A acidose metabólica é um achado comum em pacientes portadores de Doença Renal Crônica (DRC). Acredita-se que a dieta pode afetar o equilíbrio ácidobase do corpo por meio do fornecimento de precursores ácidos ou de base. No entanto, os resultados inconclusivos apontados na literatura indicam que ainda são necessários estudos bem delineados para comprovar a existência dessa associação. O principal objetivo desse estudo foi determinar o potencial de carga ácida renal (PRAL) proveniente da dieta e avaliar a sua associação com o bicarbonato sérico (HCO3) em pacientes com DRC enquanto em suas dietas habituais. Associações do HCO3 com o gasto energético de repouso (GER) e com oxidações proteicas e lipícas também foram estudadas. Trata-se de um estudo transversal realizado com 100 pacientes distribuídos igualmente nos estágios 3 e 4 da DRC entre 20 e 69 anos. Avaliação do estado nutricional foi feita por meio da antropometria, registro alimentar e exames bioquímicos, o qual incluiu os produtos proteicos de oxidação avançada e os isoprostanos. O HCO3 foi determinado por meio da gasometria venosa. GER foi medido pela calorimetria indireta. O PRAL foi determinado por meio do registro alimentar usando um algoritmo que inclui dados dietéticos da ingestão de proteína, fósforo, magnésio, cálcio e potássio descritos por Remer e Manz (1995). Também foi feita a diferenciação no consumo de proteína animal e vegetal. A análise dos resultados foi feita em quartis de HCO3 para as variáveis GER e parâmetros de oxidação, o restante das análises foram feitas por quartis de PRAL. Para comparação das variações médias dos quartis foi utilizado o teste one-way ANOVA. A associação entre a estimativa do PRAL e o HCO3 foi avaliada por modelos de regressão linear ajustados. A maior parte dos nossos pacientes portadores de DRC encontravam-se com excesso de peso associado a um aumento da circunferência abdominal e da porcentagem de gordura corporal. A mediana do PRAL foi de 6,8 mEq/dia com uma variação entre -24 a 52 mEq/dia. O PRAL mais elevado foi associado com o HCO3 mais baixo de uma forma graduada (p < 0.02). Encontramos uma diferença de 2,07 mmol/L no HCO3 entre o primeiro e o último quartil, sendo o valor do último quartil de PRAL menor em relação ao primeiro. A proteína animal apresentou uma correlação inversa com o bicarbonato sérico. O GER e os marcadores de oxidação lipíca e proteica não apresentaram associações com os níveis de HCO3. Esses resultados reforçam a possibilidade de que dietas com alto teor de carga ácida podem desempenhar um papel relevante no equilíbrio ácidobase em pacientes portadores de DRC, além de consolidar o uso da carga ácida da dieta como uma abordagem diferencial e complementar às outras estratégias no tratamento dietético da DRC. / Metabolic acidosis is a common complication in patients with chronic kidney disease (CKD). Acid-inducing diets are believed to impact on acid-base balance. However, well-designed studies are still needed to prove the association between dietary acid load and serum bicarbonate. The main aim of this study was to calculate the potential renal acid load (PRAL) of selected, frequently consumed foods and to evaluate its association with serum bicarbonate (HCO3) in patients with CKD. Associations of HCO3 with resting energy expenditure (REE) and with protein and lipid oxidation were also studied. It is a cross-sectional study with 100 patients equally distributed in stages 3 and 4 of CKD between 20 and 69 years. Nutritional status was assessed by anthropometric measurements, 3-day food recall, biochemical analysis including advanced oxidation protein products and isoprostanes. Venous blood gases was used to measure HCO3. GER was measured by indirect calorimetry. PRAL was determined by food record using an algorithm that includes protein, phosphorus, magnesium, calcium and potassium intake described by Remer and Manz (1995). Dietary intake of animal and vegetable protein were also evaluate. For analysis, we used quartiles of HCO3 for GER and oxidation parameters and for the others variables we used quartilhes of PRAL. ANOVA one-way test was used to compare the mean of the quartiles. The association between PRAL and HCO3 was assessed by linear regression models. Most of the patients were overweight with increased waist circumference and body fat. The median PRAL was 6.8 mEq/day with a variation between -24 to 52 mEq/day. Higher PRAL was associated with lower serum bicarbonate in a graded fashion (P trend 0.02). Serum bicarbonate was 2.07 mEq/L lower among those in the highest compared with the lowest quartile of PRAL. Animal protein was inversely correlated with serum bicarbonate. REE and lipid and protein oxidation markers showed no association with HCO3 levels. These results reinforce the possibility that diets with high dietary acid load may play a relevant role in the acid-base balance in CKD patients. In addition to consolidating the use of PRAL as a differential and complementary approach to other strategies in the nutritional treatment of CKD.