Orientador: Paula Rahal / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Nelson José Freitas da Silveira / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Osmar Gaspar / Resumo: A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / Abstract: The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus / Doutor

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, AIDS,malária e tuberculose são as três maiores doenças infectantes do mundo, atingindo principalmente crianças. Regiões paupérrimas e de clima tropical, como a África sub-saariana, são as mais atingidas. Este quadro agrava-se com a disseminação de cepas do Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina e multi-resistentes.Além disso, alguns fármacos utilizados na terapêutica da malária apresentam vários efeitos adversos, comprometendo o tratamento. Trata-se de um grande desafio e o seu enfrentamento requer estratégias. O desenvolvimento de novos quimioterápicos deve fundamentar-se em diferenças bioquímicas e morfológicas entre as células do hospedeiro e do parasita. A biossíntese de fosfolipídeos de membrana em parasitas do grupo Apicomplexa é de extrema importância para a maturação e a reprodução do parasita e constitui-se em bom alvo para novos antimaláricos, uma vez que é encontrada somente em parasitas. Hemácias infectadas têm sua absorção modificada em relação aos eritrócitos não-infectados, conferindo seletividade a substâncias como lipídeos. O trabalho em questão propõe a síntese de antimetabólitos da serina, visando à inibição das enzimas fosfatidilserina síntase e serina descarboxilase, fundamentais para a biossíntese de fosfolipídeos de membrana desses parasitas.. Cinco derivados heterocíclicos da serine foram sintetizados: derivados diidroimidazólico, diidroxazólico, diidroxazínico, diidropirimidínico e diidrooxatiólico. Também, o transportador fosfolipídico com o ácido esteárico foi sintetizado. Os antimetabólitos serão acoplados a esse e outros fosfolipídeos, obtendo-se fármacos dirigidos específicos direcionados seletivamente a eritrócitos infectados. / According to the World Health Organization, Aids, malaria and tuberculosis are the three greatest infectious diseases in the world. Children are the most involved in those diseases. Extremely poor regions, as sub-Saharan, Africa, are the most affected. In the worst case scenario, one of the parasites that causes malaria, Plasmodium falciparum, become resistant to chloroquine and the current therapy. Besides, some drugs used in the mataria chemotherapy are very toxic, showing many side effects, and compromising the treatment. This is a big challenge and facing it requires new strategies.. The development of chemotherapeutic has been inspired in biochemical differences between the parasite and the host. Plasmodíum falciparum needs to biosynthesize phospholipids for their membrane. These phospholipids are very important to the maturation and reproduction of the parasite and occur only in it.. This makes the phospholipids biosynthesis a good target for new and specific antimalarial drug design. Infected red blood cell shows modified permeation, allowing the lipids to be freely transported, what is not usual in the non-infected red blood cells. This said, in the present work the design and synthesis of serine metabolic inhibitors, using the bioisosteric strategy, have been proposed. The inhibition of the phosphatidylserine biosynthesis, an important phospholipid, is expected. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected red-blood cell.. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected redblood cell. In the present work five heterocyclic serine inhibitors: diidroimidazolic, diidroxazolic, diidroxazinico, diidropyriminic and diidroxatiolic. Also synthesized a phospholipid to be connected to the heterocyclic inhibitors.

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, AIDS,malária e tuberculose são as três maiores doenças infectantes do mundo, atingindo principalmente crianças. Regiões paupérrimas e de clima tropical, como a África sub-saariana, são as mais atingidas. Este quadro agrava-se com a disseminação de cepas do Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina e multi-resistentes.Além disso, alguns fármacos utilizados na terapêutica da malária apresentam vários efeitos adversos, comprometendo o tratamento. Trata-se de um grande desafio e o seu enfrentamento requer estratégias. O desenvolvimento de novos quimioterápicos deve fundamentar-se em diferenças bioquímicas e morfológicas entre as células do hospedeiro e do parasita. A biossíntese de fosfolipídeos de membrana em parasitas do grupo Apicomplexa é de extrema importância para a maturação e a reprodução do parasita e constitui-se em bom alvo para novos antimaláricos, uma vez que é encontrada somente em parasitas. Hemácias infectadas têm sua absorção modificada em relação aos eritrócitos não-infectados, conferindo seletividade a substâncias como lipídeos. O trabalho em questão propõe a síntese de antimetabólitos da serina, visando à inibição das enzimas fosfatidilserina síntase e serina descarboxilase, fundamentais para a biossíntese de fosfolipídeos de membrana desses parasitas.. Cinco derivados heterocíclicos da serine foram sintetizados: derivados diidroimidazólico, diidroxazólico, diidroxazínico, diidropirimidínico e diidrooxatiólico. Também, o transportador fosfolipídico com o ácido esteárico foi sintetizado. Os antimetabólitos serão acoplados a esse e outros fosfolipídeos, obtendo-se fármacos dirigidos específicos direcionados seletivamente a eritrócitos infectados. / According to the World Health Organization, Aids, malaria and tuberculosis are the three greatest infectious diseases in the world. Children are the most involved in those diseases. Extremely poor regions, as sub-Saharan, Africa, are the most affected. In the worst case scenario, one of the parasites that causes malaria, Plasmodium falciparum, become resistant to chloroquine and the current therapy. Besides, some drugs used in the mataria chemotherapy are very toxic, showing many side effects, and compromising the treatment. This is a big challenge and facing it requires new strategies.. The development of chemotherapeutic has been inspired in biochemical differences between the parasite and the host. Plasmodíum falciparum needs to biosynthesize phospholipids for their membrane. These phospholipids are very important to the maturation and reproduction of the parasite and occur only in it.. This makes the phospholipids biosynthesis a good target for new and specific antimalarial drug design. Infected red blood cell shows modified permeation, allowing the lipids to be freely transported, what is not usual in the non-infected red blood cells. This said, in the present work the design and synthesis of serine metabolic inhibitors, using the bioisosteric strategy, have been proposed. The inhibition of the phosphatidylserine biosynthesis, an important phospholipid, is expected. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected red-blood cell.. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected redblood cell. In the present work five heterocyclic serine inhibitors: diidroimidazolic, diidroxazolic, diidroxazinico, diidropyriminic and diidroxatiolic. Also synthesized a phospholipid to be connected to the heterocyclic inhibitors.

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T02:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_MariaCarolinaSantos_D.pdf: 2658779 bytes, checksum: 153ed5344815e7e59a41c04c4a965670 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína mTOR é um proteína reguladora chave de vários processos celulares, dentre eles proliferação, crescimento e sobrevivência celular. Fatores de crescimento, oxigênio, status energético e a presença de aminoácidos são fundamentais para que todos esses processos ocorram normalmente. Descobertas realizadas nas últimas décadas mostraram que a via da mTOR encontra-se ativada em vários processos celulares, incluindo formação tumoral e angiogênese. A leucina é um aminoácido de cadeia ramificada que tem o maior potencial em ativar a via da mTOR. Devido sua capacidade de promover a síntese proteica e ganho de massa muscular, seu uso é constantemente estimulado em pacientes com câncer. No entanto, seus efeitos no crescimento tumoral não está claro. Dessa forma, realizamos um estudo cujo objetivo principal foi investigar os efeitos da dieta suplementada com leucina na modulação do crescimento tumoral em diferentes linhagens de células tumorais que se diferenciem em relação à ativação constitutiva da via IRS1/Akt/mTOR. Estudos in vivo e in vitro realizados demonstraram que as células que se diferenciam em relação à ativação da via IRS1/AKT/mTOR respondem de maneira distinta à suplementação com leucina. Linhagens de células tumorais que possuem a via da mTOR constitutivamente ativada, PC-3 e MCF-7, quando suplementadas com doses elevadas de leucina in vitro reduziram a proliferação celular e causaram retenção das células na fase G1 do ciclo celular. Já o xenoenxerto tumoral da PC-3 reduziu sua proliferação e aumentou a morte celular quando os animais foram suplementados com leucina na dieta. Nós também observamos aumento da atividade da mTOR e da p70S6K em todas as linhagens celulares quando suplementadas com leucina. O aumento da atividade da proteína mTOR foi acompanhado de redução na fosforilação de AKTser473 nas células que possuíam a via da PI3K hiperativada (PC-3 e MCF-7). Esse fato pode estar ocorrendo devido a ativação das alças de contraregulação ocasionadas pela estimulação excessiva provocada pela suplementação com leucina, naquelas linhagens celulares que já possuem a via hiperativada. Fato este comprovado pelo aumento da fosforilação em serina 307 da proteína IRS1. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a ativação da via da mTOR é central para determinar a sensibilidade de tumores à dieta suplementada com leucina, podendo modular o desenvolvimento tumoral naquelas células que já possuem a via IRS1/AKT/mTOR constitutivamente ativada. O mecanismo pelo qual a leucina pode retardar o desenvolvimento tumoral em células que possuem a via da mTOR hiperativada parece estar relacionado com o eixo de regulação negativa p70S6K-PI3K, com consequente redução da fosforilação de AKT e liberação das vias apoptóticas nos tecidos tumorais / Abstract: mTOR is a key regulatory protein in various cellular processes including proliferation, cell growth and survival. Growth factors, oxygen, energy status and amino acids are all essential to these processes. New findings in the last few decades have shown that the mTOR pathway is activated in many cellular processes, including tumorigenesis and angiogenesis. The branched chain amino acid leucine has the greatest potential to activate the mTOR pathway. Due to its ability to promote protein synthesis and muscle mass gain, use of leucine is frequently utilized in patients with cancer. However, the effect of leucine on tumor growth is not clear. The aim of this study is therefore to investigate the effect of diet-supplemented leucine on the modulation of tumor growth in several tumor cell lines that differ in the constitutive activation status of the insulin receptor substrate 1 (IRS1)/AKT/mTOR pathway. Both in vitro and in vivo experiments demonstrated different cell proliferation responses when cells were exposed to high doses of leucine. Tumor cell lines PC-3 and MCF-7, which have a constitutively activated mTOR signaling, displayed reduced cell proliferation and G1 phase cell cycle arrest when supplemented with high doses of leucine in vitro. Likewise, leucine-supplemented PC-3 cell tumor xenografts displayed reduced proliferation and increased cell death. We also observed increased activity of mTOR and its downstream substrate p70S6K in all cell lines supplemented with leucine. Increased mTOR activity was accompanied by a reduction in AKT serine 473 (ser473) phosphorylation in cell lines with a hyperactivated PI3K pathway (PC-3 and MCF-7). This most likely occurred because leucine supplementation further increased mTOR and p70S6K activity, triggering the inhibitory p70S6K/IRS1 axis. In fact, we found increased IRS1 ser307 phosphorylation in hyperactivated cell lines (PC-3 and MCF-7) supplemented with high doses of leucine. Therefore, our results suggest that mTOR pathway activation is central to determining the sensitivity of tumors to leucine supplementation. Furthermore, this could affect the response to leucine-supplemented therapies of those tumors in which the PI3K pathway is constitutively activated. The mechanism for this appears to be related to the negative p70S6K/IRS1 regulation axis, with consequent reduction of AKT phosphorylation and the release of apoptotic pathways in tumor tissues / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

La capacidad de Mycobacterium tuberculosis para sobrevivir dentro del macrófago contribuye grandemente a su patogenicidad, latencia y persistencia durante la infección. Este bacilo induce alteraciones en el ambiente intrafagosomal e inhibe la maduración del fagosoma, favoreciendo su supervivencia intracelular. M. tuberculosis PknG secuestra al macrófago precisamente al evitar la fusión fagosoma-lisosoma. En este sentido, PknG representa una familia de dianas novedosas para enfrentar la necesidad de nuevos antimicrobianos para la tuberculosis latente. Aquí, apuntamos a: (i) elucidar la base estructural-molecular del ATP y Mg2+ como cofactores de PknG; (ii) caracterizar los parámetros cinéticos que gobiernan la formación del complejo PknG:ATP; e, (iii) identificar péptidos capaces de unirse a PknG para investigar experimentalmente su interactoma usando enfoques combinatorios como “Phage Display”. Nuestros resultados confirman que PknG se une exclusivamente al ATP con una constante de disociación (KD) de 108.8  22.9 µM. El Mg2+ estabiliza térmicamente a PknG de forma ATP-dependiente. Análisis de estado pre-estacionario muestran que la unión y disociación del ATP es rápida en el complejo PknG:ATP. Usando PknGN-Ext, TPR resolvimos la estructura cristalina en el estado unido al ADP mientras que demostramos que el ATP imposibilita la cristalización. Los análisis bioinformáticos de las librerías enriquecidas por Phage Display identificaron 57 potenciales peptidos que interactuarían con PknG. Una comparación cercana con el proteoma de M. tuberculosis proporcionó un subconjunto de 20 proteínas que podrían interactuar con PknG. Nuestros resultados confirmaron cinco proteínas asociadas a PknG previamente reportadas: PknG, DnaK chaperona, transportador ABC Rv1747, Proteína Ribosomal L23 y Factor de Elongación Tu, resaltando la validez de nuestra plataforma para descubrir el interactoma de PknG. Así, nuestros resultados revelan interacciones proteína-proteína putativas que podrían participar en la supervivencia micobacteriana, mientras que también proporcionan bases sólidas para desarrollar drogas antituberculosas al interrumpir estas interacciones o explotar estos peptidos tipo compuesto líder. / The ability of Mycobacterium tuberculosis to survive inside the macrophage greatly contributes to its pathogenicity, latency and persistence during infection. This bacillus induces alterations in the intraphagosomal environment and inhibits phagosome maturation, thus promoting mycobacterial survival. M. tuberculosis PknG hijacks the macrophage precisely by avoiding phagosome-lysosome fusion. In this sense, PknG represents a family of novel targets to cope with the need for new antimicrobials for latent tuberculosis. Here, we aimed to: (i) elucidate the structural-molecular basis of ATP and Mg2+ as PknG cofactors; (ii) characterize the kinetic parameters governing PknG:ATP complex formation; and, (iii) identify PknG-binding peptides to experimentally query PknG’s interactome using combinatorial approach such as Phage Display. Our results confirm that PknG exclusively binds to ATP with a dissociation constant (KD) of 108.8  22.9 µM. Mg2+ thermally stabilizes PknG in an ATP-dependent manner. Pre-steady-state analyses show that ATP binding and dissociation are rapid in the PknG:ATP complex. Using PknGN-Ext, TPR we solved the ADP-state crystal structure while showing that ATP precludes crystallization. Phage Display and bioinformatic analyses identified 57 potential PknG binders. A close comparison to the M. tuberculosis proteome provided a subset of 20 proteins that may interact with PknG. Our results confirmed five previously reported PknG-associated proteins: PknG, DnaK chaperone, ABC transporter Rv1747, Ribosomal Protein L23 and Elongation Factor Tu, highlighting our platform’s validity to uncover the PknG interactome. Altogether, our results reveal putative protein-protein interactions that may play a role in mycobacterial survival, while also providing solid bases for the development of anti-tuberculosis drugs by disrupting these interactions or exploiting these lead-like peptide molecules. / Tesis

A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions

A fosforilação reversível de proteínas em resíduos de serina e treonina, catalisada por quinases e fosfatases desempenha papel chave na regulação do crescimento e na diferenciação celular em eucariotos. As serina/treonina proteínas fosfatases (PSTPs) são atualmente divididas em três famílias denominadas PPP (PhosphoProtein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) e FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase), sendo que os membros da família PPP são, frequentemente, holoenzimas compostas de uma subunidade catalítica associada a uma ou mais subunidades reguladoras, as quais definem a função, localização e especificidade ao substrato da fosfatase. Neste trabalho, analisamos, através de RT-qPCR, o perfil de expressão dos genes codificadores de subunidades catalíticas de PPPs de Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c e PP5c) e de 16 potenciais parceiros moleculares de algumas destas subunidades catalíticas, tais como DdI-2 e DdI-3, sabidamente inibidores da PP1c. Em resposta ao estresse térmico de células da fase de crescimento, detectamos o aumento dos níveis de transcritos de PP4c e PP6c e também de DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194, esta última, uma proteína de função desconhecida que interage com a PP1c em ensaios de duplo-híbrido em leveduras. Por outro lado, durante o estresse hiper-osmótico observamos a diminuição dos níveis de transcritos de quase todos os genes analisados com exceção de DdI-2 e DDB_G0292194. O nível de expressão de DdPP1c, DdI-2, DdI-3 e DDB_G0292194 também foi analisado em resposta ao estresse oxidativo e apenas o DDB_G0292194 foi induzido nesta condição. Os genes de PP1c, PP4, PP5c e PP6c são expressos durante todo o ciclo de vida de D. discoideum, mas a expressão de alguns dos genes analisados aumenta em uma fase definida do ciclo de desenvolvimento como é o caso de DDB_G0292194 que tem níveis de transcritos aumentados na fase de agregação. Este gene codifica uma proteína hipotética de 559 aminoácidos, que apresenta um domínio FHA (ForkHead-Associated) em sua região aminoterminal, além de uma sequência similar ao motivo consenso de ligação à PP1c. Ensaios no sistema de duplo-híbrido em leveduras confirmaram que a interação entre DDB_G0292194 e DdPP1c independe do domínio FHA. Verificamos, também, que o mutante nocaute de DDB_G0292194 apresenta uma morfologia alterada em condições padrões de cultivo, tanto na fase de crescimento como durante o desenvolvimento, além de uma maior sensibilidade ao estresse oxidativo causado pelo peróxido de hidrogênio quando comparado à linhagem selvagem. Em conjunto, nossos resultados evidenciam a importância das PPPs na resposta a diferentes tipos de estresse e para o crescimento e desenvolvimento de D. discoideum. / Reversible phosphorylation of proteins on serine and threonine residues, catalyzed by kinases and phosphatases plays a key role in growth and cell differentiation regulation in eukaryotes. Protein serine/threonine phosphatases (PSTPs) are currently divided into three families named PPP (Phosphoprotein Phosphatase), PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) and FCP/SCP (RNA polymerase II CTD phosphatase). The PPP family members are often holoenzymes composed of a catalytic subunit associated with one or more regulatory subunits, which define function, localization and substrate specificity of the phosphatase. In this work, we have examined, by RT-qPCR, the expression profile of genes encoding PPP catalytic subunits of Dictyostelium discoideum (PP1c, PP2Ac, PP4c, PP4c-like, PP6c and PP5c) and 16 potential molecular partners for some of these catalytic subunits, such as DdI-2 and DdI-3, both known as PP1c inhibitors. In response to heat stress of growth phase cells, we detected increased levels of transcripts of PP4c and PP6c as well as of DdI-2, DdI-3, and DDB_G0292194, the latter a protein of unknown function that interacts with PP1c in yeast two-hybrid assays. Moreover, during the hyperosmotic stress we observed decreased transcript levels of nearly all genes examined except DdI-2 and DDB_G0292194. The expression level of DdPP1c, DdI-2, DdI-3 and DDB_G0292194 was also analyzed in response to oxidative stress and only DDB_G0292194 was induced in this condition. PP1c, PP4c, PP5c and PP6c genes are expressed throughout growth and development of D. discoideum while transcript levels of some the analysed genes were increased at a defined stage of the developmental cycle as in the case of DDB_G0292194, which increased during aggregation. This gene encodes a hypothetical protein of 559 amino acids bearing a FHA (ForkHead-Associated) domain in its aminoterminal region and a sequence matching the PP1c binding consensus motif. Yeast two-hybrid assays confirmed that DDB_G0292194 and DdPP1c interaction does not depend on FHA domain. We also found that DDB_G0292194 knockout mutant exibits an altered morphology on standard growth and developmental conditions and shows an increased sensitivity to oxidative stress induced by hydrogen peroxide in comparison to the wild type strain. Taken together, our results highlight the importance of PPPs in the response to different types of stress and for growth and development of D. discoideum.

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Adélia Cristina Oliveira Cintra / Banca: Patrick Jack Spencer / Abstract: Toxins isolated from vemos have been used as molecular tools to understand many physiological processes. The enzymes isolated from the venoms of Crotalus and Bothrops species interfere with the control and balance of the hemostatic system (PEREZ et al., 1996) and thus, the determination of their structures is potentially very important. These enzymes are serine proteinases that are similar to tyrpsin in their specificity but are generally referred to as thrombin-like enzymes due to their ability to cleave fibrinogen. The principal aim of this project was to isolate and characterize snake venom poteins that inetefere with the control and regulation of the hemostatic system in quantities and purity required for structural studies. Gel filtration, ion-exchange and HPLC chromatographic techniques were used to isolate convulxin, crotoxin, giroxin and crotamine, the principle components from the venoms of Crotalus durissus collineatus and Crotalus durissus terrificus and the serine and metalo proteinases from the venom of Bothrops jararaca. The purity of the samples was evaluated by SDS-PAGE and the specific activity of the samples was determined. Crystallization experiments were then carried out. / Mestre

A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions