Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marília Meira Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ascencao_CarollineFernandaRodrigues_M.pdf: 4713312 bytes, checksum: b65183d96535d66661af745a562f2d58 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proliferação celular comanda os processos de embriogênese e de crescimento do organismo, sendo essencial para a correta função de vários tecidos adultos. Apesar de ser importante para a homeostase do organismo, a sua desregulação compõe a força motriz do desenvolvimento tumoral. Somente nos últimos vinte anos começou a ser evidenciada a relação entre as vias de tradução de sinais estimuladas por fatores de crescimento e a reorganização da atividade metabólica, a qual precisa priorizar a biossíntese e o aumento da biomassa, processos essenciais para a divisão celular. Em células tumorais, o consumo de glutamina é aumentando concomitante ao aumento da atividade de glutaminase. Três isoenzimas de glutaminase são expressas na maioria dos tecidos (liver-type glutaminase, kidney-type glutaminase e glutaminase C), todavia pouco se sabe sobre a necessidade específica de cada uma delas para o metabolismo tumoral. Vários artigos recentes têm definido o papel da glutaminólise, ou metabolismo da glutamina e seus subprodutos, na ativação da mTOR. Neste sentido é uma hipótese válida imaginar que mTOR possa contra-regular glutaminase. Desta maneira, resolvemos investigar se mTOR atua na regulação da atividade de glutaminase. Para tanto, realizamos knockdown estável de PTEN em células MDA-MB 231 e verificamos que não o mesmo afetou os níveis protéicos de GAC e KGA, assim como não houve mudança na localização subcelular das isoformas. Cinética enzimática da fração mitocondrial desta linhagem revelou que o knockdown de PTEN levou à uma diminuição do KM da enzima sem alteração de Vmax. De acordo, o tratamento com rapamicina, inibidor da mTOR, elevou o KM para os níveis detectados nas células controles. A atividade de glutaminase de lisado total de MDA-MB 231, NIH 3T3, IMR90 e BJ5TA foi afetada pelo tratamento com rapamicina conforme julgado por ensaios de dose e tempo resposta. Mais, ensaios de privação de glicose, glutamina e de fatores de crescimento levaram à inibição de mTOR e concomitante redução da atividade de glutaminase. Somado a isso, o knockdown estável de TSC2 em MDA-MB 231 e BJ5TA, assim como o knockout de TSC2 em MEF, promoveu superestimulação de mTOR e foi capaz de aumentar a atividade de glutaminase. Dosagem de atividade de glutaminase de células MDA-MB 231 com knockdown de GAC, KGA ou GAC/KGA tratadas com rapamicina indicaram que mTOR possa agir em ambas as isoformas. Curioso foi que apenas células shGAC e shGAC/KGA apresentaram redução da fosforilação de S6K em Thr389 indicando que GAC ou o metabolismo de glutamina via esta isoforma, possa contra-regular mTOR. Em adição, na comparação entre PC3 e DU145, verificamos que DU145 apresentou maior expressão de GAC, maior consumo de glutamina, maior dependência de glutamina em seu crescimento, maior sensibilidade ao inibidor de glutaminase, BPTES, e por fim, se mostrou mais responsiva à metformina, ativador indireto de AMPK. A ativação de AMPK por metformina, um conhecido sensor de estresse energético, mostrou diminuir a atividade de glutaminase em célula de tumor de próstata, DU145, indicando uma potencial ação de AMPK na atividade de glutaminase / Abstract: Cell proliferation is crucial for embryogenesis and organism growth, being also essential for the proper function of several adult tissues. Although important for the homeostasis of the organism, its deregulation composes the driving force of tumor development. In the past twenty years the relationship between the processes of signal translation stimulated by growth factors and the reorganization of metabolic activity has become more evident. Growing cells need to prioritize the biosynthesis and biomass increase, processes essential for cell division. In tumor cells, the glutamine consumption is increased concurrently with the increasing in the glutaminase activity. Three glutaminase isoenzymes are expressed in most tissues (liver- type glutaminase, kidney -type glutaminase and glutaminase C), but not much is known about the necessity of each isoform for the tumor metabolism. Several recent papers have defined the role of glutaminolysis or glutamine metabolism in mTOR activation. So it is a valid hypothesis to speculate that mTOR can counter-regulate glutaminase. Thus, we decided to investigate whether mTOR can control glutaminase activity. To this end, we have made MDA - MB 231 cells stably knocked down for PTEN and verified no alteration in KGA and GAC protein levels, as well as there was no change on their subcellular location. Enzyme kinetics of the MDA-MB 231 mitochondrial fraction revealed that PTEN knockdown led to a decrease in the KM of the enzyme without changing Vmax. Accordingly, the treatment with rapamycin (mTOR inhibitor), led to an increase in KM back to the level detected in control cells. The glutaminase activity of MDA - MB 231, NIH 3T3, IMR90 and BJ5TA total cellular lysates was also affected by rapamycin treatment in a dose- and time-response fashion. Moreover, glucose, glutamine and growth factors deprivation promoted mTOR inhibition and concomitant reduction on glutaminase activity. Glutaminase activity of MDA-MB 231 cells knocked down for GAC, KGA or GAC/KGA and treated with rapamycin indicated that mTOR can regulate both isoforms. Curiously, it was only on GAC or GAC/KGA knocked down cells that we observed a decrease in S6K Thr 389 phosphorylation, which could indicate that GAC or the GAC dependent-glutamine metabolism is a specific mTOR counter-regulator. Accordling, stable TSC2 knockdown in MDA-MB 231 and BJ5TA, as well as TCS2 knockout in MEF cells, promoted overstimulation of mTOR and increasing on glutaminase activity. Moreover, a comparison between PC3 and DU145 revealed that DU145 has higher GAC expression, greater consumption of glutamine, is more dependent on glutamine for its growth, more sensitive to the inhibitor of glutaminase, BPTES, and more responsive to metformin, an indirect AMPK activator. The activation of AMPK by metformin, a known energy stress sensor, led to a decreased glutaminase activity in the prostate tumor cell line DU145 indicating a potential role of AMPK on glutaminase activity / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Serina endopeptidases de insetos, principalmente tripsinas e quimotripsinas, estão envolvidas na digestão inicial de proteínas. Genes codificadores para estas enzimas estão organizados em famílias multigênicas tendo expressão diferencial de acordo com a dieta do inseto, estando envolvidos no desenvolvimento de resistência a diferentes metabólitos secundários vegetais. Para uma melhor compreensão desta interação, fez-se necessário o isolamento destas enzimas para insetos de diferentes ordens, bem como a caracterização de suas especificidades por duas abordagens: (a) caracterização cinética dos subsítios componentes do sítio de ligação de tripsinas e quimotripsinas, utilizando diferentes substratos, modificadores químicos e inibidores e (b) estudos estruturais por modelagem molecular, clonagem, expressão e cristalização destas enzimas de insetos. Além disso, estudos evolutivos por análise de distância possibilitaram uma caracterização inicial da interação insetoplanta. Estas determinações permitiram verificar que tripsinas de insetos apresentam diferenças de especificidade tanto dentre as diferentes ordens de insetos quanto em relação às tripsinas de vertebrados, sendo que as tripsinas da ordem Lepidóptera apresentam troca de especificidade primária hidrolisando preferencialmente substratos P1 Lys. Foram também observadas diferenças de hidrofobicidade para os subsítios caracterizados sendo que estes apresentam hidrofobicidades crescentes segundo o grau de complexidade dos insetos na sua escala evolutiva. A troca de especificidade e o aumento da hidrofobicidade podem permitir a hidrólise dos inibidores vegetais protéicos. A análise das sequências de tripsinas de insetos por Neighbor Joining (NJ) compõe uma árvore de distâncias topologicamente semelhante à árvore de relações filogenéticas determinadas por morfologia. A sobreposição de estruturas pré -determinadas de tripsina complexada a diferentes inibidores permite a identificação de posições de interação enzima-inibidor que justificam a classificação em grupos distintos de enzimas sensíveis ou resistentes a presença de inibidores na dieta de insetos. Da mesma forma: a caracterização da especificidade das quimotripsinas de insetos permitiu a separação de grupos distintos de quimotripsinas. Estes grupos são sustentados pela substituição do resíduo 59 em insetos polífagos que alimentam-se de plantas que contêm cetonas naturais reativas. Estas caracterizações demonstram a importância de um estudo detalhado da especificidade de serina endopeptidases possibilitando o desenho de moléculas apropriadas para inibição destas e desenvolvimento de estratégias de controle de insetos. / Insect serine endopeptidases, mairily trypsin and chymotrypsin are involved in initial protein digestion. Genes that encode these proteins are members of complex multigene families and are differentially expressed according to insects diet , thus being involved with resistance to plant metabolites. Purification of trypsins from different insect orders and chymotrypsins, as well as, characterization of their specificity are essential to a better understanding of this interaction. Characterization relied on two approaches: (a) kinetic characterization of the binding subsities of trypsins and chymotrypsins using different substrates, chemical modification and inhibition assays and (b) study of protein structure by molecular modelling and cloning, expression and crystallization of these enzymes. Besides that, evolutionary studies performed through distance analysis, permitted the investigation of plantinsect interaction. These characterizations showed that insect trypsins, in terms of specificity, are quite different from vertebrate trypsins and among insect orders. Lepidopterans trypsins have a distinct primary specificity, since they hydrolyses preferentially P1 Lys substrates, and present a crescent subsite hydrophobicity, which is directly correlated with the evolutionary scale. Both, the specificity exchange and the crescent hydrophobicity can allow the hydrolysis of vegetal proteic inhibitors. The analysis of trypsin sequences in Neighbor-Joining (NJ) algorithm yield a distance tree that is coherent with morphological phylogenetic relationships. The superposition of predicted structures of trypsins-inhibitors complexes permits to observe amino acid residues of interaction between enzyme-inhibitor, which support the distinction of different groups between sensitive and insensitive trypsins to the presence of inhibitors on insect diet. Similarly, characterization of insect chymotrypsins according to their specificity allowed us to classify these enzymes into different groups. These groups are supported by residue 59 replacements in polyphagous insects, which feed on plants bearing natural reactive ketones. These studies show the irnportance of a detailed study of serine endopeptidases, which may help in the development of better insect control strategies.

Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular / El síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica de etiología desconocida que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lacrimales. Los pacientes que padecen esta enfermedad manifiestan graves alteraciones, tanto en la calidad como, en la cantidad de saliva y lágrimas. Las GS de pacientes SS presentan cambios morfológicos y funcionales en el parénquima glandular y en la matriz extracelular correlacionado con alteraciones en la polaridad de la célula acinar. Las GS de pacientes SS también evidencian cambios en la expresión de proteínas que participan en el tráfico de gránulos de secreción hacia el polo apical de las células acinares. Las células acinares de GS de pacientes SS han mostrado cambios en la concentración de calcio en el lumen del retículo endoplásmico (RE), una disminución en la expresión de genes disulfuro isomerasa y un aumento de genes para enzimas que participan en la ubiquitinación. Además se han reportado alteraciones en la ruta secretora, cambios morfológicos y funcionales a nivel de RE, complejo de Golgi y gránulos de secreción. En conjunto, las evidencias mencionadas sugieren una pérdida de homeostasis glandular y una respuesta celular alterada frente a la alta demanda de síntesis proteica en las células acinares de GS de pacientes SS. La síntesis exacerbada de proteínas en el RE genera estrés en este organelo. En condiciones fisiológicas, células secretoras, tales como las células acinares pancreáticas, células acinares de GS y células plasmáticas, son susceptibles a experimentar un alto nivel de estrés de RE, como consecuencia de una alta demanda de síntesis para alcanzar un eficiente plegamiento de proteínas. Para contrarrestar este efecto se activa la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) la cual promueve la obtención de una conformación adecuada de las proteínas en el RE. Considerando la cronicidad de esta patología, una deficiente UPR en las células de GS de pacientes SS, podría explicar un estado de estrés de RE sostenido que podría desencadenar procesos relacionados con la autoinmunidad. Por otra parte, una menor expresión de XBP-1, como fue observado en un análisis de microarreglos de cDNA, podría asociarse con la hiposecreción de pacientes SS, ya que ha sido demostrado que XBP-1 contribuye con los cambios estructurales y funcionales que las células altamente secretoras requieren para la biosíntesis de proteínas. En la presente tesis, se formuló la hipótesis: “Componentes de la vía IRE1α/XBP-1 de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) se encuentran disminuidos en células acinares de glándulas salivales labiales (GSLs) de pacientes SS”. Para abordar los objetivos planteados, se utilizaron técnicas de biología celular y molecular para analizar marcadores de UPR. Particularmente se determinaron los niveles proteicos de IRE-1α, la expresión génica, proteica y localización celular de XBP-1 (XBP-1u y XBP-1s), de la proteína chaperona GRP78 (BiP) y de la disulfuro isomerasa PDIA3 (ERp57). Además se analizó la expresión de genes río abajo del factor transcripcional XBP-1s, como EDEM1, SEC61, ERdj4. Los resultados de esta tesis indican que hay una disminución significativa de la proteína IRE-1α, del factor transcripcional XBP-1s y de la chaperona BiP en GSLs de pacientes SS. Por otro lado, la proteína PDIA3 se encuentra aumentada significativamente, no así en sus niveles de mRNA. Respecto a la localización, las proteínas XBP-1 y BiP no presentan diferencias entre ambos grupos en estudio, pero sí una disminución en la intensidad inmunofluorescente en las GSLs de pacientes SS. Estos resultados, evidencian una alteración en el eje IRE-1α/XBP-1 de la UPR. Estos hallazgos sugieren que la homeostasis del RE de GSLs de pacientes SS se encuentra alterada, evidenciada por una disminución de la vía IRE-1α/XBP-1 y un aumento de PDIA3. Estos cambios, especialmente los bajos niveles de XBP-1s pueden explicar la hipofunción de GSLs de pacientes SS, sin embargo, la contribución de las otras vías de señalización de la UPR debe ser abordada para conocer la real contribución de la UPR en la homeostasis glandular y en la etiopatogenia del SS. / Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune chronic exocrinopathy of unknown etiology that mainly affects the lachrymal and salivary glands (SG). SS patients experience severe alterations both in quality and quantity of saliva and tears. SG of SS patients show morphological and functional changes in the parenchyma and in the extracellular matrix that correlate with alterations in the acinar cell polarity. SG of SS patients also show changes in the expression of proteins involved in trafficking of secretory granules into the apical pole of the acinar cells. Acinar cells of SG of SS patients showed changes in calcium concentration in the endoplasmic reticulum (ER) lumen, a decrease gene expression of disulfide isomerase and increase gene expression of enzymes involved in ubiquitination. In addition, changes in the secretory pathway as well as morphological and functional changes in ER, Golgi complex and secretory granules have been reported. Together, the above evidence suggest a loss of glandular homeostasis and altered cellular response to high demand of protein in acinar cells of SG from SS patients. Exacerbated proteins synthesis in the ER generates stress to this organelle. Under physiological conditions, secretory cells such as pancreatic acinar cells, acinar cells of SG and plasma cells, can experience a high ER stress level due to a high demand to achieve efficient protein folding. To counteract this effect, unfolded protein response (UPR) is activated leading to an adequate conformation of proteins in the ER. Considering that SS is a chronic condition, an impaired UPR in SG cells of SS patients might induce a sustained ER stress that, in turn, could trigger autoimmunity. Moreover, a reduced transcription of XBP-1, as observed by cDNA microarray analysis, may be associated to hyposecretion of SS patients. Indeed, it has been demonstrated that XBP-1 contributes to structural and functional changes that highly secreting cells need for protein biosynthesis. In this thesis, we hypothesized that "pathway components IRE1α/XBP-1 of unfolded protein response (UPR) are decreased in acinar cells of labial salivary glands (LSG) of SS patients". To address the objectives, cellular and molecular markers of UPR were evaluated. These included protein levels of IRE-1α as well as mRNA, protein and cellular localization of XBP-1 (XBP-1u and XBP-1s), GRP78 chaperone protein (BiP) and protein disulfide isomerase PDIA3 (ERp57). We also analyzed the expression of genes downstream of the transcription factor XBP-1s such as EDEM1, SEC61, ERdj4. The results indicated a significant decrease of IRE-1α protein, the transcription factor XBP-1s and chaperone BiP in LSGs of SS patients. Moreover, PDIA3 protein but nor its mRNA levels were significantly increased. Regarding location, no differences between the two study groups were observed for XBP-1 and BiP proteins, with a decrease in overall immunofluorescent intensity in SS patients. These results suggest an alteration in the UPR IRE-1α/XBP-1 axis. These findings suggest that RE homeostasis is impaired in LSGs from SS patients as evidenced by a decrease of the IRE-1α/XBP-1 pathway and an increased of PDIA3. These changes, especially low levels of XBP-1s can explain LSGs hypofunction of SS patients. Nonetheless the contribution of other signaling pathways of the UPR should be addressed to the total contribution of the UPR in glandular homeostasis in the pathogenesis of SS.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-04T14:10:11Z No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T14:10:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) Previous issue date: 2014-10-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction - The head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) are among the most frequent types of cancer, with more than 600,000 new cases per year worldwide. The five-year survival rate is low in this disease and one of the reasons is that patients with tumours in early stages frequently exhibit few symptoms, resulting in diagnosis delay and severe morbidity. The understanding of the molecular pathways involved in the initiation and progression of these tumors is therefore important not only for understanding their biology, but also for the development of more effective preventive and therapeutic approaches. In previous studies of our group, the kallikrein 8 gene (KLK8) was observed differentially expressed in laryngeal carcinomas and its surgical margins, which highlights its potential as a tumor marker, similar to another member of KLK family, kallikrein 3 or PSA. Objectives and Methodology - The overall objective of the present study was to investigate the participation of the kallikrein 8 in the HNSCC development. The specific objectives included (a) to investigate the phylogenetic relationships among KLKs genes using the MEGA program, (b) to analyze, by real time PCR, the expression pattern of the KLK8 gene and its most abundant isoform in HNSCC and their surgical margins, (c) to evaluate the effect of elevated expression of KLK8 in HNSCC secretome, using conditioned medium and proteomic and metabolomic approaches, (d) to develop molecular homology modeling of protein hK8 by bioinformatics tools. Results - The phylogenetic analysis of human kallikrein genes and their isoforms confirmed the idea that these genes evolved from a single common ancestor by successive tandem duplications and chromosomal rearrangements facilitated by repetitive elements. The results of gene expression analysis in tumor tissues showed that the variant 1 of KLK8 has significantly reduced levels in HNSCC, unlike the other five variables. The ectopic expression of this variant resulted in changes of cell morphology, increased proliferation, viability and migratory capacity, but no alterations in invasiveness. The data from cells with ectopic expression of KLK8 revealed small differences in their proteomes compared to control cells. Otherwise, these cells exhibited changes in their glycolytic pattern and in the effect of their secretome on the metabolism of other cells. Conclusion - This study was important to answer some questions and raise others questions about the role of KLK8 gene in carcinomas of the head and neck. For the first time, differences in expression of KLK8 isoforms were observed in HNSCC and the effects of ectopic KLK8 expression on the proteome and the secretome of HNSCC cells. / Introdução - Os carcinomas epidermóides de cabeeça e pescoco (CECPs) estão entre os mais frequentes tipos de câncer, com mais de 600 mil novos casos por ano no mundo e taxas de sobrevida reduzidas. Além de sua incidência e mortalidade altas, os CECPs são clinicamente relevantes por causa de sua morbidade, em geral decorrente do diagnóstico tardio. O entendimento das vias moleculares envolvidas na iniciação e na progressão desses tumores é, portanto, importante, não somente para o entendimento de sua biologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas mais eficazes. Em estudos prévios do nosso grupo, o gene da calicreína 8 (KLK8) foi observado com expressão diferencial entre carcinomas de laringe e suas margens cirúrgicas, o que evidencia seu potencial como marcador tumoral, como ocorre com outro membro de sua família, a calicreína 3 ou PSA. Objetivos e Metodologia – O presente projeto teve como objetivo geral investigar a participação da calicreína 8 no desenvolvimento de CECPs. Seus objetivos específicos compreenderam (a) investigar as relações filogenéticas entre os genes KLKs com o auxílio do programa MEGA, (b) analisar, por PCR em tempo real, o padrão de expressão do gene KLK8 e de sua isoforma mais abundante em CECP e em tecidos normais correspondentes, (c) avaliar o efeito da expressão elevada de KLK8 no secretoma de células de CECP, utilizando ensaios com meio condicionado e abordagens proteômicas e metabolômicas, (d) desenvolver a modelagem molecular por homologia da proteína hK8 com ferramentas de bioinformática. Resultados – A análise filogenética da família de genes das calicreínas humanas e suas isoformas confirmou a idéia de que esses genes evoluíram de um único ancestral comum por sucessivas duplicações em tandem e rearranjos cromossômicos facilitados por elementos repetitivos. Os dados de expressão gênica em tecidos tumorais mostraram que a variante 1 de KLK8 apresenta níveis significativamente reduzidos em CECP, ao contrário das outras cinco variantes. A indução permanente in vitro desta variante resultou em mudança da morfologia celular, aumento de proliferação, viabilidade e capacidade migratória, sem aumento concomitante de invasividade. Os dados obtidos sobre essas células com expressão ectópica de KLK8 revelaram pequenas diferenças em seu proteoma quando comparadas com células controle. Por outro lado, exibiram modificação no padrão glicolítico e no potencial de seu secretoma de afetar o metabolismo de outras células. Conclusão - O presente estudo foi importante para responder a alguns questionamentos e levantar outras questões sobre a função do gene KLK8 em carcinomas de cabeça e pescoço. O estudo identificou, pela primeira vez, as diferenças de expressão entre as isoformas de KLK8 em CECP e os efeitos da indução de sua expressão sobre o proteoma e o secretoma de suas células.

Neste trabalho foram aprofundados nossos estudos para obtenção da (S)-2-terc-butilamida-4-(3-picolil)piperazina, pela abertura da (S)-2-terc-butilcarboxamida-N-p-tosilaziridina seguida de ciclização, em 78% de rendimento, com o triflato de vinildifenilsulfônio. A aziridina foi preparada por um processo de ciclização, em condições de transferência de fase, partindo-se da L-serina, um aminoácido natural de baixo custo. Esta rota sintética rendeu um material que apresenta a mesma estereoquímica S do fragmento piperazínico usado na síntese do Indinavir, podendo vir a constituir uma via alternativa para a obtenção deste fármaco. / In this work we performed a deeper study for obtaining (S)-2-tert-butylamide-4-(3-picolyl)piperazine by opening (S)-2-tert-butylcarboxamide-N-p-tosylaziridine followed by cyclization, in 78% yield, with diphenylvinylsulfonium trifluoromethanesulfonate. The aziridine were prepared by a cyclization process in phase transfer conditions, starting from L-serine, a low cost amino acid. This synthetic route yielded a material which has the same S piperazinic fragment stereochemistry used in the synthesis of Indinavir, and may constitute an alternative route for obtaining this drug.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Neste trabalho foram aprofundados nossos estudos para obtenção da (S)-2-terc-butilamida-4-(3-picolil)piperazina, pela abertura da (S)-2-terc-butilcarboxamida-N-p-tosilaziridina seguida de ciclização, em 78% de rendimento, com o triflato de vinildifenilsulfônio. A aziridina foi preparada por um processo de ciclização, em condições de transferência de fase, partindo-se da L-serina, um aminoácido natural de baixo custo. Esta rota sintética rendeu um material que apresenta a mesma estereoquímica S do fragmento piperazínico usado na síntese do Indinavir, podendo vir a constituir uma via alternativa para a obtenção deste fármaco. / In this work we performed a deeper study for obtaining (S)-2-tert-butylamide-4-(3-picolyl)piperazine by opening (S)-2-tert-butylcarboxamide-N-p-tosylaziridine followed by cyclization, in 78% yield, with diphenylvinylsulfonium trifluoromethanesulfonate. The aziridine were prepared by a cyclization process in phase transfer conditions, starting from L-serine, a low cost amino acid. This synthetic route yielded a material which has the same S piperazinic fragment stereochemistry used in the synthesis of Indinavir, and may constitute an alternative route for obtaining this drug.

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ThiagoMatosFerreirade_D.pdf: 1239554 bytes, checksum: 87d5fc958173ca83a217021c9d866455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é caracterizada pela deposição ectópica de gordura no fígado. Este acúmulo de gordura hepática (NAFLD) pode gerar consequências graves, como a hepatite não alcoólica (NASH), fator de ricos para carcino hepatocelular (HCC). A morte de hepatócitos, evento chave na evolução da NAFLD para NASH, é causada pelo excesso de nutrientes e é dependente do estresse de retículo endoplasmático (RE). O estresse no RE resulta no acúmulo de proteínas não processadas desencadeia a "unfolded protein response" (UPR), podendo gerar apoptose. A mTOR é formada basicamente por dois complexos: mTOR1 e mTOR2; ambos são sensíveis a nutrientes, a insulina e a rapamicina. O complexo mTOR2/Rictor catalisa a fosforilação da AKT, aumentando a sinalização da insulina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre ativação da mTOR, do estresse de RE e da apoptose em hepatócito expostos a ácidos graxos livres. Observamos que a apoptose causada pelo palmitato ativa o estresse de RE de maneira tempo dependente. Não observamos alterações na fosforilação de proteínas alvo específicas para o complexo mTOR1. No entanto, a fosforilação geral da mTOR foi estimulada pelo palmitato. Altas doses de rapamicina inibiram a apoptose e do estresse de RE causado pelo palmitato, sugerindo a participação do complexo mTOR2. Estes resultados ainda foram confirmados pelo silenciamento gênico da Rictor. A fosforilação em serina 473 da AKT apresenta um caráter transitório, elevando-se em tempos que precedem morte e o estresse de RE, e diminuindo em tempos prolongados concomitantemente à apoptose. A inibição da AKT pelo "AKT inhibitor" gerou diminuição da apoptose, do estresse de RE e da incorporação lipídica na linhagem de hepatoma. Estes dados sugerem que a AKT, como alvo preferencial da mTOR2 é necessária para geração de morte e da UPR. A glicose (33.3mM) gera morte as células HepG2 e esta é inibida com baixas doses de rapamicina, mostrando possível atividade via mTOR1 nesta resposta. De outro modo, a frutose (4.5mM) que também desencadeia apoptose das células de hepatoma, tem seu efeito inibido por doses maiores de rapamicina, indicando atividade mTOR2 neste processo. No entanto, a possibilidade de diferentes monossacarídeos recrutarem complexos diferentes de mTOR para desencadear apoptose ainda precisa ser melhor explorada / Abstract: Obesity is characterized by fat ectopic deposition in liver. This hepatic fat accumulation our non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) can have serious consequences such as non-alcoholic hepatitis (NASH), that is a factor to liver cancer. The cell death of hepatocytes is an important event in the development to NAFLD to NASH, all that are caused by excess nutrients and dependent of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER stress is caused by accumulation of unfolded proteins triggers the unfolded protein response (UPR), which mau cause apoptosis. mTOR is basically formed by two complexes: mTOR1 and mTOR2, both are sensitive to nutrients, insulin and rapamycin. The mTOR2/Rictor complex catalyse AKT phosphorylation increasing the insulin pathway. All together, the aim of this study was evaluate the relationship between mTOR, ER stress and apoptosis in liver cells exposed to free fatty acids. We observed that apoptosis caused by palmitate activates ER stress in a manner dependent on time. We din¿t observed changes in phosphorylation of specific target proteins to mTOR1 complex. However, a general phosphorylation of mTOR was stimulated by palmitate. High doses of rapamycin inhibited apoptosis and ER stress caused by palmitate, suggesting the participation of the mTOR2 complex. These results were further confirmed by gene silencing of Rictor. The AKT phospholylation in serine 473 has a transitional character, rising in times that preceding cell death and ER stress, and decreasing concomitantly apoptosis in prolonged times. Inhibition of AKT by AKT inhibitor caused a decrease in apoptosis, ER stress and lipid incorporation in hepatoma cell line. These data suggest that AKT, preferential targets of mTOR2 is required for generation death and UPR. Glucose (33.3mM) generates HepG2 cell death and this is inhibited by low doses on rapamycin, showing possible mTOR1 activity. Otherwise, fructose (4.5mM) also triggers apoptosis of hepatoma cells; its effect is inhibited by higher doses of rapamycin, indicating mTOR2 activity in this process. However, the possibility of different monosaccharide recruit different complexes of mTOR to trigger apoptosis should be further explored / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_GustavoPereirade_M.pdf: 7665145 bytes, checksum: 3fef8dc5d333834f8117015fea3b10ef (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A produção de energia por meio de fontes renováveis é uma exigência atual para se atingir uma economia sustentável. Os organismos fotossintetizantes surgem nesse contexto como ferramentas importantes na produção de compostos carbônicos ricos em energia, com destaque para microalgas em que tais compostos podem atingir até 80% do peso seco. Entretanto, um fator ainda desfavorável para sua utilização é o seu baixo rendimento na produção de biomassa. A espécie Chlamydomonas reinhardtii, por exemplo, é capaz de duplicar apenas algumas vezes durante 24 horas. As vias que controlam o crescimento celular, portanto, são alvos promissores para modificação genética. Dentre essas vias, à via de sinalização sensível à rapamicina aparece como um controlador central. Com o intuito de entender melhor como esse controle é exercido ao nível da expressão gênica global, foi utilizado a ferramenta de sequenciamento de RNA em larga escala para obtenção dos transcriptomas de culturas (sincronizadas) sob inibição dessa via e na condição controle, em oito momentos ao longo de um ciclo celular de 24h. O controle exercido por essa via sobre o metabolismo e sobre o ciclo celular foi o foco das análises. Foi encontrado que a inibição da via da TOR é capaz de gerar uma resposta de direcionamento parcial do metabolismo para a produção de TAG em detrimento de moléculas complexas como proteínas. Esse direcionamento foi considerado parcial devido à ocorrência concomitante de reações catabólicas. Outros dados obtidos sugerem que a via da TOR, além de regular o metabolismo de uma maneira geral e diversas funções celulares, também exerce influência sobre o progresso do ciclo celular e sua inibição resulta no atraso do desenvolvimento das fases do ciclo. Diversos fatores reguladores da transcrição envolvidos no desenvolvimento, no crescimento e na regulação do ciclo celular, foram encontrados diferencialmente expressos e constituem possíveis genes chave no controle do crescimento. Eles representam alvos em potencial para modificação genética com intuito de otimizar as taxas de crescimento na primeira etapa do sistema de produção. Na busca de alternativas aos processos atuais de indução do acúmulo de cadeias carbônicas, os efeitos da combinação rapamicina e via da TOR representam uma abordagem interessante para pesquisas futuras para viabilização da utilização de microalgas como fonte de energia. Este estudo possibilitou um melhor entendimento da atuação da via da TOR no crescimento e progresso do ciclo celular em C. reinhardtii ao nível de expressão gênica / Abstract: The energy production through renewable sources is an actual demand for achieving a sustainable economy. In this context, photosynthesizing organisms come to light as important tools for the production of energy-rich carbonic compounds, especially the microalgae, in which these compounds can reach up to 80% of the dry weight. However, an unfavorable factor for its utilization is the low yield of biomass production. The species Chlamydomonas reinhardtii, for instance, is capable of achieving only some duplication after 24 hours. The pathways that control cell growth are therefore promising targets for genetic modification. Among them, the rapamycin-sensitive signaling pathway emerges as a central controller. With the aim of better understanding how this control is fulfilled by the means of global gene expression, the high throughput RNA sequencing technology was used. With it, the synchronized cultures transcriptome under the inhibition of this pathway and in the control condition, of eight points during a cellular cycle of 24 hours, were obtained. The metabolism and the cell cycle control by the TOR pathway was the main focus of the analysis. It was found that the inhibition of this pathway is capable to partially draw the metabolism towards TAG production to the detriment of producing more complex chains as proteins. This directing was considered partial due to the concomitant occurrence of catabolic reactions. Other data suggested that the TOR pathway, apart from the metabolism regulation in a general way and regulation of many other cellular functions, also influence the cell cycle progression and its inhibition retards the development of cell phases. Several transcription regulators involved in development, growth and cell cycle regulation were found out to be differentially expressed and are likely to constitute key genes in growth control. They represent potential targets for genetic modification aiming the optimization of growth rate in the first step of the production system. In the search for alternatives to the current process of inducing carbon chain accumulation, the effects of the combination between rapamycin and TOR pathway represent an interesting approach for future research intending to turn the utilization of microalgae as an energy source into a feasible option. This study enabled a better understanding of the role of the TOR pathway in growth and cell cycle progression of C. reinhardtii at the level of gene expression / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.