Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / Abstract: From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic / Mestre

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Sergio Maramgani, Claudio Augusto Machado Sampaio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:45:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leme_LucianaDiCieroToledo_D.pdf: 9158581 bytes, checksum: d80e70dba366d1980e84dad1b3b10893 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes de duas variedades de Bauhinia variegata (Legumonosae, Caesalpinoideae). A purificação dos inibidores de Bauhínia variegata variedade cândida e variedade lilás por cromatografia de troca iônica, cromatografias de exclusão molecular e subsequente cromatografia de fase reversa, evidenciaram nestas espécies 3 isoformas (BvcTI-1, 2 e 3; e BvITI-1, 2 e 3) de inibidores de proteinase com cadeia polipeptídica única. A análise global de aminoácidos resultou em 167 e 180 resíduos de aminoácidos para BvcTI-3 e BvITI-3, respectivamente, e em massa molecular calculada de 18529 para BvcTI-3 e de 20018 para BvITI-3, e 4 resíduos de cisteína para BvcTI-3 e 2 resíduos de cisteína para BvITI-3. Estes resultados incluem estes inibidores na Família' de inibidores tipo Kunitz. A coloração para inibidores de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidores com pontos isoelétricos aparentes de 4,85, 5,00 e 5,15. A determinação da estrutura primária completa de BvcTI-3 e da estrutura primária do N-terminal das isoformas de BvcTI e BvITI, confiram alta homologia com inibidores tipo Kunitz. Os inibidores BvcTI e BvlTI atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes e inibidores purificados de Bauhínia variegata var. cândida e varo. lilás foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana, sendo que estas enzimas foram fortemente inibidas pelos inibidores em estudo. O teste de edema através do extravasamento de plasma em pele de coelhos, mostrou que BvcTI potenciou a calicreína de pâncreas de porco / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Bauhinia variety cândida and Bauhinia variegata variety lilás (Leguminosae, Caesalpinoideae ). The purification of inhibitors from the Bauhinias by ion-exchange chromatography, molecular exclusion chromatography and subsequent reverse phase chromatography, showed the presence of three isoforms (BvcTI-1, 2 and 3 ; BvITI-1, 2 and 3) in the two species studied with single polypeptide chain. The aminoacid analisis of the forms BvcTI-3 and BvITI-3 resulted in 167 and 180 aminoacids residues, respectively, and the calculated molecular masses were 18529 to BvcTI-3 and 20018 to BvITI-3. It showed 4 cysteine residues to BvcTI-3 and 2 cysteine residues to BvITI-3, and no free thiol groups. This results suggest that these proteins belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for trypsin inhibitors after isoelectric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4.85, 5.00 and 5.15. The primary structure sequence of BvcTI-3 was determined, confirming the inhibitor as Kunitz type. The inhibitors BvcTI and BvlTI act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds and purifieds inhibitors of both Bauhinia variegata variety candida and Bauhinia variegata variety lilas were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. This three enzymes were strongly inhibited by both inhibitors. The oedema test in rabits showed the BvcTI made the kallikrein of porcine pancreas more potent to plasma. extravasation / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-23T13:40:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_M.pdf: 3586687 bytes, checksum: c237f07c98d63bb8fea1e7e5a22bb2b4 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A aprotinina é um inibidor de proteases presente em alguns órgãos bovinos como pâncreas, fígado e pulmão. Neste trabalho, as enzimas tripsina e quimotripsina (suínas e bovinas) foram utilizadas como ligantes imobilizados em matriz de agarose visando a recuperação de aprotinina presente em efluente de processamento industrial de insulina através de adsorção por afInidade. As quatro enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com bisoxirana e avaliadas quanto a capacidade de adsorção de aprotinina pura, o que permitiu a seleção da tripsina suína e quimotripsina bovina como os ligantes de maior efIciência. Estas proteases foram ainda imobilizadas com sucesso em gel de agarose previamente ativado com brometo de cianogênio, o que permitiu a comparação entre dois métodos distintos de ativação e imobilização de enzimas. O gel de agarose ativado com brometo de cianogênio com tripsina suína imobilizada foi o que apresentou maior capacidade de adsorção de aprotinina pura (12,6 mg!g). Estudo-se, para ambas as enzimas, a influência do pH e força iônica na adsorção e dessorção da aprotinina, em faixas próximas aos valores encontrados na literatura, através de planejamento estatístico experimental. A influência do pH mostrou ser menor para o processo de adsorção e maior para a dessorção, ocorrendo o inverso para a influência da força iônica, principalmente quando o ligante utilizado foi a tripsina. Estudos de adsorção em coluna de leito fIxo para recuperação do inibidor presente em efluente do processamento industrial da insulina produzida a partir de pâncreas bovino constataram a presença de inibição que pôde ser recuperada utilizando ambas as enzimas como ligantes. A análise do poder de inibição de tripsina e quimotripsina, bem como os ensaios de eletroforese das frações dessorvidas das colunas indicam fortemente que o inibidor recuperado é aprotinina / Abstract: Aprotinin is a protease inhibitor found in bovine organs like pancreas, lung and liver. In this work, trypsin and chymotrypsin (bovine and swine) were immobilized in agarose and used as ligands for aprotinin recovery from industrial insulin process wastewater via affinity adsorption. The enzymes were immobilized on bisoxirane activated agarose and evaluated by their aprotinin adsorption capacity. Swine trypsin and bovine chymotrypsin were chosen as the most efficient ligands. These proteases were also immobilized on cianogen bromide activated agarose allowing the comparison of the two activation methods. Swine trypsin immobilized on cianogen bromide activated agarose had the highest aprotinin adsorption capacity (12,6 mglg). The effects of pH and ionic strength on aprotinin adsorption and desorption for immobilized swine trypsin and bovine chymotrypsin were studied using a experimental design method. The effect of the ionic strength was higher than that of the pH on aprotinin adsorption. The effect of pH was the most significant on the aprotinin desorption. Fixed bed adsorption studies with insulin process wastewater showed that inhibition could be recovered using both enzymes as ligands. Analysis of trypsin and chymotrypsin inhibition and electrophoresis assay of chromatographic fractions strongly suggested that the inhibitor recovered is aprotinin / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-03-12T17:36:57Z No. of bitstreams: 1 PEDRO HENRIQUE RODRIGUES DE ALENCAR AZEVEDO.pdf: 15048741 bytes, checksum: a121d29e5dc4898c7b8e4a85def01e12 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-12T17:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PEDRO HENRIQUE RODRIGUES DE ALENCAR AZEVEDO.pdf: 15048741 bytes, checksum: a121d29e5dc4898c7b8e4a85def01e12 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As calicreínas teciduais humanas (KLKs) compreendem uma família de 15 enzimas serina proteases (KLKs 1-15) amplamente encontradas nos tecidos humanos. Em diversas patologias como a dermatite atópica, psoríase, síndrome de Netherton, câncer de ovário, mama e testículos, as KLKs encontram-se em concentrações elevadas. Por exemplo, as KLKs 5 e 7 estão mais abundantemente expressadas na pele, na qual estão envolvidas com o processo de descamação da mesma, e também presentes em alguns tipos de carcinomas. Dessa forma, as KLKs 5 e 7 são consideradas importantes alvos terapêuticos para o tratamento de doenças onde elas encontram-se superexpressadas, enfatizando a existência de somente um fármaco comercialmente disponível como inibidor de KLK. Nesse contexto, o trabalho descreve a síntese de 3 séries de compostos peptideomiméticos, incorporando o cerne estatina e diferentes resíduos de aminoácidos, planejados como candidatos a inibidores das enzimas serina proteases do KLKs 5 e 7. Os compostos finais foram obtidos utilizando uma rota sintética eficiente tendo como reação-chave a formação da ligação peptídica entre o cerne estatina e cloridratos de aminoésteres, previamente sintetizados. Os compostos sintetizados foram identificados por técnicas de Ressonância Magnética Nuclear, Infravermelho e Espectrometria de massas de alta resolução e os produtos finais serão avaliados em testes in vitro de inibição das enzimas KLKs / Human tissue kallikreins (KLKs) comprise a family of 15 serine protease enzymes (KLKs 1-15) widely found in human tissues. In several pathologies such as atopic dermatitis, psoriasis, Netherton syndrome, ovarian, breast and testis cancer, KLKs are in high concentrations. For example, KLKs 5 and 7 are more abundantly expressed in the skin, in which they are involved in the desquamation process, and also present in some types of carcinomas. Thus, KLKs 5 and 7 are considered important therapeutic targets for the treatment of diseases where they are over expressed, emphasizing the existence of only one commercially available drug as a KLK inhibitor. In this context, the work describes the synthesis of three series of peptideomimetic compounds incorporating the statin core and different amino acid residues, designed as candidates for inhibitors of the serine protease enzymes of KLKs 5 and 7. The final compounds were obtained using an efficient synthetic route based on the reaction of formation of the peptide bond between the statin core and previously synthesized amino acid hydrochlorides. The synthesized compounds were identified by Nuclear Magnetic Resonance, Infrared and High Resolution Mass Spectrometry techniques and the final products will be evaluated in in vitro inhibition assays of the KLKs enzymes

Serina endopeptidases de insetos, principalmente tripsinas e quimotripsinas, estão envolvidas na digestão inicial de proteínas. Genes codificadores para estas enzimas estão organizados em famílias multigênicas tendo expressão diferencial de acordo com a dieta do inseto, estando envolvidos no desenvolvimento de resistência a diferentes metabólitos secundários vegetais. Para uma melhor compreensão desta interação, fez-se necessário o isolamento destas enzimas para insetos de diferentes ordens, bem como a caracterização de suas especificidades por duas abordagens: (a) caracterização cinética dos subsítios componentes do sítio de ligação de tripsinas e quimotripsinas, utilizando diferentes substratos, modificadores químicos e inibidores e (b) estudos estruturais por modelagem molecular, clonagem, expressão e cristalização destas enzimas de insetos. Além disso, estudos evolutivos por análise de distância possibilitaram uma caracterização inicial da interação insetoplanta. Estas determinações permitiram verificar que tripsinas de insetos apresentam diferenças de especificidade tanto dentre as diferentes ordens de insetos quanto em relação às tripsinas de vertebrados, sendo que as tripsinas da ordem Lepidóptera apresentam troca de especificidade primária hidrolisando preferencialmente substratos P1 Lys. Foram também observadas diferenças de hidrofobicidade para os subsítios caracterizados sendo que estes apresentam hidrofobicidades crescentes segundo o grau de complexidade dos insetos na sua escala evolutiva. A troca de especificidade e o aumento da hidrofobicidade podem permitir a hidrólise dos inibidores vegetais protéicos. A análise das sequências de tripsinas de insetos por Neighbor Joining (NJ) compõe uma árvore de distâncias topologicamente semelhante à árvore de relações filogenéticas determinadas por morfologia. A sobreposição de estruturas pré -determinadas de tripsina complexada a diferentes inibidores permite a identificação de posições de interação enzima-inibidor que justificam a classificação em grupos distintos de enzimas sensíveis ou resistentes a presença de inibidores na dieta de insetos. Da mesma forma: a caracterização da especificidade das quimotripsinas de insetos permitiu a separação de grupos distintos de quimotripsinas. Estes grupos são sustentados pela substituição do resíduo 59 em insetos polífagos que alimentam-se de plantas que contêm cetonas naturais reativas. Estas caracterizações demonstram a importância de um estudo detalhado da especificidade de serina endopeptidases possibilitando o desenho de moléculas apropriadas para inibição destas e desenvolvimento de estratégias de controle de insetos. / Insect serine endopeptidases, mairily trypsin and chymotrypsin are involved in initial protein digestion. Genes that encode these proteins are members of complex multigene families and are differentially expressed according to insects diet , thus being involved with resistance to plant metabolites. Purification of trypsins from different insect orders and chymotrypsins, as well as, characterization of their specificity are essential to a better understanding of this interaction. Characterization relied on two approaches: (a) kinetic characterization of the binding subsities of trypsins and chymotrypsins using different substrates, chemical modification and inhibition assays and (b) study of protein structure by molecular modelling and cloning, expression and crystallization of these enzymes. Besides that, evolutionary studies performed through distance analysis, permitted the investigation of plantinsect interaction. These characterizations showed that insect trypsins, in terms of specificity, are quite different from vertebrate trypsins and among insect orders. Lepidopterans trypsins have a distinct primary specificity, since they hydrolyses preferentially P1 Lys substrates, and present a crescent subsite hydrophobicity, which is directly correlated with the evolutionary scale. Both, the specificity exchange and the crescent hydrophobicity can allow the hydrolysis of vegetal proteic inhibitors. The analysis of trypsin sequences in Neighbor-Joining (NJ) algorithm yield a distance tree that is coherent with morphological phylogenetic relationships. The superposition of predicted structures of trypsins-inhibitors complexes permits to observe amino acid residues of interaction between enzyme-inhibitor, which support the distinction of different groups between sensitive and insensitive trypsins to the presence of inhibitors on insect diet. Similarly, characterization of insect chymotrypsins according to their specificity allowed us to classify these enzymes into different groups. These groups are supported by residue 59 replacements in polyphagous insects, which feed on plants bearing natural reactive ketones. These studies show the irnportance of a detailed study of serine endopeptidases, which may help in the development of better insect control strategies.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-25T12:12:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T12:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos nematófagos são controladores naturais de nematoides parasitos de plantas e animais. São amplamente usados no controle biológico de nematoides parasitos gastrintestinais (NPG) de ruminantes por reduzir formas de vida livre nas pastagens. O processo de captura de nematoides segue uma ordem de eventos que envolve atração, adesão, penetração e degradação da cutícula do nematoide. As fases de penetração e degradação, envolvem a produção e secreção de enzimas extracelulares capazes de hidrolisar a cutícula dos nematoides, causando sua morte. Proteases de Arthrobotrys cladodes (CG719) foram purificadas por cromatografia de troca aniônica (Mono Q) e gel filtração em coluna Protein-Pak em sistema HPLC. A atividade nematicida das proteases foi testada em larvas infectantes (L 3 ) de nematoides parasitos gastrintestinais de ruminantes. O efeito sobre a bainha e cutícula das larvas foi observado por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As proteases purificadas chamadas de proteases de Arthrobotrys cladodes I (AcPI) e proteases de Arthrobotrys cladodes II (AcPII), têm massa molecular estimada de 56 e 39 kDa, respectivamente. A atividade enzimática dessas proteases foi maior em pH neutro a alcalino (7-8) e em temperaturas de 55 a 60°C. Ambas foram inativadas pelo inibidor fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) sugerindo pertencerem ao grupo das serina proteases. As proteases apresentaram maior atividade enzimática na presença do íon metálico Ca +2 . A fração de protease, purificada por cromatografia de troca aniônica, apresentou atividade larvicida provocando a morte de 53% das L 3 de NPG após 24 h de exposição. As AcPI e AcPII causaram mortalidade de 31 e 27% das L 3 , respectivamente, após 24 h, sugerindo ação aditiva na degradação da cutícula dos nematoides. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão, foram observadas alterações morfológicas, descamações, danos na camada basal, epicutícula, “annulis”, “furrows”, “alae”, hipoderme, e musculatura. Em algumas regiões, a camada cortical foi inteiramente destruída. Lesões provocaram extravasamento de líquido intracelular e perda de tecido. Proteases extracelulares secretadas por A. cladodes foram eficientes na penetração e degradação da cutícula de nematoides. Estas enzimas romperam a integridade física e fisiológica da dupla cutícula de L 3 de NPG. Isto pode permitir o desenvolvimento de fármacos para agir, diretamente, sobre helmintos ou, de forma sinérgica, com medicamentos comerciais. / Nematophagous fungi are natural enemies of parasitic nematodes of plants and animals. They are widely used in biological control of gastrointestinal nematodes (GIN) of ruminants by reducing free-living forms in pastures. The nematode capture process follows an order of events that involves attraction, adhesion, penetration and degradation of nematode cuticle. The phases of penetration and degradation, involve the production and secretion of extracellular enzymes capable of hydrolyzing the cuticle of the nematodes, causing their death. Proteases from Arthrobotrys cladodes (CG719) were purified by anion exchange chromatography (Mono Q) and gel filtration on a Protein-Pak column by HPLC system. The nematicidal activity of the proteases was tested in infective larvae (L3) of gastrointestinal parasitic nematodes of ruminants. The effect on the sheath and cuticle of the larvae were observed by scanning and transmission electron microscopy. The purified proteases called Proteases from Arthrobotrys cladodes I (AcPI) and Proteases from Arthrobotrys cladodes II (AcPII), have an estimated molecular mass of 56 and 39 kDa, respectively. The enzymatic activity of these proteases was higher at neutral to alkaline (7-8) pH and at temperatures of 55 to 60°C. Both were inactivated by the phenylmethylsulfonyl fluoride inhibitor (PMSF) suggesting that they belong to the serine proteases group. The proteases showed higher enzymatic activity in the presence of the Ca +2 metal ion. The protease fraction, purified by anion exchange chromatography, showed larvicidal activity causing the death of 53% of L 3 from GINs after 24 h of exposure. AcPI and AcPII caused mortality of 31 and 27% of L 3 , respectively, after 24 h, suggesting additive action in the degradation of the nematode cuticle. In scanning and transmission electron microscopy morphological changes, peeling, basal layer, epicuticle, annulis, furrows, alae, hypodermis, and musculature were observed. In some regions the cortical layer was entirely destroyed. Lesions caused extravasation of intracellular fluid and loss of tissue. Extracellular proteases secreted by A. cladodes were efficient in penetration and degradation of the nematode cuticle. These enzymes disrupted the physical and physiological integrity L 3 of GIN double cuticle. This may allow the development of drugs to act directly on helminths or, synergistically, with commercial drugs.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard Charles Garrat / Banca: Antonio José da Costa Filho / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 - anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 - e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no "bloqueio" da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the "blocking" of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre