Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-15Bitstream added on 2014-06-13T21:03:48Z : No. of bitstreams: 1 provazzi_pjs_dr_sjrp.pdf: 1081709 bytes, checksum: 9a35b9ad50fc4eed266a481d830f02de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:10:06Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_dgl_me_sjrp.pdf: 2024541 bytes, checksum: 9e617f882421a4dd2f2cc715da6fb79f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Toxins isolated from vemos have been used as molecular tools to understand many physiological processes. The enzymes isolated from the venoms of Crotalus and Bothrops species interfere with the control and balance of the hemostatic system (PEREZ et al., 1996) and thus, the determination of their structures is potentially very important. These enzymes are serine proteinases that are similar to tyrpsin in their specificity but are generally referred to as thrombin-like enzymes due to their ability to cleave fibrinogen. The principal aim of this project was to isolate and characterize snake venom poteins that inetefere with the control and regulation of the hemostatic system in quantities and purity required for structural studies. Gel filtration, ion-exchange and HPLC chromatographic techniques were used to isolate convulxin, crotoxin, giroxin and crotamine, the principle components from the venoms of Crotalus durissus collineatus and Crotalus durissus terrificus and the serine and metalo proteinases from the venom of Bothrops jararaca. The purity of the samples was evaluated by SDS-PAGE and the specific activity of the samples was determined. Crystallization experiments were then carried out.

A fosforilação reversível de proteínas em resíduos de serina e treonina, catalisada por quinases e fosfatases desempenha papel chave na regulação do crescimento e na diferenciação celular em eucariotos. As serina/treonina proteínas fosfatases (PSTPs) são atualmente divididas em três famílias denominadas PPP (PhosphoProtein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) e FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase), sendo que os membros da família PPP são, frequentemente, holoenzimas compostas de uma subunidade catalítica associada a uma ou mais subunidades reguladoras, as quais definem a função, localização e especificidade ao substrato da fosfatase. Neste trabalho, analisamos, através de RT-qPCR, o perfil de expressão dos genes codificadores de subunidades catalíticas de PPPs de Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c e PP5c) e de 16 potenciais parceiros moleculares de algumas destas subunidades catalíticas, tais como DdI-2 e DdI-3, sabidamente inibidores da PP1c. Em resposta ao estresse térmico de células da fase de crescimento, detectamos o aumento dos níveis de transcritos de PP4c e PP6c e também de DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194, esta última, uma proteína de função desconhecida que interage com a PP1c em ensaios de duplo-híbrido em leveduras. Por outro lado, durante o estresse hiper-osmótico observamos a diminuição dos níveis de transcritos de quase todos os genes analisados com exceção de DdI-2 e DDB_G0292194. O nível de expressão de DdPP1c, DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194 também foi analisado em resposta ao estresse oxidativo e apenas o DDB_G0292194 foi induzido nesta condição. Os genes de PP1c, PP4, PP5c e PP6c são expressos durante todo o ciclo de vida de D. discoideum, mas a expressão de alguns dos genes analisados aumenta em uma fase definida do ciclo de desenvolvimento como é o caso de DDB_G0292194 que tem níveis de transcritos aumentados na fase de agregação. Este gene codifica uma proteína hipotética de 559 aminoácidos, que apresenta um domínio FHA (ForkHead-Associated) em sua região aminoterminal, além de uma sequência similar ao motivo consenso de ligação à PP1c. Ensaios no sistema de duplo-híbrido em leveduras confirmaram que a interação entre DDB_G0292194 e DdPP1c independe do domínio FHA. Verificamos, também, que o mutante nocaute de DDB_G0292194 apresenta uma morfologia alterada em condições padrões de cultivo, tanto na fase de crescimento como durante o desenvolvimento, além de uma maior sensibilidade ao estresse oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio quando comparado à linhagem selvagem. Em conjunto, nossos resultados evidenciam a importância das PPPs na resposta a diferentes tipos de estresse e para o crescimento e desenvolvimento de D. discoideum. / Reversible phosphorylation of proteins on serine and threonine residues, catalyzed by kinases and phosphatases plays a key role in growth and cell differentiation regulation in eukaryotes. Protein serine/threonine phosphatases (PSTPs) are currently divided into three families named PPP (Phosphoprotein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) and FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase). The PPP family members are often holoenzymes composed of a catalytic subunit associated with one or more regulatory subunits, which define function, localization and substrate specificity of the phosphatase. In this work, we have examined, by RT-qPCR, the expression profile of genes encoding PPP catalytic subunits of Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c and PP5c) and 16 potential molecular partners for some of these catalytic subunits, such as DdI-2 and DdI-3, both known as PP1c inhibitors. In response to heat stress of growth phase cells, we detected increased levels of transcripts of PP4c and PP6c as well as of DdI-2, DdI-3, and DDB_G0292194, the latter a protein of unknown function that interacts with PP1c in yeast two-hybrid assays. Moreover, during the hyperosmotic stress we observed decreased transcript levels of nearly all genes examined except DdI-2 and DDB_G0292194. The expression level of DdPP1c, DdI-2, DdI-3 and DDB_G0292194 was also analyzed in response to oxidative stress and only DDB_G0292194 was induced in this condition. PP1c, PP4c, PP5c and PP6c genes are expressed throughout growth and development of D. discoideum while transcript levels of some the analysed genes were increased at a defined stage of the developmental cycle as in the case of DDB_G0292194, which increased during aggregation. This gene encodes a hypothetical protein of 559 amino acids bearing a FHA (ForkHead-Associated) domain in its aminoterminal region and a sequence matching the PP1c binding consensus motif. Yeast two-hybrid assays confirmed that DDB_G0292194 and DdPP1c interaction does not depend on FHA domain. We also found that DDB_G0292194 knockout mutant exibits an altered morphology on standard growth and developmental conditions and shows an increased sensitivity to oxidative stress induced by hydrogen peroxide in comparison to the wild type strain. Taken together, our results highlight the importance of PPPs in the response to different types of stress and for growth and development of D. discoideum.

La vía PI3K/AKT/mTOR participa en múltiples procesos celulares fundamentales para la célula. Algunas mutaciones genéticas de los componentes de esta vía se han asociado a diversas enfermedades humanas: las más importantes son los carcinomas de mama, tiroides y endometrio, el glioblastoma multiforme, el cáncer de próstata y los linfomas. La vía canónica PI3K/AKT/mTOR se ha estudiado ampliamente en los últimos años. Sin embargo, el conocimiento de la complejidad de sus componentes principales y su interrelación con los elementos de otras vías va en aumento. Por ello, es importantes actualizar cada cierto tiempo la información disponible para la comprensión de este mecanismo. Así mismo, se están y se han desarrollado numerosos ensayos con medicinas selectivas en búsqueda de un tratamiento más inteligente para las enfermedades asociadas a alteraciones de esta vía. Por tanto, realizamos una revisión de esta vía de transducción con el objetivo de tener una visión cercana de su funcionamiento, sus alteraciones y enumerar algunas moléculas promisorias para ser utilizadas en futuros tratamientos. / The PI3K/AKT/mTOR pathway is involved in multiple cellular processes which are essential for the cells. Some genetic mutations of the components of this pathway have been associated with various human diseases, the most important of which are breast, thyroid and endometrium carcinomas; glioblastoma multiforme; prostate cancer and lymphomas. The PI3K/AKT/mTOR canonical pathway has been extensively studied in recent years. However, as the complexity of its main components and their correlation with the components of other pathways are increasing, it is important to update from time to time the available information to understand this mechanism. Furthermore, many trials have been conducted with selective medicines aimed to look for a more intelligent treatment for diseases associated with alterations in this pathway. Therefore, we review this transduction pathway to take a close look at its functioning and alterations, and to list some promising molecules for future treatments. / Revisión por pares

Orientador: Marcos Hikary Toyama / Resumo: A giroxina é a principal serino protease encontrada no veneno total de Crotalus durissus terrificus. As serino proteases de veneno de serpentes são proteínas que apresentam uma grande similaridade estrutural com a trombina humana incluindo a alta conservação do sitio catalítico. Os resμltados já obtidos pelo nosso grupo revelaram a capacidade dos flavonoides glicosilados de Laguncularia racemosa em reduzir de forma significativa a atividade enzimática das trombinas humanas. A identificação destas molécμlas revelou que dois flavonoides glicosilados (quercetina-3-O-arabinosidio (QAra) e quercetina-3-O-ramnosidio (QRham)) respondem pela inibição da trombina (Rodrigues et al., 2015). Sabe-se que a soroterapia antiveneno não consegue neutralizar de forma eficiente a ação farmacológica das serino proteases e consequentemente não é capaz de neutralizar os danos homeostáticos e teciduais. Neste trabalho, uma nova serino protease foi isolada do veneno total de Crotalus durissus terrificus (cdtsp-2) através de quatro estapas de separação, usando a superdex 75 com uma fase móvel de bicarbonato de amônia pH 8, a cdtsp-2 Estas duas frações foram então fracionadas em coluna de troca iônica em DEAE para separação das principais frações e posteriormente fracionadas em CLAE de fase reversa para confirmar o grau de homologia molecular e em todas as etapas cromatográfica foram acompanhadas pelos ensaios enzimáticos em BApNA. A nova serino protease denominada como Cdtsp-2 (Crotalus durissus terr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gyroxin is the major serine protease present in Crotalusdurissusterrificus venom. Serine proteases from snake venom are proteins, which exhibit a great structural similarity to hμMan thrombin including the catalytic site conservation. The resμlts already obtained by our group revealed the glycosylated flavonoidsability of Laguncμlariaracemosato significantly reduce the enzymatic activity of hμMan thrombins. The molecμles identification reveals two glycosylated flavonoids (quercetin-3-O-arabinosidiμM (QAra) and quercetin-3-O-rhamnosidiμM(QRham)), which inhibit thrombin (Rodrigues et al., 2015). Antivenomserotherapycan not efficiently neutralize the serine proteases pharmacological action and is not able to neutralize homeostatic and tissue damage. In this work, a new serine protease was isolated from Crotalusdurissusterrificusvenom (cdtsp-2) by throμgh four separation stages , using superdex 75 with a mobile phase of ammoniμM bicarbonate pH 8. These two fractions were fractionated on ion exchange colμMn in DEAE for separation of the major fractions and subsequently fractionated in reverse phase CLAE to confirm the degree of molecμlar homology.All chromatographic steps were monitored by the enzymatic assays in BApNA. The new serine protease called cdtsp-2 (Crotalusdurissusterrificus serine protease 2) is an unpublished protein, with a molecμlar mass of 27 kDa and its N-terminal sequence showed structural differences when compared to the gyroxin of Crotalusdurissusterrificus. Re... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre