The aim of this cross-sectional study was to compare MRI with liver biopsy as a tool for identification and quantification of liver iron overload in patients with sickle cell anemia using blood transfusions. We compared the results of the baseline serum ferritin in the absence of acute complications, the estimated liver iron concentration by magnetic resonance imaging and semiquantitative determination of iron in a fragment of liver tissue obtained by percutaneous biopsy. We observed a statistically significant correlation (r = 0.75) between the degree of iron overload identified in a fragment of liver tissue (Scheuer criteria) and the estimated mean concentration of iron calculated from the intensity of the signal detected by MRI (p = 0.0007). This relationship persists when we aggregate the results in two groups: without or minimal overload (Scheuer zero and one) and presence of overload (Scheuer 2- 4), p = 0.004. MRI was able to differentiate patients with and without iron overload when compared with histological data. MRI is a non-invasive method and can be used to replace liver biopsy for monitoring patients with sickle cell anemia when there is no associated liver disease. To date, this is the first study to make this assessment in patients with sickle cell anemia. / Este trabalho propôs-se a comparar ressonância magnética (RM) com biópsia hepática como ferramentas para identificação e quantificação da sobrecarga hepática de ferro em pacientes portadores de anemia falciforme (AF) que utilizam transfusão de hemácias. Com delineamento transversal, neste estudo foram comparados os resultados da dosagem de ferritina sérica basal (na ausência de intercorrências agudas), da concentração hepática estimada de ferro através de ressonância magnética, e da determinação semiquantitativa de ferro em fragmento de tecido hepático (critérios de Scheuer) obtido por biópsia percutânea. Observou-se correlação estatisticamente significativa (r = 0,75) entre os cinco graus de sobrecarga de ferro identificada em fragmento de tecido hepático e a concentração média estimada de ferro calculada a partir da intensidade de sinal detectada por RM (p = 0,0007), relação que se mantém quando se agrupa os resultados em categorias sem sobrecarga ou sobrecarga discreta (Scheuer zero e 1) e com sobrecarga (Scheuer 2 a 4), com p = 0,004. A RM foi capaz de diferenciar pacientes com e sem sobrecarga de ferro quando comparada aos dados histológicos. Por ser método não-invasivo pode ser utilizado em substituição à biópsia hepática para seguimento dos pacientes com AF, quando não houver doença hepática associada. Até o momento, é o primeiro estudo a fazer essa avaliação em pacientes com AF.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Proenca-Ferreira_Renata_D.pdf: 5501623 bytes, checksum: d6f51a08081eca63858550d8e3d423fd (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma doença causada por uma mutação de ponto (troca do aminoácido glutâmico pela valina), que resulta na síntese de uma hemoglobina anômala, a hemoglobina S (HbS). A principal causa de morbidade para portadores de AF é a vaso-oclusão, que resulta da adesão anormal de células vermelhas e brancas ao endotélio, e consequêntemente diminui o fluxo sanguíneo. As plaquetas de pacientes AF apresentam um aumento das suas propriedades adesivas, e por isso, sugere-se a sua participação no processo de vaso-oclusão. Nossos dados mostraram que essas plaquetas são capazes de ativarem células endoteliais, in vitro, em ensaios de co-culturas com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com plaquetas. A expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e a da E-selectina das células HUVEC aumentou significativamente na sua superfície, após a sua co-incubação com plaquetas de pacientes AF. A ativação das moléculas de adesão depende do contato físico entre plaquetas e células HUVEC, pois a utilização de insertos de transwell inibiu significativamente a expressão de ICAM-1 e E-selectina na superfície das HUVEC. A co-incubação de plaquetas de pacientes AF com as células HUVEC resultou em uma maior produção e liberação de mediadores inflamatórios (citocinas); a interleucina 8 (IL-8) e da interleucina 1 beta (IL-1?) quantificadas do sobrenadante das co-culturas com essas células. As plaquetas desses pacientes possuem propriedades inflamatórias, pois liberaram mais fator plaquetário 4 (PF4), uma quimiocina pró-agregante, quantificada do sobrenadante de cultura dessas plaquetas, em relação às plaquetas de indivíduos saudáveis. O aumento na expressão das moléculas de adesão, integrina ?IIb?3 e P-selectina, na superfície das plaquetas de pacientes AF, podem indicar que há um aumento na sua ativação plaquetária, favorecendo a sua adesão ao endotélio inflamado. O fator nuclear-?B (NF-?B) é um fator de transcrição nuclear muito importante envolvido na ativação de genes, como genes que codificam de moléculas de adesão endotelial, e os nossos resultados de expressão gênica mostraram que há um aumento na expressão do gene NF?BIA (subunidade p50 do NF-?B), em associação com o aumento na expressão do gene ICAM1 (que codifica a molécula de adesão ICAM-1) em HUVEC, após co-cultura dessas células com plaquetas de pacientes AF. A presença do inibidor BAY 11-7082 (inibe a via de sinalização NF-?B), diminuiu a expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e E-selectina na superfície das células HUVEC, quando co-incubadas com plaquetas de pacientes AF. Os nossos dados são importantes e corroboram com a nossa hipótese de que as plaquetas participam no processo de vaso-oclusão na anemia falciforme, pois apresentam a capacidade de ativar células endoteliais (in vitro) tornando-as inflamatórias e mais adesivas. Portanto, sugerimos que as plaquetas representam um importante alvo para novas abordagens terapêuticas na anemia falciforme / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a disease caused by a point mutation (causing the exchange of glutamic acid for valine), which results in the synthesis of an abnormal hemoglobin, hemoglobin S (HbS). The principal cause of morbidity in patients with SCA is vaso-occlusion, which results from the abnormal adhesion of red blood cells and white cells to blood vessel walls, leading to decreases in blood flow. Platelets from SCA patients present an increase in their adhesive properties and, therefore, we have previously suggested that they may participate in the vaso-occlusive process. Our current data show that platelets from SCA patients are able to activate endothelial cells, in vitro, in co-culture assays using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) that were co-incubated with platelets from SCA patients. The expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin was significantly increased on the surface of HUVEC cells after their co-incubation with platelets from SCA patients (SCA platelets). The activation of adhesion molecule expression observed depended on the physical contact between platelets and HUVEC cells, as transwell inserts were able to significantly inhibit the expression of ICAM-1 and E-selectin on HUVEC following their culture in the presence of SCA platelets. The co-incubation of SCA platelets with HUVEC cells also resulted in a higher production and release of inflammatory mediators (cytokines), such as interleukin 8 (IL-8) and interleukin 1 beta (IL-1?) in the supernatant of these co-cultures. Platelets from SCA patients have inflammatory properties, releasing more platelet factor 4 (PF4), a pro-aggregating chemokine, than platelets from healthy subjects. The increased expression of the adhesion molecules, integrin ?IIb?3 and P-selectin, on the surface of platelets from SCA patients, may also indicate an increased platelet activation, favoring their adhesion to the inflamed endothelium. Nuclear factor-?B (NF-?B) is an important nuclear transcription factor involved in the activation of genes, including endothelial adhesion molecules genes. We found an increased gene expression of NF?BIA (encoding the p50 subunit of NF-kB), in association with increased gene expression of ICAM1 (encodes ICAM-1) in HUVEC, following the co-culture of these cells with platelets from SCA patients. The presence of the BAY 11-7082 inhibitor (inhibits the NF-?B signaling pathway) decreased the expressions of the ICAM-1 and E-selectin adhesion molecules on the surface of HUVEC cells when co-incubated with platelets from SCA patients. Our data corroborate our hypothesis that platelets probably participate in the process of vaso-occlusion in sickle cell anemia, since they have the ability to activate endothelial cells (in vitro), in turn, making them more inflammatory and adhesive. As such, we suggest that platelets represent an important target for new therapeutic approaches in sickle cell anemia / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

La drépanocytose est une hémoglobinopathie essentiellement connue pour ses répercussions hématologiques, hémodynamiques et vasculaires chez les patients homozygotes (SCA). Bien que ces sujets présentent une intolérance à l'effort, la littérature est très pauvre concernant les répercussions musculaires de la maladie. Ce travail doctoral nous a permis de caractériser pour la première fois les répercussions structurales, énergétiques et microvasculaires du muscle d’hommes (étude 1) et de femmes (étude 2) drépanocytaires par rapport à des sujets SCT et contrôles (CON). Nos analyses histologiques et biochimiques ont mis en évidence chez les sujets SCA masculins une amyotrophie qui explique au moins en partie la diminution de l’IMC des SCA au dépend de la masse maigre. Nous avons également observé l’altération de plusieurs indices du métabolisme oxydatif (CS, β-HAD et COx) qui pourrait relever de la restriction d’approvisionnement et d’utilisation tissulaire en O2 et expliquer en partie l’intolérance à l’effort. Enfin, un remodelage microvasculaire caractérisé par une raréfaction, une moindre tortuosité et une fragilisation des microvaisseaux a également été démontré. Ce remodelage microvasculaire pourrait contribuer à limiter le risque d’enclavement des hématies falciformées et ainsi réduire les risques de vaso-occlusions. La recherche de ces différents stigmates dans le muscle de la population féminine homologue a rapporté un remodelage musculaire similaire à celui observé chez les hommes SCA, mais ce dernier semble atténué, suggérant un effet genre / Sickle cell anemia (SCA) is a hemoglobinopathy particularly known for its hematologic, hemodynamics and vascular repercussions. Although SCA patients are exercise intolerant, no studies have looked at muscle repercussions. We assessed repercussions of sickle cell anemia on skeletal muscle and its microvasculature in men (study 1) and women (study 2) for the first time. Our results showed that men with SCA displayed an amyotrophy which can at least partly explain the decrease of BMI at the expense of lean muscle mass. We also pointed out a decrease in muscle oxidative capacities (CS, β-HAD and COx) which could result from O2 supply and utilization disorders and partly explain their exercise intolerance. Finally, a microvascular remodeling characterized by a rarefaction, a decrease in microvessel tortuosity and a microvessel weakening was also highlighted. This remodeling could contribute to maintain local blood flow and reduce risks of entrapment of sickle red blood cells in the microvasculature, hence reducing vaso-occlusive risks. Muscle repercussions on a similar female population testified of the same muscle remodeling as the one observed in men with SCA, but this latter seemed to happen at a lesser extent in women with SCA, suggesting a gender effect

As Anemias Hemolíticas compreendem um grupo de doenças em que há redução acentuada na sobrevivência dos glóbulos vermelhos circulantes e a medula óssea não é capaz de compensação, mesmo aumentando sua produção, o que causa anemia desde os primeiros anos da vida da pessoa. Dentre as doenças deste grupo, a Anemia Falciforme (SCA) e a Esferocitose Hereditária (HS) destacam-se por se tratarem de enfermidades com defeitos genéticos intrínsecos das células vermelhas (RBCs) que geram complicações multissistêmicas agudas e crônicas em seus portadores. Por vias patofisiológicas distintas, reticulócitos e respectivas hemácias defeituosas de tais doenças, falciformes e esferócitos, são continuamente aprisionados e fagocitados no baço, importante órgão de destruição de células velhas e/ou defeituosas via hemólise extravascular, o que leva progressivamente à disfunção e eventual perda da função esplênica. O objetivo desse trabalho é avaliar o papel do baço em relação à habilidade e ao fenótipo adesivos de reticulócitos (ret) e eritrócitos (erit) em pacientes com SCA e HS, com e sem função esplênica preservada. Amostras de sangue de 37 pacientes (22 SCA and 15 HS) com função esplênica e 19 pacientes (13 SCA e 6 HS) sem ela foram avaliadas. Ainda, sangue de 22 crianças com SCA foi coletado em estudo longitudinal dos 6 e 29 meses de vida. Todas as amostras de sangue foram analisadas quanto à função esplênica (Contagem de células PIT e de corpúsculos de Howell-Jolly - HJB), quanto ao perfil imunofenotípico celular (em % e em média de intensidade de fluorescência - MFI) e quanto à habilidade de adesão das células vermelhas à laminina e à linhagem celular endotelial HMEC-1. A análise da transição da perda de função esplênica demonstrou que a mesma se intensificou a partir dos 3 anos de idade (PIT: r=0,8; p<0,0001; HJB: r=0,7; p<0.0001). Quanto à imunofenotipagem celular, a contagem PIT se correlacionou positivamente, principalmente com os marcadores CD147 (%ret: r=0,6; p<0,0001; MFIret: r=0,6; p<0,0001; %erit: r=0,7; p<0,0001; MFIerit: r=0,6; p<0,0001), LuBCAM (%ret: r=0,5; p=0,004; MFIret: r=0,6; p<0,0001; %erit: r=0,6; p<0,0003; MFIerit: r=0,4; p<0,004) and CD58 (%ret: r=0,4; p=0,006; MFIret: r=0,5; p<0,0013; %erit: r=0,4; p<0,009; MFIerit: r=0,6; p<0,0001). Na comparação entre ausência ou presença do baço, a perda de sua função exerceu influência no aumento da expressão de adesão de RBCs em SCA, principalmente CD147 (%ret: p=0,002; MFIret: p=0,003; %erit: p<0,0001; MFIerit: p=0,005), LuBCAM (%ret: p=0,0001; MFIret: p<0,0001; %erit: p<0,0001; MFIerit: p<0,0001) e CD58 (%ret: p=0,007; MFIret: p=0,006; %erit: p=0,003; MFIerit: p=0,0004), embora a adesão celular tenha diminuído em pacientes HS esplenectomizados. Na comparação entre as doenças, pacientes HS com o baço apresentaram maior freqüência de adesão celular em relação aos SCA, notavelmente em relação ao LuBCAM (%ret: p=0,0008; MFIret: p=0,03; %erit: p<0,0001; MFIerit: p=0,0002), CD58 (%ret: p=0,0009; %erit: p=0,003) e CD44 (%ret: p=0,009; %erit: p<0,003). No entanto, as amostras SCA sem função esplênica tiveram maior expressão de adesão celular para CD147 (%ret: p=0,006; MFIret: p=0,02; %erit: p=0,02), LuBCAM (%ret: p=0,004; MFIret: p<0,0001), CD36 (%ret: p=0,0002; MFIret: p=0,01), CD242 (%ret: p=0,0008; %erit: p=0,05) e CD49d (%ret: p=0,04). Em relação ao Ensaio de Adesão in vitro, na ausência de baço, os RBCs SCA apresentaram maior adesividade à laminina do que os RBCs SCA com função esplênica preservadaem todas as taxas de fluxo de tensão de cisalhamento empregadas (0,5 dyne/cm2: p=0,01; 1 dyne/cm2: p=0,02; 2 dynes/cm2: p=0,03; 3 dynes/cm2: p=0,03; 5 dynes/cm2: p=0,04 e 7 dynes/cm2: p=0,03). Especialmente, reticulócitos de pacientes sem baço apresentaram maior adesividade à HMEC-1 em baixas tensões de cisalhamento (1 dyne/cm2) em ambas as doenças (SCA: p=0,03; HS: p=0,03). Por fim, reticulócitos apresentaram maior habilidade adesiva à células endoteliais em indivíduos SCA do que em pacientes HS, com (0,5 dyne/cm2: p=0,04; 1 dyne/cm2: p=0,03) ou sem baço (0,5 dyne/cm2: p=0,02; 2 dynes/cm2: p=0,01; 3 dynes/cm2: p=0,03; 5 dynes/cm2: p=0,02 e 7 dynes/cm2: p=0,03). Nossos resultados indicam que embora pertençam ao grupo de Anemias Hemolíticas, as patofisiologias e evoluções clínicas distintas de SCA e de HS levam a padrões imunofenotípicos diferentes de expressão da adesão celular. Na SCA, a ausência de função esplênica teria direta relação com o aumento do fenótipo pró-adesivo e com a adesividade de RBCs SCA, o que traz sérias consequências clínicas aos pacientes, enquanto na HS sem baço, de maneira geral, os eventos de adesão celular são minimizados, embora ainda apresentem reticulócitos e eritrócitos adesivos circulantes após a esplenectomia. / Hemolytic Anemias comprise a group of diseases in which there is marked reduction in the survival of circulating erythrocytes and the bone marrow is not capable of compensation, even by increasing its production, which causes anemia from the first years of the person\'s life on. Among the diseases of this group, Sickle Cell Anemia (SCA) and Hereditary Spherocytosis (HS) stand out for being diseases with intrinsic genetic defects of red blood cells (RBCs) that generate acute and chronic multisystemic complications in their patients. By distinct pathophysiological pathways, reticulocytes and these disease\'s respective defective erythrocytes, sickle and spheroid ones, are continuously trapped and phagocytosed in the spleen, important organ of destruction of old and/or defective cells via extravascular hemolysis, which progressively leads to dysfunction and eventual loss of splenic function. The objective of this study was to evaluate the role of the spleen in relation to the reticulocyte (ret) and erythrocyte (eryt) adhesive ability and adhesion phenotype in patients with SCA and HS, with and without preserved splenic function. Blood samples from 37 patients (22 SCA and 15 HS) with splenic function and 19 patients (13 SCA and 6 HS) without it were evaluated. Still, blood from 22 children with SCA was collected in a longitudinal study from 6 to 29 months of age. All blood samples were analyzed for splenic function [pitted cells (PIT) and Howell-Jolly bodies (HJB) counting], for the cellular immunophenotypic profile (in % and in mean fluorescence intensity - MFI) and for the adhesive ability of RBCs to laminin and to endothelial cell line HMEC-1. Analysis of the splenic function loss transition showed that it intensified from 3 years of age on (PIT: r=0.8, p<0.0001; HJB: r=0.7, p<0.0001). Regarding the cellular immunophenotyping, PIT count correlated positively, mainly with CD147 markers (%ret: r=0.6, p<0.0001; MFIret: r=0.6, p<0.0001; %eryt: r=0.7, p<0.0001; MFIeryt: r=0.6, p<0.0001), LuBCAM (%ret: r=0.5, p=0.004; MFIret: r=0.6, p<0.0001; %eryt: r=0.6, p<0.0003; MFIeryt: r=0.4, p<0.004) and CD58 (%ret: r=0.4, p=0.006; MFIret: r=0.5, p<0.0013; %eryt: r=0.4, p<0.009; MFIeryt: r=0.6, p<0.0001). In the comparison between spleen absence or presence, the loss of its function exerted influence on the increase of RBCs adhesion expression in SCA, mainly on CD147 (%ret: p=0.002; MFIret: p=0.003; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p=0.005), LuBCAM (%ret: p=0.0001; MFIret: p<0.0001; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p<0.0001) e CD58 (%ret: p=0.007; MFIret: p=0.006; %eryt: p=0.003; MFIeryt: p=0.0004), although cell adhesion has been decreased in splenectomized HS patients. In the comparison between diseases, HS patients with spleen showed higher cell adhesion frequency compared to SCA, notably in relation to LuBCAM (%ret: p=0.0008; MFIret: p=0.03; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p=0.0002), CD58 (%ret: p=0.0009; %eryt: p=0.003) and CD44 (%ret: p=0.009; %eryt: p<0.003). However, SCA samples without splenic function had higher cell adhesion expression for CD147 (%ret: p=0.006; MFIret: p=0.02; %eryt: p=0.02), LuBCAM (%ret: p=0.004; MFIret: p<0.0001), CD36 (%ret: p=0.0002; MFIret: p=0.01), CD242 (%ret: p=0.0008; %eryt: p=0.05) and CD49d (%ret: p=0.04). Concerning the in vitro Adhesion Assay, in the spleen absence, SCA RBCs showed greater adhesiveness to laminin than SCA RBCs with preserved splenic function did at all shear stress flow rates applied (0.5 dyne/cm2: p=0.01, 1 dyne/cm2: p=0.02, 2 dynes/cm2: p=0.03, 3 dynes/cm2: p=0.03, 5 dynes/cm2: p=0.04 and 7 dynes/cm2:p=0.03). Especially, reticulocytes from patients without spleen showed higher adhesiveness to HMEC-1 at low shear stresses (1 dyne/cm2) in both diseases (SCA: p=0.03; HS: p=0.03). Finally, reticulocytes showed greater adhesion ability to endothelial cells in SCA subjects than in HS patients, with (0.5 dyne/cm2: p=0.04 and 1 dyne/cm2: p=0.03) or without spleen (0.5 dyne/cm2: p=0.02, 2 dynes/cm2: p=0.01, 3 dynes/cm2: p=0.03, 5 dynes/cm2: p=0.02 and 7 dynes/cm2: p=0.03). Our results indicate that although both diseases belong to the Hemolytic Anemias group, SCA and HS distinct pathophysiologies and clinical evolution lead to different immunophenotypic patterns of cell adhesion expression. In SCA, the absence of splenic function may have a direct relation with the increase of SCA RBCs proadhesive phenotype and adhesiveness, which brings serious clinical consequences to the patients, whereas in HS without spleen, in general, cellular adhesion events are minimized, although they still present adhesive circulating reticulocytes and erythrocytes after splenectomy.

La drépanocytose est une maladie génétique touchant l'hémoglobine, de transmission autosomique récessive, caractérisée par trois grandes manifestations cliniques :anémie hémolytique chronique, phénomènes vaso-occlusifs et susceptibilité accrue aux infections. Dans diverses régions du monde et particulièrement en Afrique subsaharienne, cette maladie est très fréquente et constitue un problème crucial de santé publique. Sa physiopathologie complexe est basée sur la polymérisation de l’hémoglobine anormale (Hb S) qui provoque une falciformation et une déshydratation du globule rouge. Les hématies falciformées sont impliquées dans les phénomènes de vaso-occlusion. Le traitement et la prise en charge de la maladie reste toujours problématique. A l’heure actuelle, le seul traitement curatif est la transplantation de moelle osseuse mais les donneurs compatibles sont assez rares et les coûts élevés. Des traitements symptomatiques et préventifs (principalement la transfusion et l’hydroxyurée) existent toutefois.<p>Des études in vitro et in vivo ont démontré les possibilités thérapeutiques de certaines molécules dont les cibles sont les transports membranaires impliqués dans la déshydratation cellulaire.<p>Depuis les années 1990, le cromoglycate de sodium, un médicament anti-allergique et anti-asthmatique, a montré un intérêt potentiel dans le traitement de la drépanocytose. Néanmoins, son mode d’action n’est actuellement pas connu. Notre travail a pour but de contribuer à l’étude du mécanisme d’action anti-drépanocytaire de la molécule.<p>Dans un premier temps, des globules rouges drépanocytaires préincubés en absence ou présence de cromoglycate ont été désoxygénés par un flux d’azote. Ensuite, les concentrations intracellulaires en Na+ et en K+ ont été mesurées. Les résultats de ces investigations ont montré un effet inhibiteur du cromoglycate sur l’efflux de K+ et l’influx du Na+ provoqués par la désoxygénation.<p>Sur base de ces observations, des expériences testant l’action du cromoglycate sur le canal K+ dépendant du Ca2+ (canal de Gardos) ont été effectuées. Dans des globules rouges normaux et drépanocytaires, ce canal a été activé par augmentation de la concentration intra-cellulaire en Ca2+. L'effet du cromoglycate a été comparé à celui d'un inhibiteur connu, le clotrimazole. Les résultats ont montré que 1e cromoglycate n'exerce pas d'effet inhibiteur sur le canal de Gardos, au contraire du clotrimazole. Il est également sans effet significatif sur la Ca2+-ATPase.<p>Nous avons ensuite investigué l’implication du Ca2+ dans les perturbations du flux des ions K+ et Na+. Des globules rouges drépanocytaires ont été incubés en absence et présence d’EGTA 5 mmol/l ou de BAPTA 10 µmol/l, respectivement chélateurs du Ca2+ extra et intracellulaire. Après désoxygénation, les concentrations intracellulaires en Na+ et K+ ont été mesurées. Les résultats de ces expériences montrent que seul le chélateur du Ca2+ extracellulaire bloque les perturbations ioniques causées par la désoxygénation. Ces résultats viennent donc confirmer les observations d’autres auteurs quant à l’implication du Ca2+ extracellulaire dans la fuite de K+ des globules drépanocytaires soumis à la désoxygénation. <p>Enfin, l’effet du cromoglycate sur l’influx de Ca2+ extracellulaire et sur la falciformation induits par le métabisulfite a été mesuré et comparé à celui du clotrimazole. Des globules rouges drépanocytaires, prélablement chargés en Fura Red, un indicateur fluorescent du Ca2+, ont été exposés au métabisulfite, un puissant réducteur provoquant une falciformation rapide. L’influx de Ca2+ a été mesuré par la diminution de la fluorescence du Fura Red. Parallèlement, la falciformation a été suivie en mesurant la lumière diffractée à 90° par les cellules. Les résultats de ces investigations montrent que le cromoglycate (1 µmol/l) et le clotrimazole (10 µmol/l) ont des effets inhibiteurs comparables sur la falciformation mais que le cromoglycate freine significativement plus l'influx de Ca2+ au cours de ce processus.<p>En conclusion, sur base de ces différents tests in vitro, le cromoglycate inhibe la falciformation induite par la désoxygénation. Cette inhibition résulte du blocage des perturbations ioniques induites par la désoxygénation en empêchant l’influx du Ca2+ extracellulaire et secondairement la fuite du K+ intracellulaire, ce qui inhibe la déshydratation cellulaire.<p>La diminution des crises vaso-occlusives observée chez les patients drépanocytaires traités par le cromoglycate s’expliquerait donc par ces effets. En présence de cromoglycate, les globules rouges sont moins déshydratés et falciforment moins rapidement. Ils sont dès lors moins impliqués dans les phénomènes de vaso-occlusion, ce qui améliore l’état des patients.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / High-efficiency transduction of hematopoietic stem cells (HSCs) by recombinant adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) vectors is limited by (i) inadequate expression of cellular receptor/co-receptors for AAV2; (ii) impaired intracellular trafficking and uncoating in the nucleus; (iii) failure of the genome to undergo second-strand DNA synthesis; and (iv) use of sub-optimal promoters. Systematic studies were undertaken to develop alternative strategies to achieve high-efficiency transduction of primary murine HSCs and lineage-restricted transgene expression in a bone marrow transplant model in vivo. These included the use of: (i) additional AAV serotype (AAV1, AAV7, AAV8, AAV10) vectors; (ii) self-complementary AAV (scAAV) vectors; and (iii) erythroid cell-specific promoters. scAAV1 and scAAV7 vectors containing an enhanced green-fluorescent protein (EGFP) reporter gene under the control of hematopoietic cell-specific enhancers/promoters allowed sustained transgene expression in an erythroid lineage-restricted manner in both primary and secondary transplant recipient mice. Self complementary AAV vectors containing an anti-sickling human beta-globin gene under the control of either the beta-globin gene promoter/enhancer, or the human parvovirus B19 promoter at map-unit 6 (B19p6) were tested for their efficacy in a human erythroid cell line (K562), and in primary murine hematopoietic progenitor cells (c-kit+, lin-). These studies revealed that (i) scAAV2-beta-globin vectors containing only the HS2 enhancer are more efficient than ssAAV2-beta-globin vectors containing the HS2+HS3+HS4 enhancers; (ii) scAAV-beta-globin vectors containing only the B19p6 promoter are more efficient than their counterparts containing the HS2 enhancer/beta-globin promoter; and (iii) scAAV2-B19p6-beta-globin vectors in K562 cells, and scAAV1-B19p6-beta-globin vectors in murine c-kit+, lin- cells, yield efficient expression of the beta-globin protein. These studies suggest that the combined use of scAAV serotype vectors and the B19p6 promoter may lead to expression of therapeutic levels of beta-globin gene in human erythroid cells, which has implications in the potential gene therapy of beta-thalassemia and sickle cell disease.

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Introdução - Alterações cardíacas na anemia falciforme (AF) são frequentes e iniciam-se precocemente. Há evidências de que exista também disfunção na regulação do sistema nervoso autônomo o que pode contribuir com eventos de morbidade. Objetivos Avaliar a modulação autonômica cardíaca por meio da variabilidade da frequência cardíaca em crianças e adolescentes com anemia falciforme. Método - Estudo analítico no qual foi realizada uma comparação da variabilidade da frequência cardíaca em 45 crianças e adolescentes, menores de 20 anos, com anemia falciforme, com um grupo controle pareado um a um por idade e sexo. A frequência cardíaca foi obtida pelo frequencímetro de pulso e analisada, batimento a batimento. Estes pacientes são usuários do ambulatório de hematologia pediátrica do Sistema Único de Saúde. Esta pesquisa está em consonância com a resolução 466/2012 do Ministério da Saúde. Resultados - Observamos diferença significativa nos índices do domínio da frequência (VLF, LF, HF e LF/HF). Estas diferenças não foram observadas nos pacientes em uso de hidroxiureia. Conclusão - Existe uma disfunção autonômica na AF que ocorre desde a infância, podendo estar relacionada a uma menor modulação do simpático e uma maior modulação do parassimpático. Esta diferença não foi observada em pacientes em uso de hidroxiureia / Introduction - Cardiac changes in sickle cell disease (AF) are frequent and begin early. There is evidence that there is also dysfunction in the regulation of the autonomic nervous system, which may contribute to morbidity events. Objectives - To evaluate the autonomic cardiac modulation by heart rate variability in children and adolescents with sickle cell anemia. Method - An analytical study comparing the heart rate variability of 45 children and adolescents, younger than 20 years, with sickle cell anemia, with a control group matched one by one by age and sex. The heart rate was obtained by pulse frequency and analyzed, beat by beat. These patients are attending the pediatric hematology outpatient of the National Health System. Results - We observed a significant difference in the frequency domain indexes (VLF, LF, HF and LF / HF). The results of this study are in agreement with resolution 466/2012 of the Ministry of Health of Brazil. These differences were not observed in patients taking hydroxyurea. Conclusion - There is an autonomic dysfunction in AF that occurs from childhood, and may be related to a lower modulation of the sympathetic and greater modulation of the parasympathetic. This difference was not observed in patients taking hydroxyurea

Introdução: A doença falciforme (DF) é a afecção hematológica hereditária de maior prevalência no mundo, sendo que a anemia falciforme (AF) é a forma mais grave com elevada morbidade e mortalidade. Alterações cardíacas são reconhecidamente associadas à AF, como aumento cavitário, hipertensão arterial pulmonar e disfunção diastólica do ventrículo esquerdo. No entanto, ainda não existe consenso quanto à função sistólica ventricular nesses pacientes. O objetivo deste estudo foi o de investigar a função ventricular de pacientes com anemia falciforme utilizando o strain e o twist ventricular obtidos pelo speckle tracking bidimensional, e reconhecer os indivíduos sob maior risco cardiovascular, em que a instituição precoce de tratamento específico poderá beneficiar essa população. Métodos: Foram recrutados 40 pacientes com anemia falciforme (23,5 ± 9,3 anos; 24 homens) e 40 controles saudáveis pareados por sexo e idade, submetidos à entrevista estruturada, ecocardiograma transtorácico, cintilografia pulmonar ventilação perfusão e coleta de amostras de sangue. Todos os indivíduos foram submetidos à avaliação ecocardiográfica convencional padrão e subsequente avaliação offline do strain sistólico biventricular e estudo rotacional do ventrículo esquerdo utilizando speckle-tracking ecocardiográfico. Resultados: Os pacientes com AF apresentaram volume do VE indexado, massa do VE indexado, pressão arterial pulmonar e E/E\' médio superiores aos controles. As medidas de FE do VE, excursão sistólica do plano da tricúspide (TAPSE), Strain Global do VE (longitudinal, circunferencial, radial) e Strain Global do VD (longitudinal) não evidenciaram diferenças entre os grupos. Twist VE se mostrou reduzido em comparação aos controles (7,4 ± 1,2? vs 10,7 ± 1,8? , P <0,0001 ) e Tempo de pico de rotação apical prolongado (366,7 ± 26,1ms vs 344,6 ± 11,7ms , P <0,0001 ). Algumas variáveis se mostraram fortemente relacionadas ao twist VE, como índice de gravidade clínico (Rho= - 0,97, Z value= - 6,05, P < 0,0001), relação E/E\' médio (r = 0,94, F valor= 156.9, p<0,0001), IVDFVE (índice do volume diastólico final do ventrículo esquerdo)(r = 0,81 e p<0,0001) e pressão sistólica arterial pulmonar (r = 0,72 e p<0,0001). Conclusões: Os resultados deste trabalho indicam que o twist ventricular esquerdo derivado do speckle tracking bidimensional encontra-se alterado em pacientes com anemia falciforme e função sistólica ventricular preservada, avaliada pela metodologia convencional, e existe forte correlação entre o twist ventricular esquerdo e o índice clínico de gravidade, relação E/E\', índice do volume diastólico final do ventrículo esquerdo e pressão sistólica arterial pulmonar. / Background: Sickle cell disease (SCD) is the most prevalent hematological condition in the world, with sickle cell anemia (SCA) being its most serious form, displaying a high level of morbidity and mortality. Cardiac changes are known to be associated with SCA, including an increase in cardiac chamber size, pulmonary hypertension and left ventricle diastolic dysfunction. However, there is still no consensus regarding the ventricular systolic function in these patients. The purpose of this study is to investigate the ventricular function of patients with sickle cell anemia utilizing the strain and ventricular twist, obtained by two-dimensional speckle tracking, as well as to identify individuals with higher cardiovascular risk, in which early application of specific treatment could benefit this group of people. Methods: 40 patients were recruited with sickle cell anemia (ages 23.5 ± 9.3 years; 24 males) and 40 healthy control individuals paired by gender and age, submitted to structured interviews, transthoracic echocardiogram, pulmonary scintigraphy and collection of blood samples. All individuals were submitted to a standard echocardiographic evaluation and subsequent off line evaluation of the biventricular systolic strain and rotational study of the left ventricle using echocardiographic speckle-tracking. Results: Patients with SCA presented LV volume indices, LV mass Indices, pulmonary arterial pressure and E/ E\' ratios statistically higher than the control individuals. Measurements of Ejection Fraction (EF) of the left ventricle, tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE), Overall LV Strain (Longitudinal, Circumferential, and Radial) and Overall RV Strain (Longitudinal) did not present differences between the groups. LV twist was significantly lower in relation to the control group (7,4 ± 1,2? vs 10,7 ± 1,8? , P <0,0001 ) and prolonged time to peak apical rotation (366.7 ± 26.1ms vs 344.6 ± 11.7ms , P <0.0001 ). In addition, some variables showed themselves to be strongly related to LV twist such as the clinical severity index ( Rho= - 0.97, Z value= - 6.05, P < 0.0001), E/E\' Ratio (r = 0.94, F value=156.9 e p<0.0001) ), left ventricle end diastolic volume index (LVEDV index) (r = 0,81, p<0,0001) and pulmonary systolic arterial pressure (r = 0.72 e p<0.0001). Conclusions: The results of this study indicate that the left ventricular twist derived from two-dimensional speckle tracking is altered in patients with sickle cell anemia and a preserved ventricular systolic function, evaluated using conventional methodology and that there is a strong correlation between left ventricular twist and the clinical severity index, E/E\' ratio, left ventricle end diastolic volume index and the pulmonary systolic arterial pressure.

Introdução - Alterações cardíacas na anemia falciforme (AF) são frequentes e iniciam-se precocemente. Há evidências de que exista também disfunção na regulação do sistema nervoso autônomo o que pode contribuir com eventos de morbidade. Objetivos Avaliar a modulação autonômica cardíaca por meio da variabilidade da frequência cardíaca em crianças e adolescentes com anemia falciforme. Método - Estudo analítico no qual foi realizada uma comparação da variabilidade da frequência cardíaca em 45 crianças e adolescentes, menores de 20 anos, com anemia falciforme, com um grupo controle pareado um a um por idade e sexo. A frequência cardíaca foi obtida pelo frequencímetro de pulso e analisada, batimento a batimento. Estes pacientes são usuários do ambulatório de hematologia pediátrica do Sistema Único de Saúde. Esta pesquisa está em consonância com a resolução 466/2012 do Ministério da Saúde. Resultados - Observamos diferença significativa nos índices do domínio da frequência (VLF, LF, HF e LF/HF). Estas diferenças não foram observadas nos pacientes em uso de hidroxiureia. Conclusão - Existe uma disfunção autonômica na AF que ocorre desde a infância, podendo estar relacionada a uma menor modulação do simpático e uma maior modulação do parassimpático. Esta diferença não foi observada em pacientes em uso de hidroxiureia / Introduction - Cardiac changes in sickle cell disease (AF) are frequent and begin early. There is evidence that there is also dysfunction in the regulation of the autonomic nervous system, which may contribute to morbidity events. Objectives - To evaluate the autonomic cardiac modulation by heart rate variability in children and adolescents with sickle cell anemia. Method - An analytical study comparing the heart rate variability of 45 children and adolescents, younger than 20 years, with sickle cell anemia, with a control group matched one by one by age and sex. The heart rate was obtained by pulse frequency and analyzed, beat by beat. These patients are attending the pediatric hematology outpatient of the National Health System. Results - We observed a significant difference in the frequency domain indexes (VLF, LF, HF and LF / HF). The results of this study are in agreement with resolution 466/2012 of the Ministry of Health of Brazil. These differences were not observed in patients taking hydroxyurea. Conclusion - There is an autonomic dysfunction in AF that occurs from childhood, and may be related to a lower modulation of the sympathetic and greater modulation of the parasympathetic. This difference was not observed in patients taking hydroxyurea