exoma é uma ferramenta valiosa na elucidação da etiologia da DI e foi utilizada neste trabalho para investigar 25 famílias com dois ou mais indivíduos afetados. Nosso objetivo foi identificar novos genes ou variantes em genes já conhecidos que pudessem explicar a DI nessas famílias. Identificamos variantes que podem explicar a DI em nove das 25 famílias (36%); três variantes em genes já associados a DI de herança autossômica dominante (SETBP1, MED13L e MBD5), duas em um gene já associado a DI de herança autossômica recessiva (CDK5RAP2 - heterozigose composta) e cinco em genes de herança ligada ao X (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). Nenhuma dessas variantes havia sido previamente descrita. O gene ARHGAP4 aparece como um novo candidato e novos estudos serão necessários para estabelecer seu papel na DI. No gene PHF6, a variante identificada mapeia na região 3´UTR e potencialmente interfere com as interações de miRNA reguladores. A variante no gene SETBP1, que apresenta padrão de herança dominante, foi detectada em duas irmãs, indicando que um genitor seria portador obrigatório; essa variante foi detectada em 0,13% das células de sangue periférico da mãe com a utilização da técnica de PCR digital. Essa variante em SETBP1, juntamente com as variantes em MED13L e no gene MBD5, salientam a contribuição de mosaicismo gonadal assim como genitor também com quadro clínico na DI de herança autossômica dominante. A repetição da DI nas irmandades foi essencial para determinar a patogenicidade das variantes identificadas do tipo missense. Dois irmãos portadores de variante missense ainda não descrita no gene UBE2A apresentavam quadro clínico atipicamente leve, trazendo dúvidas sobre a patogenicidade dessa variante; o estudo funcional do gene demonstrou que a mutação de fato prejudicava a função da proteína. Embora estudos funcionais sejam o padrão-ouro para determinar a patogenicidade de uma variante, é difícil sua implementação na rotina diagnóstica / Intellectual deficiency (ID) is a common neurodevelopmental disorder affecting ~1% of the world population, and in which the genetic underlying condition is not determined in many cases. Whole exome sequencing is a valuable tool to elucidate ID etiology and was used in the present work to investigate 25 families with two or more affected individuals. Our main goal was to identify either new genes or variants in already known genes that might explain ID in these families. We detected variants in nine out of the 25 families (36%), with three variants in autossomal dominant ID genes (SETBP1, MED13L e MBD5), two in an autossomal recessive ID gene (compound heterozygote - CDK5RAP2) and five in X-linked ID genes (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). None of the variants had been previously described. ARHGAP4 emerged as a new candidate gene and further studies are needed to establish its role in ID. In PHF6, the identified variant mapped to the 3\'UTR region and potentially interferes with miRNA interactions. The variant in SETBP1, which segregates as an autossomal dominant, is present in two sisters, indicating that one parent is an obligate carrier; in fact, the variant was only identified in 0.13% of the mother\'s blood cells after using digital PCR. This case, together with the variants in MED13L and MBD5, highlight the contribution of gonadal mosaicism and affected parent in the autossomal dominant ID. The ID reccurrence in the sibships was essential to determine the putative pathogenicity of missense variants. Two affected brothers carrying a novel missense variant in UBE2A exhibited an atypically mild phenotype, and raised questions regarding the pathogenicity of this variant; associated functional studies showed that the variant impairs gene function. Although functional studies are the gold standard to determine a variant pathogenicity, its implementation as a diagnostic routine is still difficult

O coronavírus canino (CCoV) causa gastroenterite em cães jovens, podendo ser letal, sobretudo quando há coinfecção com parvovírus canino (CPV). Os objetivos do presente projeto foram investigar a presença de CCoV e CPV em amostras fecais de cães jovens; estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV com base em sequenciamento parcial dos genes M, S, 3b e N, incluindo amostras vacinais, e estudar a evolução in vitro de CCoV em células A72 de fibroma canino. Foram detectados 40,17% (47/117) animais positivos para CCoV e 13,68% (16/117) para CPV. Estudos filogenéticos demonstraram que oito amostras foram classificadas como CCoV-II, vinte e cinco como CCoV-I. Análises para o gene M destacaram alta identidade de CCoV-I com amostras de coronavírus da peritonite infecciosa felina (PIF) e uma possível amostra pantrópica foi demonstrada pela análise do gene S. O gene do nucleocapsídeo de CCoV é altamente conservado entre os tipos I e tipo II, com uma resolução mais baixa em relação a árvores para os genes M e S. Amostras dos tipos I e II apresentam um polimorfismo baixo para o gene 3b, sem marcadores estáveis para diferenciação dos tipos de CCoV. Uma amostra de CCoV-II putativamente pantrópica foi isolada em células A72, resultando em efeito citopático no 5o dia da 5a passagem. No estudo evolutivo, a amostra vacinal CCV 1-71 e nove passagens desta em células A72 foram submetidas a amplificação parcial e clonagem molecular do gene S seguida de sequenciamento de DNA. Os resultados mostraram mutações não silenciosas, silenciosas e três deleções de aminoácidos, mas nenhuma mutação compartilhada entre as diversas passagens. Amostras vacinais de CCoV-II adaptadas em células podem ser altamente geneticamente estáveis após passagens em série em uma mesma linhagem celular, acumulando substituições de nucleotídeos principalmente sinônimas no gene S devido a relação célula - hospedeiro estável. Estes resultados de epidemiologia molecular e processos evolutivos de CCoV podem servir para uma melhor compreensão da virologia básica e ser base de dados para estudos em outros coronavírus / Canine coronavirus (CCoV) causes gastroenteritis in young dogs and can be lethal, especially when there is co-infection with canine parvovirus (CPV). The objectives of this project were to investigate the presence of CCoV and CPV in stool samples from young dogs, the molecular diversity of CCoV strains based on partial sequencing of genes M, S, N and 3b, and the in vitro evolution of CCoV in A72 canine fibroma. Of the fecal samples studied, 40.17% animals (47/117) were positive for CCoV and 13.68% (16/117) for CPV. Phylogenetic studies have shown that eight strains were CCoV-II and twenty five CCoV-I. Phylogenetic analysis for the M gene highlighted the high identity of CCoV-I strains with a feline coronavirus strain (FCoV) that causes feline infectious peritonitis (FIP). Further analysis based on the spike gene showed a putative pantropic CCoV strain (CCoV-II/dog50). CCoV nucleocapsid gene is highly conserved among type I and type II, with a lower resolution relative to trees based on M and S genes. CCoV Types I and II had a low polymorphism for 3b gene, without any stable markers to differentiate thee types. Regarding the virus isolation trial, a putative pantropic CCoV-II strain was successfully isolated in A72 cells from, resulting in cytopathic effect on the 5th day of the 5th passage. In the evolutionary study, the vaccine strain CCV 1-71 and nine passages of this strain in A72 were submitted to partial S gene amplification and molecular cloning followed by DNA sequencing. Missense, silent, and three amino acids deletions were found amongst diverse clones of each passage, but no mutation was repeatedly found among passages. Cell culture-adapted CCoV-II vaccine strains can be highly genetically stable upon serial passage in a same cell line, accumulating primarily synonymous nucleotide substitutions in the S gene due to a stable cell-host relationship. In short, all data gathering herein on molecular epidemiology and evolutionary processes of CCoV can serve for a better understanding of basic virology and as a basis for studies on other coronaviruses

Dengue é uma doença viral que atinge vários países, infectando milhares de pessoas anualmente. Sua transmissão ocorre pelo repasto sanguíneo feito pelas fêmeas dos mosquitos Aedes sp. infectadas e seus sintomas tem um amplo espectro de variação, que vão desde quadros assintomáticos até quadros graves com hipovolemia, podendo levar a óbito. A necessidade de adaptação do vírus a sistemas tão distintos (inseto e mamífero) restringe o espectro de variabilidade que o mesmo pode adquirir, permitindo que o vírus se adapte a ambos os hospedeiros com eficiência replicativa semelhante. Estudos com outros flavivírus já mostraram que a aquisição de variabilidade ocorre de maneiras distintas no hospedeiro mamífero e no inseto vetor, permitindo ao vírus máxima adaptação nas células infectadas. Levando em consideração estes estudos, este trabalho investigou a adaptação de duas cepas do vírus da dengue, a ACS-46, não neurovirulenta para camundongos adultos e a cepa JHA, neurovirulenta para camundongos adultos. O estudo foi feito utilizando cultura de células de mosquito (C6/36), cultura de células de mamífero (HepG2) e infecção em cérebro de camundongos neonatos. Utilizando sequenciamento de nova geração, foi possível verificar as mutações adquiridas ao longo de passagens em cada sistema de cultura. Foram realizadas 20 passagens seriadas em célula C6/36 e seis passagens alternadas entre C6/36 e HepG2. Os vírus obtidos na décima sexta e vigésima passagens do modelo seriado e na quarta e sexta passagens do modelo alternado foram completamente sequenciados utilizando a plataforma de sequenciamento em larga escala Ion Torrent. A análise das sequências revelou duas populações virais claramente distintas, já observadas a partir de décima sexta passagem, identificadas através da deleção de dois códons no sítio de glicosilação do domínio I da proteína de Envelope. Essa deleção induziu aumento na fusão do vírus à célula de mosquito, visto que a partir dessa passagem houve aumento no efeito citopático do vírus e na carga viral produzida durante infecções em células de mosquito. Contudo, essa mutação teve um perfil deletério em células humanas, fato deduzido pelo total desaparecimento da população com a deleção durante as passagens alternadas. Além desta deleção, foram detectadas sete mutações não sinônimas em região de proteínas não estruturais com porcentagens muito próximas, sugerindo que as mesmas fazem parte de uma mesma população. A cepa JHA teve seu caráter neurovirulento perdido após 29 passagens em C6/36, porém rapidamente recuperado após uma única passagem em cérebro de camundongo neonato. O sequenciamento dos vírus dessas passagens mostrou certa variabilidade em sítios distintos entre as variantes do vírus parental, vírus não neurovirulento e vírus neurovirulento passado em camundongo. Esse resultado indicou que aparentemente, não há sítios específicos determinantes de neurovirulência em DENV2, ao menos no nosso modelo, mas sim, um conjunto de mutações podem levar ao fenótipo neurovirulento, a depender das condições as quais o vírus é exposto. / Dengue is a viral disease that affects several countries, infecting thousands of people annually. It is transmitted by blood meal of the female Aedes sp mosquitoes infected. Symptoms have a wide range of variation, ranging from asymptomatic to severe symptoms, including hypovolemia and death. The need for adaptation in such distinct systems (insect and mammalian) restricts the variability that the viruses can acquire, allowing them to adapt to both hosts with similar replicative efficiency. Studies performed with other flaviviruses have shown that acquisition of variability occurs differently between the mammalian host and the insect vector, allowing the virus to adaptat in both systems. Therefore, this study investigated the adaptation of two strains of dengue virus, the ACS-46, not neurovirulent for adult mice and JHA strain, which is neurovirulent for adult mice. The study was done using mosquito cells culture (C6/36), mammalian cells (HepG2) and in vivo infection in newborn mouse brain. Using next-generation sequencing, we analyzed the mutations acquired over passages in each culture system. Twenty serial passages were conducted in C6/36 cells and six alternate passages between C6/36 and HepG2. Viruses obtained in the sixteenth and twenty passages from the serial experiment and the fourth and sixth passages from alternate model were completely sequenced using the next generation sequencing platform Ion Torrent. Sequence analysis revealed two clearly distinct viral populations observed from the sixteenth passage identified by deletion of two codons in the glycosylation site in the envelope protein domain I. This deletion led to increased fusion of the virus to mosquito cell, since the cytopathic effect increased from this passage to next as well as the viral load. However, this mutation had a deleterious profile in human cells since the mutated population was vanished during the alternate passages. It was also identified seven non-synonymous mutations in the region of nonstructural proteins with very similar percentages, suggesting that they belong to the same population. JHA strain lost the neurovirulent characteristic after 29 passages in C6/36, but quickly recovered it after a single passage in newborn mouse brain. The sequencing of the virus of these passages showed some variability in different sites among the parental virus, not neurovirulent viruses and neurovirulent virus after the single passage in mice. These data indicated that apparently there is no specific determinants of neurovirulence in DENV2, at least in our model, but rather a set of mutations can lead to neurovirulent phenotype, depending on the conditions in which the virus is exposed.

O eucalipto é amplamente cultivado em diversos países, dentre os quais, o Brasil se destaca pela sua alta produção. A cultura tem grande importância comercial e atende à uma ampla variedade de setores do mercado, entre eles o de celulose. Apesar disso, a cultura ainda está nas fases iniciais de domesticação devido, principalmente, ao seu longo ciclo reprodutivo e tempo de rotação, uma vez que os cortes são feitos entre 5 e 15 anos. A aplicação de tecnologias de marcadores moleculares é uma proposta promissora para acelerar o melhoramento do eucalipto. Com o desenvolvimento de metodologias modernas de sequenciamento tornou-se acessível a obtenção de grande quantidade de marcadores a baixo custo. Uma das aplicações de tais marcadores é a construção de mapas genéticos de ligação, os quais permitem a caracterização genética de caracteres quantitativos, além de estudos comparativos entre populações e o auxílio na montagem de genomas. No presente trabalho, objetivou-se a construção de um mapa genético integrado em uma progênie F1 segregante com 200 indivíduos, proveniente do cruzamento entre Eucalyptus grandis e Eucalyptus urophylla. Para identificação dos marcadores, foi realizado o ressequenciamento do genoma completo (WGS) dos genitores e a genotipagem por sequenciamento (GBS) da progênie. A metodologia de construção de mapa foi adaptada para o conjunto de dados obtido, que apresenta grande quantidade de marcadores do tipo SNP, pouco informativos e com maior probabilidade de erro comparado com os marcadores tradicionais mais utilizados nos últimos anos. Para isso foram propostas duas estratégias: i) utilização da posição dos marcadores no genoma de referência para auxílio na ordenação dos marcadores no mapa; ii) alteração do parâmetro de probabilidade de erro da abordagem implementada no software Onemap. O mapa obtido apresentou padrão de taxa de recombinação semelhante a outros mapas construídos para eucalipto. O mapa apresentou tamanho total de 1471.91 cM e 1512 marcadores, com distância média entre eles de 1.85 cM. Os marcadores formaram 11 grupos de ligação, que corresponderam aos cromossomos do genoma de referência. Em média, foram cobertos 96.8% dos cromossomos. Também foram agrupados, junto aos 11 grupos, 61 marcadores localizados em outros scaffolds no genoma de referência, os quais podem servir para elucidação na montagem destes. Utilizando as estratégias propostas, foi obtido um mapa integrado adequado para o experimento em questão, considerando o tamanho da população de mapeamento. / The eucalyptus is widely cultivated in several countries, among which Brazil is highlighted by its high production. This culture has great comercial importance and supplies a wide variety of markets, including cellulose. However, the culture is still in the early stages of domestication due, mainly, to its long reproductive cycle and rotation time, since cuts are made between 5 and 15 years. The application of molecular marker technologies is a promising proposal to accelerate the improvement of eucalyptus. By the development of modern sequencing methodologies it was possible to obtain a large quantity of markers at low cost. One of the applications of such markers is the construction of genetic linkage maps, which allow the genetic characterization of quantitative traits, as well as comparative studies between populations and the support in the assembly of genomes. In the present work, the aim was to construct an integrated genetic map in a segregating F1 progeny with 200 individuals, derived from the cross between Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla. For the identification of the markers, it was performed a complete genome re-sequencing (WGS) of the parents and genotyping-by-sequencing (GBS) of the progeny. The mapping methodology was adapted to the obtained data set, which presents a large amount of SNP-type markers, with little information and with a greater probability of error compared to the most used traditional markers in the last years. For this, two strategies were proposed: i) use of the position of the markers in the reference genome to aid in the ordering of the markers on the map; ii) change of the error probability parameter in the approach implemented in the software Onemap. The obtained map showed recombination rate pattern similar to other maps constructed for eucalyptus. The map presented a total size of 1471.91 cM and 1512 markers, with a mean distance between them of 1.85 cM. The markers formed 11 linkage groups, which corresponded to chromosomes of the reference genome. On average, 96.8 % of chromosomes were covered. 61 markers located in other scaffolds in the reference genome were grouped with the 11 groups. They may serve to elucidate the assembly of these. Using the proposed strategies, a suitable integrated map was obtained for the present experiment, considering the size of the mapping population.

As modificações das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são uma etapa essencial na aterogênese pois acarretam a geração de LDL eletronegativa [LDL(-)] que apresenta propriedades quimiotática, citotóxica, imunogênica e pró-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi a produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-LDL(-), a clonagem dos genes que codificam para as cadeias variáveis destes anticorpos, e sua expressão como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv). A LDL(-) isolada de plasma humano foi utilizada como antígeno para imunização de camundongos BALB/c. Após triagem dos clones, dois anticorpos monoclonais foram obtidos baseados em sua reatividade pela LDL( -) e não pela LDL nativa: 1A3H2 (1A3) e 2C7D5F10 (2C7). Os cDNAs codificante para a cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL), de ambos os anticorpos, foram obtidos por meio de RT-PCR utilizando bibliotecas de oligonucleotídeos que reconhecem todas os genes de domínios variáveis das famílias de VH e VL murinas. Os genes da VH e VL obtidos foram clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega®) e suas seqüências determinadas. A VH do anti-LDL(-) 1A3 pertence família J558.84 e fragmento gênico JH2, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A VH do anti¬-LDL(-) 2C7 pertence a família Vmu 3.2 (J558) e fragmento gênico JH4, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A partir disso, oligonucleotídeos sintéticos foram sintetizados a fim de clonar estes segmentos gênicos no vetor pPlgLE de expressão em Pichia pastoris. Foram realizadas três construções: o scFv 1A3, scFV 2C7 e um scFv híbrido (VH do 1A3 e VL do 2C7). Das três construções obtidas, conseguimos expressar o scFv do anti-LDL 2C7D5F10 que demonstrou ser capaz de reconhecer o antígeno. A proteína recombinante expressa tem grande potencial de ser usada no diagnóstico clínico incluindo imunoensaios in vitro e como reagentes para exames que envolvam a obtenção e análise de imagens. / Oxidative modification of low-density lipoproteins (LDL) is an essential step in atherogenesis, generating electronegative LDL [LDL(-)], which has chemotactic cytotoxic, immunogenic and proinflammatory properties. The aim of this study was the generation of anti-LDL(-) mAbs, the cloning of the genes that code for their variable domains and their expression as single-chain Fv (scFv). LDL(-) was isolated from human blood plasma and used as an antigen for immunization of Balb/c mice. Upon screening, two different mAbs were selected based on their ability to recognize LDL(-) and not native LDL: 1A3H2 (1A3) e 2C705F10 (2C7). The cDNAs that code for VH and VL were obtained by RT-PCR using specific immunoglobulin primer libraries wich recognize all VH and VL murine families. The VH and VL genes were cloned in pGEM-T Easy (Promega®) and sequenced. The anti-LDL(-) 1A3 uses a VH segment from J558.84 and a JH2 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. The anti-LDL(-) 2C7 uses a VH segment from Vmu 3.2 (J558) and a JH4 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. Oligonucleotides were synthetized and those gene segments were cloned in pPIGLE a Pichia pastoris immunoglobulin expression vector. We obtained three scFv constructions: scFV 1A3, scFv 2C7 and a husk hybrid, harboring 1A3 VH and 2C7 VL. Among those, we expressed the scFv anti¬-LDL(-) 2C7 that are able to recognize the antigen. The recombinant protein has a great potential for clinicai diagnostic applications, including in vitro immunoassays and as imaging reagents.

Objetivos: Analisar por meio da técnica de sequenciamento direto a presença de alterações moleculares nos genes SHH, SIX3, ZIC2 e TGIF1 em indivíduos com diagnóstico clínico de HPE. Analisar por meio da técnica de CGH-array a presença de alterações moleculares em indivíduos com diagnóstico clínico de HPE previamente submetidos à análise por sequenciamento direto. Local: Laboratório de Genética e Citogenética Humana HRAC/USP, Bauru-SP. Casuística e metodologia: Foram selecionados 50 indivíduos, de ambos os sexos com idades entre 03 meses a 50 anos com diagnóstico clínico para HPE. Todos foram analisados por meio da técnica de sequenciamento direto para os genes SHH e TGIF1 completamente e para os genes ZIC2 e SIX3 parcialmente. Dentre os indivíduos que não apresentaram alterações na técnica de sequenciamento oito indivíduos com fenótipo mais grave foram selecionados para a análise por CGH-array. Resultados e discussão: Foram analisados 50 indivíduos por meio da técnica de sequenciamento direto dos gene SHH e TGIF1, foram encontradas duas variantes patogênicas na análise do gene SHH, no caso 1 a variante p.24G>P foi identificada, e no caso 2 foi identificada a variante c.1031del C. No gene TGIF1 foram encontrados cinco polimorfismos já descritos na literatura. Foi identificada uma nova variante silenciosa no éxon 1 do gene ZIC2 p.Q46Q (c. 431 G>A) e um polimorfismo já descrito na literatura em dois indivíduos no gene SIX3. A análise por CGH-array revelou a presença de uma microdeleção no caso 37, de 1,5Mb no cromossomo 17p12 entre as posições genômicas 14,052,279-15,102,307. A mesma deleção foi encontrada na mãe, sendo que esta região nunca foi associada a HPE. Conclusão: A técnica de sequenciamento direto é uma ferramenta muito importante no diagnóstico molecular da HPE, a padronização do sequenciamento direto para os genes ZIC2 e SIX3 poderá auxiliar em diagnósticos mais precisos em estudos futuros dentro do HRAC/USP. O emprego de novas técnicas como CGH-array pode indicar novas relações entre regiões cromossômicas e os múltiplos fatores envolvidos na formação da HPE. / Objective: Analyze through direct sequencing technique the presence of molecular changes on the genes SHH, SIX3, ZIC2 and TGIF1 on individuals with clinical diagnosis of HPE. Analyze through array-CGH technique the presence of molecular changes on individuals with clinical diagnosis of HPE previously submitted to the direct sequencing analyzes. Local: Genetics and Human Cytogenetics Laboratory, HRAC/USP, Bauru-SP. Methods: Were selected 50 individuals from both genders with ages between 03 months and 50 years clinically diagnosed with HPE. Everyone was analyzed through the direct sequencing technique for the genes SHH and TGIF1 completely and for the genes ZIC2 and SIX3 partially. From those individuals which did not have shown changes on the direct sequencing technique, eight individuals with more severe phenotype were selected to the analysis through array-CGH. Results an Discussion: Were analyzed 50 individuals through the technique of direct sequencing of the genes SHH and TGIF1, were found two pathogenic variants in the analysis of SHH gene, in the case 1, the variant p.G24P was identified, and in the case 2 was identified the variant c.1031delC. On the TGIF1 gene were found five polymorphisms already described on the literature. Was identified a new silent variant on the exon 1 of the ZIC2 gene p. Q46Q(c.431G>A) and a polymorphism already described in the literature in two individuals on the gene SIX3. The analysis through array-CGH revealed the presence of one microdeletion in the case 37, of 1,5 Mb on the region 17p12 between the genomic positions 14,052,279-15,102,307. The same deletion was detected in the mother, though this region was never associated to the HPE. Conclusion: The direct sequencing technique is a very important tool for the molecular diagnosis of the HPE, and the direct sequencing standardization for the genes ZIC2 and SIX3 might help in more precise diagnostics on HRAC/USP future studies. The employ of new techniques such as array-CGH may indicate new relations between chromosomal regions and the multiple hit involved in the development of HPE.

A xilanase e a α-amilase são enzimas responsáveis por degradar parte da matéria orgânica nos solos, atuando na mineralização da hemicelulose e do amido, respectivamente. Do ponto de vista biotecnológico, estas enzimas, assim como os subprodutos gerados pela sua ação enzimática, podem ser utilizados em diversos setores industriais. Os manguezais podem representar uma fonte promissora e inexplorada para a busca de enzimas microbianas em função das altas quantidades de matéria vegetal em decomposição presente neste ecossistema, onde ocorrem condições ambientais únicas, representadas pela combinação da anaerobiose e salinidade. No presente trabalho, métodos independentes e dependentes de cultivo microbiano foram utilizados para a bioprospecção de enzimas xilanolíticas e amilolíticas em um ambiente de manguezal. A partir da triagem funcional de uma biblioteca metagenômica foram obtidos 3 clones xilanolíticos. Estes foram sequenciados e os reads utilizados para montagem dos contigs e posterior anotação dos genes. Uma das ORFs geradas da anotação do contig MgrBr135 foi utilizada para subclonagem em vetor de expressão demonstrando atividade amilolítica. A análise filogenética do contig MgrBr135 mostrou afiliação da mesma ao filo Planctomycetes. Por meio do método dependente de cultivo, foram isolados 44 bactérias xilanolíticas do solo de manguezal. Destas, 73% apresentaram índices enzimáticos (IE) elevados quando submetidos ao teste qualitativo (cup plate). A estirpe bacteriana 11 foi a que se destacou das demais por ter apresentado IE de 10,9. Quando submetidas ao teste quantitativo, o isolado 39 se destacou produzindo uma atividade enzimática de 0,43 U/mL. O sequenciamento parcial do gene 16S rRNA das estirpes permitiu a identificação dos isolados como pertencentes a dois gêneros: Bacillus e Paenibacillus. Estes resultados destacam a importância de estudos sobre as bactérias encontradas nos manguezais, e indicam os grupos bacterianos que hospedam estas características, o que deve dar maior suporte a exploração deste recurso como ferramentas biotecnológicas, a serem utilizadas na degradação da hemicelulose e amido. / Xylanase and α-amylase are enzymes that degrade organic matter, acting in the mineralization of hemicellulose and starch, respectively. These enzymes, as well as the byproducts generated by them, can be used in various industrial sectors. Mangroves represent a promising and untapped source of microbial enzymes due to the high content of decomposing organic matter present in this ecosystem, where unique environmental conditions prevail, represented by the combination of anaerobiose and salinity. In this study, independent and dependent microbial cultivation methods were used for bioprospecting xylanolytic and amylolytic enzymes in a mangrove environment. Through the functional screening of a metagenomic library, 3 xylanolytic clones were obtained. These clones were sequenced, and the reads were used for contig assembly followed by gene annotation. One of the ORFs generated by the annotation of contig MgrBr135 was used for subcloning into the expression vector, showing later amylase activity. Phylogenetic analysis of contigs MgrBr135 indicated its affiliation to the phylum Planctomycetes. Through the cultivation dependent method, 44 xylanolytic bacteria were isolated from mangrove soil. From these, 73% had considerable enzymatic index (EI) when subjected to the qualitative test (cup plate). The bacterial strain 11 was the one that stood out from the others because it presented the highest EI, 10.9. When subjected to quantitative test, the isolated 39 stood out producing an enzyme activity of 0.43 U/mL. The partial 16S rRNA gene sequencing of the strains allowed the characterization of two genera: Bacillus and Paenibacillus. These results highlight the importance of studying the bacterial community found in mangroves, and indicate the bacterial groups hosting these features, supporting further exploitation of this resource as biotechnological tools that can be used in the degradation of hemicellulose and starch.

Mitocôndrias são organelas semi-autônomas responsáveis pela respiração celular. Diversas fontes de evidências indicam a origem endossimbiótica dessas organelas, onde um organismo unicelular teria engolfado um organismo procariótico, possivelmente uma α-proteobactéria. Durante a coevolução do endossimbionte e sua célula hospedeira, ocorreu uma redução do genoma do endossimbionte, parte dos genes sendo perdida e parte transferida para o núcleo. A organização e o tamanho do genoma mitocondrial é bastante variável nas diferentes linhagens filogenéticas. O acúmulo de dados moleculares ajuda a esclarecer a origem e evolução das mitocôndrias. Até o momento, foram sequenciados os genomas mitocondriais de apenas três espécies de Rhodophyta, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae e Porphyra purpurea. As algas vermelhas são economicamente importantes por serem utilizadas principalmente como alimento e para as extrações de polissacarídeos e pigmentos acessórios. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia é uma macroalga vermelha que apresenta grande tolerância a fatores ambientais e alta taxa de crescimento, sendo utilizada como organismo modelo em estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, incluindo o sequenciamento do genoma completo do cloroplasto feito anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa. Este estudo teve como objetivo o sequenciamento completo do genoma mitocondrial de G. tenuistipitata, a análise dos genes presentes e a comparação entre os genomas mitocondriais de Rhodophyta e de outros organismos fotossintetizantes disponíveis no GenBank. Para isso, foram realizadas extrações de DNA total para as amplificações por PCR, para posterior sequenciamento por primer walking e montagem do genoma mitocondrial completo de G. tenuistipitata. A sequência completa do genoma mitocondrial circular da alga vermelha G. tenuistipitata possui 25.565 nucleotídeos e conteúdo CG de 27%. Foram identificados 50 genes, que incluem sete subunidades do complexo NADH desidrogenase (nad 1-6, nad 4L), três do complexo sucinato desidrogenase (sdh 2-4), o gene apocitocromo b (cob), três subunidades da citocromo c oxidase (cox 1-3), três do complexo ATP sintase (atp 6,atp 8-9), cinco genes para proteínas ribossômicas (rps 3, rps 11-12, rpl 16, rpl 20), três genes para RNA ribossômico (rrn 5, rnl, rns) e 22 para RNA transportador. Um intron do grupo II está inserido no tRNA para histidina. Os genes mitocondriais de G. tenuistipitata estão organizados em dois conjuntos codificados um em cada fita do DNA, em direções de transcrição opostas. O genoma mitocondrial de Gracilaria tenuistipitata é bastante compacto, com poucas regiões intergênicas e utiliza um código genético modificado. O conteúdo de genes e sua ordem no genoma mitocondrial de G. tenuistipitata são extremamente semelhantes ao de C. crispus e os genomas mitocondriais de ambas apresentam identidade de nucleotídeos superior a 70% em todas as análises realizadas. Essa semelhança pode ser explicada pelo fato de ambas as algas pertencerem à mesma classe, Florideophyceae. As quatro espécies de Rhodophyta comparadas neste trabalho possuem os componentes básicos da cadeia respiratória e síntese de ATP, além de algumas proteínas ribossômicas e de um conjunto quase completo de tRNAs e rRNAs. Este trabalho corrobora estudos filogenéticos anteriores em relação às algas vermelhas, evidenciando que G. tenuistipitatae C. crispus são mais próximos entre si e igualmente distantes de P. purpurea, e que C. merolae se encontra em uma posição mais basal. / Mitochondria are semi-autonomous organelles responsible for cellular respiration. Many sources of evidence indicate the endosymbiotic origin of these organelles, in which an unicellular organism engulfed a prokaryotic organism, possibly an α-proteobacteria. During the endosymbiont and its host coevolution, the endosymbiont genome was reduced by gene loss and gene transfer to the nucleous. The mitochondrial genome size and organization varies within different phylogenetic lineages. The accumulation of molecular data helps to elucidate the origin and evolution of mitochondria. So far, only three species of Rhodophyta had their mitochondrial genome totally sequenced, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae and Porphyra purpurea. Red algae are economically important due to their use as food and for the extraction of polysacarids and accessory pigments. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia is a red macroalgae very tolerant to environmental changes and shows high growth rates, being used as model organism in physiological, biochemical and molecular studies, including the sequencing of the whole chloroplast genome done by our research group. This study aimed the sequencing of the whole mitochondrial genome of G. tenuistipitata, the analysis of its gene content and the comparison within mitochondrial genomes of Rhodophyta and other photosynthetic organisms available at the GenBank. For that, total DNA was extracted for PCR amplifications, which were sequenced using primer walking and assembled to obtain the complete mitochondrial genome of G. tenuistipitata. The whole mitochondrial circular genome sequence of the red algae G. tenuistipitata was determined (25.565 nucleotides, C+G content 27%). Fifty genes were identified, including seven NAD H dehydrogenase complex subunits (nad 1-6, nad 4L), three succinate dehydrogenase complex subunits (sdh2-4), the apocytochrome b gene cob), three cytochrome c oxidase subunits (cox1-3), three ATP synthase complex subunits (atp6, atp8-9), five ribosomal proteins (rps3, rps11-12, rpl16, rpl20), three ribosomal RNA genes (rrn5, rnl, rns) and 22 tRNAs. One group II introns was found between the tRNA sup His /SUP. The mitochondrial genes of G. tenuistipitata are organized in two groups translated each one in each strand, in two opposite directions. The mitochondrial 13 genome of Gracilaria tenuistipitata is quite compact, with few intergenic regions and uses a modified genetic code. The gene content and its order in the mitochondrial genome of G. tenuistipitata are extremely similar to the C. crispus mitochondrial genome, and both genomes presented nucleotide identity above 70% in all the analyses. This similarity between the mtDNA of both species can be explained by the fact that both belong to the same class, Florideophyceae. The four Rhodophyta species compared in this study have the essencial components for the respiratory chain and ATP synthesis, besides some ribosomal proteins and almost all of the tRNAs and rRNAs. This work corroborate previous phylogenetic studies about red algae, showing that G. tenuistipitata and C. crispus are more closely related between each other than to P. purpurea, and that C. merolae is in a basal position.

O gênero Anacardium L. é composto por um número relativamente pequeno de espécies arbóreas e arbustivas, dentre elas Anacardium occidentale L., única espécie cultivada e distribuída em todo o mundo tropical. O Brasil é o provável centro de origem, com dois centros de diversidade identificados. Neste trabalho, duas regiões gênicas comumente empregadas (ITS1 e trnL) foram utilizadas para avaliar a diversidade intra e interespecífica do gênero. Há evidências de variação intraespecífica principalmente para a região ITS1, que dificulta as reconstruções filogenéticas, uma vez que relativamente pouca variação interespecífica foi detectada para as espécies avaliadas. Para a região trnL, há uma evidência de que essas regiões podem identificar diferenças entre os centros de diversidade do gênero. Os agrupamentos observados nas árvores sugerem o mesmo tipo de agrupamento já descrito na literatura por taxonomia numérica. No entanto, mais dados devem ser avaliados para testar essa evidência. / The genus Anacardium L. is composed by a relatively small number of species, being A. occidentale the only species that is cultivated and distributed in all tropical regions. Brasil is probably the center of origin, with two different diversity centers. Here, two genic regions commonly used (ITS1 e trnL) were employed to evaluate the diversity present between and within species of the genus. The results showed evidences of the existence of intraspecific variation, mainly for the ITS1 region, which can difficult the phylogenetic reconstructions, since small variation was observed among the analysed species. The trnL region showed an evidence that this region could be used to discriminate the two diversity centers. The groups obtained suggest the same groups observed in the literature by numerical taxonomy. However more data is necessary to test those evidences.