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes DC 2011.pdf: 372122 bytes, checksum: e2a86ba2aff621dd5ddc47d727122a8d (MD5) Previous issue date: 2011-03-28 / The aim of this study was to evaluate the effect of the intake of baru almond, peanut and brazil nut in lipid profile and in lipid peroxidation in rats that were fed with high-fat diet. The effect of baru almond, peanut and brazil nut intakes in lipid profile and in lipid peroxidation were evaluated by bioassay with young adults Wistar rats during two months. The diets were formulated according to American Institute of Nutrition (AIN-93G): 5 fat diets (0.1% cholic acid + 1% cholesterol + 5% lard + 15% of one the fat sources lard and olive oil [controls], baru almond, peanut or brazil nut) and a standard diet (7% soybean oil). Blood samples were collected in order to determine the serum lipid profile and the samples of the animal liver were collected in order to evaluate total malondialdehyde (total MDA), reduced glutathione and vitamin E. Peanut modulated the lipid profile in rats with high-fat diet, decreasing levels of total cholesterol (TC= 84 mg.dL-1) and triglycerides (TG= 46 mg.dL-1), and increased levels of HDL-cholesterol (HDL-c= 44 mg.dL-1), when compared to lard-control (TC= 217 mg.dL-1, TG= 223 mg.dL-1, HDL-c= 24 mg.dL-1) and olive oil-control (TC= 111 mg.dL-1, TG= 39 mg.dL-1, HDL-c= 36 mg.dL-1). The baru almond reduced total cholesterol (TC= 126 mg.dL-1) and triglycerides (61 mg.dL-1), and increased the level of HDL-C (36 mg.dL-1), compared to lard-control. The brazil nut reduced the levels of total cholesterol (119 mg.dL-1) and triglycerides (57 mg.dL-1) in relation to the control lard, but did not increased the level of HDL-c (23 mg.dL-1). The peanut, baru almond and brazil nut reduced lipid peroxidation (total MDA: baru almond= 92 mmol.g protein-1; peanut= 89 mmol.g protein-1; brazil nut= 154 mmol.g protein-1) compared to the lard-control (Total MDA= 346 mmol.g protein-1). Peanut consumption improved GSH (4.3 &#956;mol.g protein-1) and vitamin E (15.2 &#956;mol.g tissue-1) levels, as compared to the baru almond (GSH = 1.8 &#956;mol.g-1 protein; vitamin E = 10.8 &#956;mol.g tissue-1) and the brazil nut (GSH = 1.6 &#956;mol.g-1 protein; vitamin E = 11.6 &#956;mol.g tissue-1). It is recommended the association of these foods in a healthy diet, or as a coadjuvant to reduce the risk of dyslipidemia in populations that consume high-fat diets, replacing, preferably, foods with high content of saturated fat. / O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito da ingestão de amêndoa de baru, amendoim e castanha-do-pará no perfil sérico e na peroxidação de lipídios em ratos tratados com dieta hiperlipídica. O efeito da ingestão desses alimentos no perfil sérico e na peroxidação de lipídios foi avaliado por meio de ensaio biológico com ratos Wistar, machos, adultos jovens, durante dois meses. As dietas foram formuladas segundo o American Institute of Nutrition (AIN-93G), sendo cinco dietas hiperlipídicas (0,1% de ácido cólico + 1% de colesterol + 5% de banha + 15% de uma das fontes lipídicas banha e azeite [controles], amêndoa de baru, amendoim ou castanha-do-pará) e uma dieta padrão (7% de óleo de soja). Ao final do experimento, foram coletados o sangue, para determinação do perfil lipídico sérico, e o fígado, para avaliar os níveis de malondialdeído total (MDA total), glutationa reduzida (GSH) e vitamina E hepáticas. O amendoim modulou o perfil lipídico sérico de ratos com dieta hiperlipídica, reduzindo os níveis de colesterol total (CT= 84 mg.dL-1) e triglicérides (TG= 46 mg.dL-1), e aumentando os níveis de HDL-colesterol (HDL-c=44 mg.dL-1), em relação ao controle-banha (CT= 217 mg.dL-1; TG= 223 mg.dL-1; HDL-c= 24 mg.dL-1) e ao controle-azeite (CT= 111 mg.dL-1; TG= 39 mg.dL-1; HDL-c= 36 mg.dL-1). A amêndoa de baru reduziu o colesterol total (126 mg.dL-1) e triglicérides (61 mg.dL-1), e aumentou os níveis de HDL-c (36 mg.dL-1), em comparação ao controle-banha. A castanhado- pará reduziu os níveis de colesterol total (119 mg.dL-1) e triglicérides (57 mg.dL-1) em relação ao controle banha, mas não aumentou os níveis de HDL-c (23 mg.dL-1). O amendoim, a amêndoa de baru e a castanha-do-pará reduziram a peroxidação lipídica (MDA total: amendoim= 89 mmol.g proteina-1; amêndoa de baru= 92 mmol.g proteina-1; castanha-dopará= 154 mmol.g proteina-1), em relação ao controle-banha (346 mmol.g proteína-1), sendo este efeito mais acentuado para o amendoim, pois ainda manteve os níveis de GSH (4,3 &#956;mol.g proteína-1) e de vitamina E (15,2 &#956;mol.g tecido-1) hepáticos elevados, em comparação à amêndoa de baru (GSH= 1,8 &#956;mol.g proteína-1; vitamina E= 10,8 &#956;mol.g tecido-1) e à castanha-do-pará (GSH= 1,6 &#956;mol.g proteína-1; vitamina E= 11,6 &#956;mol.g tecido-1). Recomenda-se a associação desses alimentos em uma dieta saudável, ou ainda, como coadjuvantes na redução do risco de dislipidemias em grupos populacionais que consomem dietas hiperlipídicas, como substitutos, preferencialmente, de alimentos ricos em gordura saturada.

O presente trabalho visa desenvolver métodos analíticos que permitam determinar as concentrações de oxitetraciclina por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, no leite, plasma e líquido sinovial, além de analisar as concentrações correspondentes em gado leiteiro em lactação portadoras de doença do casco submetidos aos tratamentos intramuscular e tópico. Adicionalmente, são tecidos comentários sobre a eficácia clínica destes tratamentos. Desta forma, objetivando determinar a depuração de oxitetraciclina no organismo dos animais tratados, a concentração no sítio de ação e a quantidade residual em leite, as amostras biológicas foram colhidas e quantificadas em diferentes tempos pré e pós-administração do fármaco. Os métodos analíticos validados apresentaram linearidade, limite de detecção, quantificação, exatidão, precisão e recuperação adequadas à quantificação do antibiótico nas matrizes estudadas. Através da administração do medicamento por via intramuscular, observou-se resíduos acima dos limites máximos (100ppb) estabelecidos pela legislação brasileira para oxitetraciclina no leite até 120 horas após a última administração do medicamento pelo esquema seriado de doses. Já pela via tópica, não foram observados valores residuais na matriz biológica. Do ponto de vista clínico, o tratamento tópico foi eficiente nos animais tratados, levando a cura das lesões. Com relação ao tratamento intramuscular, não foram observados resultados satisfatórios, pois a maioria das lesões não regrediu após as administrações. / The purpose of the present work is to develop methods which allow the determination of oxytetracycline by High Pressure Liquid Chromatography in milk, serum and synovial fluid, as well as analyze the corresponding concentration in milk cattle with foot lameness subjected to intramuscular and topical administration of the antibiotic. It is also commented the clinical efficacy of these two treatments. Thus, to determine the clearance of oxytetracycline in the body of the treated animals, the concentration on the site of action, and the antibiotic residue in milk, biological samples have been collected and analyzed for the oxytetracycline content at different times before and after the drug administrations. The validated analytical methods showed suitable linearity, detection and quantification limits, accuracy, precision and recovery, allowing proper quantification of the antibiotic in the studied biological matrices. When administered intramuscular1y, oxytetracycline residues were observed in milk above the maximum limits (100ppb) established by the brazilian legislation up to 120 hour after the last administration of the medicine using multiple doses treatment, whereas on topical use, residues were not observed in this matrix. When analyzing the clinical aspects, topical treatment was very efficient, leading to the healing of the treated animals. In relation to intramuscular treatment, non satisfactory results were observed, as most of lesion did not disappear after the antibiotic administration.

O presente trabalho visa desenvolver métodos que permitam determinar as concentrações de tetraciclina, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, no plasma e líquido sinovial, além de analisar as concentrações correspondentes em leite de gado leiteiro em lactação submetidos aos tratamentos intravenoso e intravenoso regional. Desta forma, objetivando determinar a depuração da tetracic1ina no organismo dos animais tratados, a concentração do fármaco no sítio de ação e a quantidade residual em leite, as amostras biológicas foram colhidas e quantificadas em diferentes tempos pré e pós-administração do fármaco. Os métodos analíticos validados apresentaram linearidade, limite de detecção, quantificação, exatidão, precisão e recuperação adequados à quantificação do antibiótico nas matrizes biológicas estudadas. As amostras de leite de animais tratados com o medicamento por via intravenosa regional, não apresentaram resíduos após 120h da administração do fármaco. O mesmo ocorreu plasma e líquido sinovial após 48 h. Através da administração via intravenosa do medicamento foram observados resíduos no leite em todos os tempos avaliados, ao passo que no plasma e líquido sinovial, a presença do princípio ativo não foi detectada após 72 horas pós-tratamento. / The purpose of the present work is to develop methods which allow the determination of tetracycline by High Pressure Liquid Chromatography in serum, synovial fluid, as well as analyze the corresponding milk concentrations in milk cows subjected to intravenous and regional intravenous treatment. Therefore, aiming to determine the clearance of tetracycline in the body of the treated animals, the concentration of the active principle in the action site and the residual quantity in milk, biological matrices were collected at different times. The validated analytical methods depicted suitable linearity, detection and quantification limits, accuracy, precision and recovery, allowing the quantification of the antibiotic in the studied biological matrices. In relation to the milk samples from animals treated with the drug by regional intravenous via, they did not present residues of tetracycline after 120 h post-administration. The values were also null for both serum and synovial fluid after 48 h. Through regional intravenous drug administration, milk residues were observed in all the evaluated times whereas for serum and synovial fluid, the presence of the active principle was not detected after 72h post-treatment.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

Le greffon de sang placentaire permet d’accéder aux indications de l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) en l’absence de disponibilité d’un donneur non apparenté compatible. De part ses propriétés intrinsèques, cette source n’expose pas à un risque plus élevée de réaction de greffon contre l’hôte (GVH) au regard des incompatibilités qu’elle autorise ni à un taux plus élevé de rechutes. En revanche, elle comporte un risque supérieur de non prise de greffe et une reconstitution immunologique post‐greffe retardée responsable d’une morbidité et d’une mortalité liées aux infections. L ‘expansion homéostatique périphérique des lymphocytes T du sang placentaire est un facteur déterminant de l’évolution bénéfique ou défavorable de l’allogreffe de CSH de sang placentaire. Dans les premières semaines post‐greffe, la prolifération homéostatique des cellules T joue un rôle critique par son implication dans l’immunité anti‐tumorale et antiinfectieuse. Cette dualité qui a été le fil conducteur de ce travail de thèse est délicate à maitriser car elle concerne des cellules T dont les propriétés sont tout à fait singulières. Il s’agit de cellules T naïves pour la plupart fraichement émigrées du thymus, leur nombre est limité et elles contiennent un contingent non négligeable des cellules T régulatrices.Dans ce contexte, l’impact d’une lymphodéplétion profonde engendrée par l’utilisation du sérum anti‐lymphocytaire (SAL) est encore largement méconnu et tout particulièrement dans le cadre de l’allogreffe de sang placentaire.La première partie de nos travaux comprend deux études rétrospectives évaluant l’impact du sérum anti‐lymphocytaire dans les greffes de sang placentaires après conditionnement myéloablatif et après conditionnement atténué. Les résultats de ces deux études concordent : le SAL est responsable d’une lymphodéplétion profonde chez le receveur qui diminue le taux de GVH aiguë de grade II à IV sans améliorer notablement la prise de greffe. En revanche, il est associé à une altération de la survie globale en aggravant sévèrement la 6 mortalité liée à la procédure. Dans ces deux études, nous avons retrouvé une augmentation du taux de complications infectieuses chez les receveurs qui ont bénéficié d’un conditionnement avec SAL. Au travers des données recueillies, nous avons également observé que les cellules immunocompétentes présentes dans le sang placentaire sont souvent très altérées : en moyenne, seulement 40% d’entre elles sont viables et vont donc pouvoir participer activement à la reconstitution immunitaire post‐greffe.La constatation de cette fragilité des cellules T de sang de cordon nous a conduit à son évaluation in vitro. L’analyse de la viabilité des lymphocytes T démontre qu’elle est globalement médiocre mais variable en fonction des cordons au cours des tous premiers jours de culture sans que les conditions de recueil ou de stockage ne puissent être incriminées. Cette viabilité peut être améliorée par l’exposition quotidienne des cellules T à de faible dose (100 pg/mL) d’interleukine‐7 (IL‐7) sans potentialiser la réponse allogénique. Le risque in vivo d’augmenter significativement l’alloréactivité en utilisant l’IL‐7 avec des greffons non‐manipulés ne peut être occulté. Toutefois, les résultats obtenus in vitro lors de la stimulation allogénique des cellules T de sang de cordon en présence d’IL‐7 montre qu’à faibles doses, celle‐ci améliore préférentiellement la viabilité des lymphocytes quiescents, non engagés dans la réponse alloréactive.L’ensemble de ces résultats souligne l’intérêt d’une connaissance précise non seulement de la quantité mais aussi de la qualité des cellules T de sang de cordon infusées lors de l’allogreffe. Les thérapeutiques actuelles et à venir bloquant leur réactivité ou au contraire potentialisant leur viabilité doivent intégrer cette donnée pour mieux maitriser leur action potentielle et l’adapter au cas par cas. / The placental blood graft provides access to indications for hematopoietic stem cell transplantation (CSH) in the absence of availability of a compatible unrelated donor.

Ce travail apporte une contribution au développement de la stratégie PAT pour les procédés de culture de cellules animales. Il propose l'amélioration de la compréhension et de la maîtrise de la culture de cellules Vero, dédiées à la production de vaccins viraux, et cultivées sur microporteurs dans un milieu sans sérum. Une première partie a permis de cribler les effets de certains groupes de composés du milieu de culture par le suivi de la croissance en microplaques. Puis, des études cinétiques et métaboliques plus approfondies, réalisées en spinners, ont montré que le métabolisme carboné des cellules Vero est saturé par l'accumulation intracellulaire de pyruvate et qu’il est peu orienté vers la croissance. Alors que le renouvellement du milieu ou l'ajout ponctuel de glutamine amélioraient la croissance cellulaire sans ré-équilibrer le métabolisme, la substitution du glucose et de la glutamine a permis de réduire l’apoptose et d'améliorer les performances métaboliques et de croissance. Par ailleurs, les spectroscopies diélectrique et proche-infrarouge ont été évaluées pour le contrôle en-ligne du procédé, en prenant en compte les particularités des cellules adhérentes. Nous avons montré leur capacité à évaluer les concentrations de cellules, de composés du milieu, et à détecter l'apoptose. Enfin, les principales améliorations par substitution de la glutamine ont été appliquées en bioréacteurs, à la production d'un vaccin prototype contre la dengue, dans des conditions proches de celles d'un procédé industriel. Ceci a permis de limiter les renouvellements de milieu pendant l’expansion cellulaire, sans compromettre la production de particules virales infectieuses / This work contributes to the development of the PAT strategy for animal cell culture processes. The aim of this study was to improve the understanding and the control of Vero cell culture, dedicated to the production of viral vaccines, and grown on microcarriers in serum-free medium. An initial study was performed to screen the effects of certain groups of compounds of the culture medium, by the cell growth monitoring in microplates. Then, kinetic and metabolic studies conducted in spinners flasks allowed to go further and to show that the Vero cell metabolism is saturated through the pyruvate intracellular accumulation and that it is not oriented toward growth. While media renewal or punctual addition of glutamine improve the cell growth without improving the metabolism balance, the substitution of glucose and glutamine allowed to reduce apoptosis and to improve growth and metabolic performances.Furthermore, dielectric and near-infrared spectroscopies have been evaluated for the in-line process monitoring, taking into account the particularities of adherent cells. We have demonstrated their ability to quantify cell concentrations, medium component concentrations, and to detect apoptosis. Finally, major improvements by substitution of glutamine have been applied to bioreactor culture to produce a dengue vaccine prototype, with culture conditions close to industrial process. In these cases, medium renewal during the cell expansion was removed without compromising the production of infectious viral particles

It is known that muscles that lack KATP channel activity generate much greater unstimulated [Ca2+]i and force than normal muscles during fatigue. The increase in unstimulated force in KATP channel deficient muscles is abolished by a partial inhibition of L-type Ca2+ channels, suggesting that it is due to a Ca2+ influx through L-type Ca2+ channels and a subsequent increased myoplasmic Ca2+. However, there is also evidence that the increase in resting force is abolished by NAC, a ROS scavenger. The objective of this study was to reconcile these observations by studying the hypothesis that “the increase in resting [Ca2+]i during fatigue in KATP channel deficient muscles starts with an excess Ca2+ influx through L-type Ca2+ channels, followed by an excess ROS production that causes a further increase in resting [Ca2+]i”. To test the hypothesis, single FDB fibres were fatigued with one tetanic contraction/sec for 180 sec. KATP channel deficient fibres were obtained i) by exposing wild type muscle fibers to glibenclamide, a KATP channel blocker and ii) by using fibres from Kir6.2-/- mice, which are null mice for the Kir6.2 gene that encodes for the protein forming the channel pore. Verapamil, a L-type Ca2+ channel blocker, applied at 1 μM, significantly reduced resting [Ca2+]i during fatigue in glibenclamide-exposed wild type fibres. NAC (1 mM) also reduced resting [Ca2+]i in glibenclamide-exposed muscles. The results suggest that the increase in resting [Ca2+]i during fatigue in KATP channel deficient FDB fibres is due to an influx through L-type Ca2+ channels, and an excess ROS production.

Os procedimentos para uso clínico de células-tronco derivadas de tecido adiposo (CT-TA) exigem grandes quantidades de células, por isso, em geral os protocolos envolvem a expansão e cultura celular in vitro. No entanto, as metodologias utilizadas rotineiramente para o cultivo de CT-TA envolvem a utilização de componentes xenobióticos, como a colagenase e o soro fetal bovino (SFB), que representam riscos potencias de reações imunológicas e transmissão de doenças infecciosas. Sendo assim, pretendeu-se no presente estudo analisar diferentes parâmetros metodológicos para isolamento e expansão de CT-TA, na ausência de componentes xenobióticos. Para tanto, as células-tronco foram isoladas por digestão enzimática ou dissociação mecânica e submetidas à expansão na presença de SFB ou lisado de plaquetas humano (LP). Os resultados mostraram que a metodologia de dissociação mecânica representa uma alternativa viável e eficiente para cultivo de CT-TA, e que o emprego de LP como suplemento para o meio de cultura aumentou de forma significativa a proliferação celular. Em função desses resultados, pode-se concluir que é possível a implementação de técnicas de isolamento e expansão de CT-TA, prescindindo-se de componentes xenobióticos. / The procedures for the clinical use of adipose-derived stem cells (ASC) require large amounts of cells, so in general protocols involve culture and cell expansion in vitro.However, the methods routinely used for the culture of ASC involves the use of xenobiotic components, such as collagenase and fetal bovine serum (FBS), that may representing potential risk of immunological reactions and the risk of transmission of infectious diseases. Thus, it was intended in this study to analyze different methodological parameters for the isolation and expansion of ASC in the absence of xenobiotic components. For this, stem cells were isolated by enzymatic digestion and mechanical dissociation and were submitted to expansion in the presence of FBS or human platelet lysate (PL). The results showed that the mechanical dissociation method represents an effective alternative to growing ASC, and that the use of PL as a supplement to the culture medium significantly increased cellular proliferation. In view of these results, we can conclude that it is possible to implement techniques for isolation and expansion of ASC, dispensing xenobiotic components.

[ES] El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Los tratamientos anticancerígenos generalmente usados tienen diversos efectos secundarios producidos por su baja especificidad. Esta es una de las razones por las que se sigue en continua búsqueda de nuevos tratamientos. Dentro de estas nuevas investigaciones se encuentra el extenso campo de la nanomedicina, es decir, el estudio de nuevos materiales a escala nanométrica. Esta permite reducir dichos efectos secundarios aumentando la selectividad y especificidad de los tratamientos. Dentro de los nanomateriales se encuentran las nanopartículas de upconversion que son capaces de absorber luz en el infrarrojo cercano y emitirla en la región ultravioleta-visible. Por otro lado, desde el principio de la historia de la medicina la luz se ha empleado como forma de tratamiento teniendo un rol muy importante. Un inconveniente para dichos tratamientos suele ser la necesidad de emplear luz de la región ultravioleta-visible, pues las biomoléculas son capaces de absorber y produce daño celular. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de nuevas formas de tratamiento anticancerígeno combinando nanomedicina y luz. Para ello se han desarrollado nuevos fármacos fototóxicos y nuevos materiales capaces de ser activados mediante luz infrarroja cercana. En primer lugar, se sintetizaron nuevas fluoroquinolonas para explorar sus propiedades fototóxicas para su uso en fotoquimioterapia (Capítulo 3 de la Tesis). Se estudiaron las características fotofísicas y fotoquímicas de los nuevos compuestos, además de su capacidad para producir mayor fototoxicidad en las células en comparación con las fluoroquinolonas como la lomefloxacina mediante la aplicación de luz ultravioleta. En base a los resultados obtenidos se realizó un estudio para determinar las diferencias entre las interacciones de algunas fluoroquinolonas dihalogenadas, incluidas las comentadas anteriormente, y biomoléculas como ADN y proteínas. La reactividad de sus intermedios fotogenerados también se estudió en el Capítulo 4. Tras conocer en profundidad la capacidad fototóxica de los nuevos fármacos, en el Capítulo 5 se llevó a cabo el diseño de un nanosistema compuesto por fluoroquinolonas y nanopartículas de conversión ascendente. Se demostró la alta capacidad fototóxica de este nuevo nanosistema. De esta manera, se generó actividad fototóxica a partir de una fluoroquinolona sin el uso de luz ultravioleta Por otro lado, la formación de profármacos abre la puerta a la administración selectiva de fármacos contra el cáncer. Los profármacos consisten en la unión fotolábil de una molécula capaz de ser activada por la luz y el fármaco de interés. Sin embargo, un conocimiento profundo de las propiedades fotofísicas y fotoquímicas del fotodisparador y de los potenciales redox de ambos miembros de la diada puede ser crucial para obtener la fotoliberación deseada. Así, en el Capítulo 6, se destacó la relevancia de estos datos utilizando un profármaco formado por un derivado de cumarina como molécula fotoactivable y colchicina como fármaco. Finalmente, en el Capítulo 7 se exploró la síntesis de un nuevo nanosistema que contiene un profármaco formado por un derivado de cumarina unido al fármaco contra el cáncer clorambucilo y nanopartículas biocomatibles de conversión ascendente. La adición de albúmina de suero humano como recubrimiento de las nanopartículas cumple la doble función de obtener nanopartículas biocompatibles y ser el lugar de carga del profármaco. / [CA] El càncer és una de les principals causes de mort a nivell mundial. Els tractaments anticancerígens generalment usats tenen diversos efectes secundaris produïts per la seva baixa especificitat. Aquesta és una de les raons per les que se segueix en contínua recerca de nous tractaments. Dins d'aquestes noves investigacions es troba l'extens camp de la nanomedicina, és a dir, l'estudi de nous materials a escala nanomètrica. Aquesta permet reduir aquests efectes secundaris augmentant la selectivitat i especificitat dels tractaments. Dins dels nanomaterials es troben les nanopartícules de upconversion que són capaços d'absorbir llum en l'infraroig proper i emetre-la en la regió ultraviolada-visible. D'altra banda, des del principi de la història de la medicina la llum s'ha emprat com a forma de tractament tenint un paper molt important. Un inconvenient per aquests tractaments sol ser la necessitat d'emprar llum de la regió ultraviolada-visible, ja que les biomolècules són capaços d'absorbir-la i produïr dany cel·lular. En aquest context, la present Tesi Doctoral es centra en l'estudi de noves formes de tractament anticancerigen combinant nanomedicina i llum. Per això s'han desenvolupat nous fàrmacs fototòxics i nous materials capaços de ser activats mitjançant llum infraroja propera. En primer lloc, es van sintetitzar noves fluoroquinolones per explorar les seves propietats fototòxiques per al seu ús en fotoquimioteràpia (Capítol 3 de la Tesi). Es van estudiar les característiques fotofísiques i fotoquímiques dels nous compostos, a més de la seva capacitat per produir major fototoxicitat en les cèl·lules en comparació amb les fluoroquinolones com la lomefloxacina mitjançant l'aplicació de llum ultraviolada. En base als resultats obtinguts es va realitzar un estudi per determinar les diferències entre les interaccions d'algunes fluoroquinolones dihalogenades, incloses les comentades anteriorment, i biomolècules com ADN i proteïnes. La reactivitat de les seves intermedis fotogenerats també es va estudiar en el Capítol 4. Després de conèixer en profunditat la capacitat fototòxica dels nous fàrmacs, en el Capítol 5 es va dur a terme el disseny d'un nanosistema compost per fluoroquinolones i nanopartícules de upconversion. Es va demostrar l'alta capacitat fototòxica d'aquest nou nanosistema. D'aquesta manera, es va generar activitat fototòxica a partir d'una fluoroquinolona sense l'ús de llum ultraviolada D'altra banda, la formació de profàrmacs obre la porta a l'administració selectiva de fàrmacs contra el càncer. Els profàrmacs consisteixen en la unió fotolábil d'una molècula capaç de ser activada per la llum i el fàrmac d'interès. No obstant això, un coneixement profund de les propietats fotofísiques i fotoquímiques del fotodisparador i dels potencials redox de tots dos membres de la diada pot ser crucial per obtenir el fotoalliberament desitjada. Així, en el Capítol 6, es va destacar la rellevància d'aquestes dades utilitzant un profàrmac format per un derivat de cumarina com a molècula fotoactivable i colquicina com a fàrmac. Finalment, en el Capítol 7 es va explorar la síntesi d'un nou nanosistema que conté un profàrmac format per un derivat de cumarina unit a l'fàrmac contra el càncer clorambucilo i nanopartícules biocomatibles de upconversion. L'addició d'albúmina de sèrum humà com a recobriment de les nanopartícules compleix la doble funció d'obtenir nanopartícules biocompatibles i ser el lloc de càrrega del profàrmac. / [EN] Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Generally used anticancer treatments have various side effects produced by their low specificity. This is one of the reasons why the search for new treatments continues. Within these new investigations is the extensive field of nanomedicine, which can be explained as the study of new materials on a nanometric scale. It can be translated in the reduction of these side effects by increasing the selectivity and specificity of the treatments. Among the nanomaterials are upconversion nanoparticles that are capable of absorbing light in the near infrared and emit it in the ultraviolet-visible region. On the other hand, since the beginning of the history of medicine, light has been used as a form of treatment, having a very important role. A drawback for such treatments is sometimes the need to use light from the ultraviolet-visible region since biomolecules are capable of absorbing and causing cell damage. In this context, this Doctoral Thesis focuses on the study of new forms of anticancer treatment combining nanomedicine and light. For this, new phototoxic drugs and new materials capable of being activated by near infrared light have been developed. First, new fluoroquinolones were synthesized to explore their phototoxic properties for using in photochemotherapy (Chapter 3 of the Thesis). The photophysical and photochemical characteristics of the new compounds were studied, in addition to their ability to produce greater phototoxicity in cells than fluoroquinolones such as lomefloxacin by applying ultraviolet light. Based on the results obtained, a study was carried out to determine the differences between the interactions of some dihalogenated fluoroquinolones including the above commented, and biomolecules such as DNA and proteins. The reactivity of their photo-generated intermediates was also studied in Chapter 4. After a deep knowledge of the phototoxic capacity of the new drugs, design of a nanosystem composed of fluoroquinolones and upconversion nanoparticles was carried out in Chapter 5. The high phototoxic capacity of this new nanosystem was demonstrated. In this way phototoxic activity was generated from a fluoroquinolone without the use of ultraviolet light. On the other hand, the formation of prodrugs opens a door to the selective administration of anticancer drugs. Prodrugs consist of the photolabile binding of a molecule capable of being activated by light and the drug of interest. However, a knowledge of the photophysical and photochemical properties of the phototrigger as well as the redox potentials of both members of the dyad can be crucial to obtain the desired photorelease. Thus, in Chapter 6, the relevance of these data was highlighted using a prodrug formed by a coumarin derivative as a photoactivatable molecule and colchicine as a drug. Finally, in Chapter 7 the synthesis of a new nanosystem containing a prodrug formed by a derivative of coumarin linked to the anticancer drug chlorambucil, and upconversion biocompatible nanoparticles was explored. The addition of human serum albumin as a coating for the nanoparticles fulfills the dual function of obtaining biocompatible nanoparticles and being the loading site for the prodrug. / Anaya González, C. (2021). Design of New Up-conversion Systems for Anticancer Therapies [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172665 / TESIS