O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

No Brasil, ocorrem anualmente mais de 20.000 acidentes ofídicos, sendo mais de 80 por cento por espécies do gênero Bothrops. Envenenamentos por serpentes desse gênero raramente causam óbito mas, muitas vezes, levam a necrose e infecção secundária, que podem determinar a perda de um membro acometido ou de segmento desse. A dose de soro antibotrópico utilizada para o seu tratamento é baseada na gravidade do envenenamento ao exame inicial. Vários fatores têm sido associados a essa gravidade, mas poucos são os dados científicos e nenhuma avaliação foi feita para acidentes comprovadamente causados por B. jararaca. O presente estudo teve como objetivo identificar: as variáveis associadas à ocorrência de necrose; as variáveis asociadas à ocorrência de abscesso; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de necrose; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de abscesso. Foram analisados no presente estudo 779 casos de acidentes por B. jararaca atendidos no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan, no período de 1982 a 1990. Os dados foram levantados a partir de prontuários médicos arquivados nesse hospital. Os casos que apresentaram necrose e os que evoluiram para abscesso, foram comparados no que se refere a uma série de variáveis, respectivamente, com aqueles que não apresentaram necrose e não evoluiram para abscesso. Correlacionaram-se estatisticamente à análise bivariada com necrose e abscesso (p < 0,05) o acidente por serpentes de grande porte (> 60cm), a picada em perna, o uso de torniquete, a presença de dor, edema, equimose, bolha, choque, sangramento fora da região da picada. Acidentes em determinados meses do ano, picadas nos dedos da mão e alteração da coagulação sanguínea só se correlacionaram com necrose (p < 0,05). Mostraram-se fatores prognósticos independentes para necrose à análise multivariada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento, 60 - 80cm, 80 - lOOcm, 100 - 140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picadas no dedo da mão, e na perna; uso de torniquete; ocorrência de sangramento. Mostraram-se fatores prognósticos independentes para abscesso, à análise multi variada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento 60-80cm, 80- lOOcm, 100-140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picada na perna; alteração da coagulação sanguínea; ocorrência de sangramento. Conclui-se que, as variáveis relacionadas com necrose e aquelas relacionadas com abscesso, os fatores prognósticos independentes para necrose e aqueles para abscesso, são os apresentados acima e que o porte de B. jararaca é o fator prognóstico independente mais importante para necrose e, principalmente, para abscesso, que são tanto mais freqüentes quanto maior o comprimento da serpente. / There is an annual incidence of over 20 000 snakebite cases in Brazil; of these over 80 per cent are caused by Bothrops species. Bothropic envenoming commonly causes necrosis and secondary infection which may lead to loss of part or of all the bitten limb. Fortunately fatalities are rare. During treatment, the dose of antivenom administered is based on the clinical severity of the envenoming. Several factors have been shown to be associated with the severity of the envenoming, however data are scarce and no such studies on Bothrops jararaca exist. The objective of this study was to identify the following: the variables associated with necrosis; the variables associated with abscess formation; the independent prognostic factors of necrosis; the independent prognostic factors of abscess formation. The study analysed 779 B. jararaca envenoming cases admitted from the Hospital Vital Brazil of the Instituto Butanatan in the period from 1982 to 1990. Data were taken from medical records in this hospital. Occurrence of necrosis or of abscesses was independently compared, in the light of a series of specific variables, with cases in which, necrosis or abscesses did not occur. Occurrence of necrosis and of abscess (p<0,05) was correlated by bivariable statistical analysis with the following: bites caused by large-sized snakes (>60cm in length); bites on the leg; use of tourniquet; presence of pain, oedema, equimosis, blisters, shock; and systemic bleeding. Occurrence of necrosis (p<0.05) was only correlated with bites on the fingers, impaired blood coagulability, and with accidents grouped according to the month of the year. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic factors for necrosis: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80- l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on fingers and legs; use of tourniquet; and the presence of haemmorrhage. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic indicators for abscess formation: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80-l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on the leg; impaired blood coagulability; and the presence of haemmorrhage. It is concluded that the forementioned are: associated factors of necrosis and abscess formation; and the independent prognostic factors of necrosis; and independent prognostic factors of abscess. The size of B. jararaca responsible for the bite was shown to be the most important independent prognostic factor of necrosis and, even more so, of abscess.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c. / Snake venoms are considered rich sources of a variety of components that displays important pharmacological activities. The study of these diverse components allows the elucidation of envenoming pathology and the identification of molecules with potential biotechnological applications. The snakes of Crotalus durissus species inhabit various regions of Brazil and their venoms are a complex mixture of proteins (around 95%), carbohydrates, metal cations, biogenic amines, nucleosides, non-enzymatic components, free amino acids and a small lipid fraction. Many components have not yet been isolated, although some of them have already been identified in omics analysis (transcriptome and proteome), like the VEGF (Vascular Endothleial Growth Factor) identified by these techniques in the Crotalus durissus collilineatus (C.d.c) venom. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular weights varying from 20 to 30 kDa for the dimer and 13 to 16 kDa for the monomer. They have a central role in angiogenesis (growth of new vessels) but their role in the envenoming pathophisiology is not elucidated. This study aimed to isolate and perform the elucidation of the structural and functional aspects of a VEGF from C.d.c snake venom. Initially, the venom was submitted to a LC-MS analysis for the global knowledge of its components. Then, it was fractionated by reversed phase chromatography on FPLC system (Fast Protein Liquid Chromatography) and later all the fractions collected were submitted to an ELISA for identification of VEGF. The fractions 23, 24 and 25 proved being positive for VEGF and therefore, were chosen to be studied. These fractions were rechromatographed by three different protocols (cation exchange, reversed phase and anionic exchange). All the subfractions obtained by these chromatographies were analyzed by ELISA for the confirmation and identification of VEGF and by an SDS-PAGE for the analysis of their composition. These subfractions were then reduced, alquilated and digested with tripsin and submitted to spectrometry analysis (ESI-QTOF and PMF) in order to identify tryptic peptides of VEGF and the ones that presented a higher level of purity in the electrophoresis, were analyzed by amino-terminal sequencing to elucidate its primary structure. In these studies were identified an FGF and two isoforms of VEGFs. The chromatography on ion-exchange column (HiTrap QXL column) was the most effective in purifying the compounds of fractions 23, 24 and 25. The six subfractions obtained, after confirmation of the presence of VEGF by the ELISA, electrophoresis and mass spectrometry, were analyzed by another ELISA with anticrotalic serum and the VEGF was recognized with high affinity by the serum, indicating that the molecule is immunogenic. Subsequently, another ELISA was performed with a FGF-antibody to confirm the presence of FGF in the samples. However, the antibody was not able to recognize it in the concentrations used of the fractions. The VEGF found in all six subfractions was denominated as CdcVEGF and submitted to functional analysis. In the in vitro angiogenesis assay, which analyzes the induction of tube formation in Matrigel® by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells, all 6 subfractions induced angiogenesis, confirming that they maintained their activities after the fractionations. Among those, the subfraction 24-QXL3 showed a more potent response, demonstrating a tube formation even more significant than the positive control (bFGF). In the in vitro assay for the migration of human peripheral blood mononuclear cells (chemotaxis technique in boyden chamber), the CdcVEGFs did not significantly alter cell migration at the concentrations tested. The data obtained in this study amplify the knowledge about the composition of C.d.c venom and the development of a new isolation protocol for VEGF, possibiliting its characterization. Additionally, it was possible to identify a new FGF, which had not yet been identified in C.d.c venom.

O carcinoma hepatocelular é um dos tipos de cânceres mais comuns em adultos com sua incidência aumentando mundialmente a cada ano. O tratamento curativo é o transplante de fígado, mas as muitas dificuldades encontradas para o procedimento faz com que a quimioterapia seja amplamente utilizada. Além disso, pode ocorrer quimiorresistência e muitos efeitos adversos, o que impulsiona a busca por novos compostos terapêuticos. L-aminoácido oxidases (LAAO) isoladas de peçonhas de serpentes têm demonstrado bons resultados de citotoxicidade em linhagens celulares tumorais, no entanto estes resultados representam sistemas in vitro em monocultura e estudos recentes demonstram que o microambiente tumoral tem um importante papel na transformação neoplásica, no crescimento e invasão do tumor e na resistência quimioterápica. Assim, avaliou-se uma LAAO purificada da peçonha de Bothrops jararacussu (BjussuLAAO-II) em células de carcinoma hepatocelular (HepG2) em monocultura e em cocultura com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com o objetivo de simular o microambiente tumoral, onde, normalmente, é observado mais de um tipo celular. A atividade citotóxica foi avaliada por meio do ensaio do MTT e do ensaio de sobrevivência clonogênica, a atividade genotóxica por meio do ensaio do cometa, a produção de espécies reativas de oxigênio por meio de fluorescência e os danos ao cromossomo por meio do ensaio do micronúcleo. Em células HepG2, em monocultura, todas as concentrações testadas (0,25 - 5,00 ?g/mL) foram citotóxicas e aumentaram os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio. Verificou-se dano genotóxico na concentração de 5,00 ?g/mL e não houve dano cromossômico. Quando cultivada em cocultura com células HUVEC, as concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL de BjussuLAAO-II foram citotóxicas às células HepG2 e aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio. A concentração de 5,00 ?g/mL induziu danos ao DNA e não houve danos aos cromossomos. Estes efeitos podem ser correlacionados ao aumento de espécies reativas de oxigênio intracelulares e as diferenças entre os resultados de mono e cocultura devido à simulação de parte do microambiente tumoral. Em monocultura de células HUVEC, todas as concentrações testadas foram citotóxicas, houve dano genotóxico nas concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL e nenhuma concentração testada induziu danos cromossômicos. Como há elevada citotoxicidade, danos ao DNA e indução de efeitos pró-oxidantes em células HepG2, BjussuLAAO-II representa um composto promissor no desenvolvimento de novos fármacos antitumorais / Hepatocellular carcinoma is one of the most common types of cancers in adults whose incidence increases worldwide each year. Liver chirurgic and transplantation is the best choice of treatment, but the many difficulties encountered in the procedure cause chemotherapy to be widely used. In addition, chemo resistance and many adverse effects can occur, which improves the search for new therapeutic molecules. L-amino acid oxidases (LAAO) isolated from snake venoms have demonstrated good cytotoxicity results in tumor cell lines, however these results represent in vitro monoculture systems and recent studies have shown that the tumor microenvironment plays an important role in neoplastic transformation in tumor growth and invasion and chemotherapeutic resistance. A LAAO purified from Bothrops jararacussu venom (BjussuLAA-IIO) venom was evaluated in hepatocellular carcinoma (HepG2) cells in monoculture and co-culture with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with the aim of simulating the tumor microenvironment, where more than one cell type is normally observed. Cytotoxic activity was assessed by the MTT assay and clonogenic survival assay, genotoxic activity by comet assay, reactive oxygen species production by fluorescence, and chromosome damage by the micronucleus assay. In HepG2 cells, in monoculture, all concentrations tested (0.25 - 5.00 ?g/mL) were cytotoxic and increased intracellular levels of reactive oxygen species. Genotoxic damage at the concentration of 5.00 ?g/mL was observed and there was no chromosomal damage. When cultured with HUVEC cells, concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL of BjussuLAA-II were cytotoxic to HepG2 cells and increased levels of reactive oxygen species. The concentration of 5.00 ?g/mL induced DNA damage and there was no damage to the chromosomes. These effects can be correlated to the increase of intracellular reactive oxygen species and the differences between the mono and co-culture results due to the simulation of part of the tumor microenvironment. In HUVEC monoculture, all concentrations tested were cytotoxic, genotoxic damage at concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL, and no concentration tested induced chromosome damage. As there is high cytotoxicity, DNA damage and induction of pro-oxidant effects in HepG2 cells, BjussuLAAO-II represents a promising compound in the development of novel antitumor drugs

Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.

Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective