Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv. / Härtill 4 uppsatser.

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2286182 bytes, checksum: 07252744b8ec020f06d0a67c3c49bc67 (MD5) Previous issue date: 2009-11-13 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The study aimed to establish an efficient protocol for somatic embryogenesis of the oil palm, especially all of cultivars explored in Brazil, as well as to acomplish the anatomical caracterization of the embryogenic process. For induction of somatic embryogenesis we used two explants types, leaves segments and female inflorescences, resulting in two experiments. In the first experiment, sections of the 5 mm in immature leaves from two oil palm genotypes (G1001 e G2301) of 1,5 years of age were inoculated in culture medium Y3 (Eeuwens, 1978) supplemented with 0.3% activated charcoal and 2,4-D at four concentrations (800, 1000, 1200 and 1400 µM). Higher percentage of callus induction was obtained in G2301 leaf explants submitted to the concentration 800 µM of 2,4-D. The obtaining of pro-embryogenic masses starting of the calli occurred in medium supplemented with 9 µM 2,4-D added to 1000 µM putrescine or 100 µM spermine. A higher percentage of regeneration of somatic embryos occurred from pro-embryogenic masses that were pre-conditioned and inoculated on regeneration medium supplemented with 0.045 µM 2,4-D and 1000 µM putrescine. The somatic embryos regenerated exhibited characteristic protoderm, procambium strands and shoot meristem and germinated in culture medium Y3 added 0.54 µM ANA and 1000 µM putrescine. The seedlings showed simultaneous development of shoot and root and 70.4% of plants could be successfully acclimatized. In the second experiment, rachillas taken from immature female inflorescences in two developmental stages were inoculated in different culture media (MS and Y3), the supplemented with 475 µM of different auxins (Picloram and 2,4-D) and 0.3% activated charcoal . The development of flowers occurred after 120 days of inoculation in vitro, depending on the developmental stage of the inflorescence and the growing medium. The flowers formed in Y3 culture medium were detached from rachillas and inoculated in the same culture medium with reduced auxin concentrations for 9 µM being combined or not with 1000 µM of putrescine. After 60 days, greater callus formation occurred in flowers grown in medium supplemented with 9 µM Picloram combined with 1000 µM of putrescine. The regeneration of somatic embryos occurred after reduction at 100 times the concentration of auxin in the culture medium, maintaining the same concentration of putrescine. Embryos showed protoderm well defined, delimiting a homogeneous mass of cells corresponding to the ground meristem, interspersed with well-defined procambium strands. By means of histological analysis it was found that the formation occurred from the perivascular regions in the gynoecium and embryo formation occurred from the regions of meristematic callus, following the multicellular pattern. / O trabalho teve como objetivos estabelecer um protocolo eficiente para embriogênese somática do dendezeiro, sobretudo de cultivares exploradas no Brasil, bem como realizar a caracterização anatômica do processo embriogênico. Para a indução da embriogênese somática utilizou-se dois tipos de explantes, segmentos foliares e inflorescências femininas, resultando em dois experimentos. No primeiro experimento, secções de 5 mm de folhas imaturas retiradas de dois genótipos (G1001 e G2301) de dendê de 1,5 ano de idade foram inoculadas em meio de cultura Y3 (Eeuwens, 1978), adicionado de 0,3% de carvão ativado e quatro concentrações de 2,4-D (800, 1000, 1200 e 1400 µM). Maior porcentagem de indução de calos foi obtida em explantes foliares do G2301 submetidos à concentração 800 µM de 2,4-D. A obtenção de massas pró-embriogênicas a partir dos calos ocorreu em meio suplementado com 9 µM de 2,4-D adicionado de 1000 µM putrescina ou 100 µM espermina. Maior porcentagem de regeneração de embriões somáticos ocorreu a partir de massas pró-embriogênicas que passaram pelo pré- condicionamento e foram inoculadas em meio de regeneração adicionado de 0,045 µM 2,4-D e 1000 µM putrescina. Os embriões somáticos regenerados exibiram protoderme característica, cordões de procâmbio e meristema apical e germinaram em meio de cultura Y3 adicionado de 0,54 µM ANA e 1000 µM putrescina. As plântulas obtidas apresentaram desenvolvimento simultâneo de parte aérea e radícula, e puderam ser aclimatizadas, sendo de 70,4% a porcentagem de plantas obtidas. No segundo experimento, ráquilas retiradas de inflorescências femininas imaturas, em dois estágios de desenvolvimento foram inoculadas em diferentes meios de cultivo (MS e Y3), adicionado de 475 µM de diferentes auxinas (Picloram e 2,4-D) e 0,3% de carvão ativado. O desenvolvimento das flores ocorreu após 120 dias da inoculação in vitro, em função do estágio de desenvolvimento da inflorescência e do meio de cultivo utilizado. As flores formadas em meio de cultivo Y3 foram destacadas das ráquilas e inoculadas em mesmo meio de cultivo com redução da concentração das auxinas para 9 µM sendo combinadas ou não com 1000 µM de putrescina. Após 60 dias, maior formação de calos ocorreu em flores cultivadas em meio adicionado de 9 µM Picloram combinado com 1000 µM de putrescina. A regeneração dos embriões somáticos ocorreu após a redução em 100 vezes na concentração de auxina no meio de cultivo, sendo mantida a mesma concentração de putrescina. Os embriões apresentaram protoderme bem definida, delimitando uma massa homogênea de células correspondentes ao meristema fundamental, entremeada por cordões procambiais bem definidos. Por meio da análise histológica verificou-se que a formação de calos ocorreu a partir das regiões perivasculares no gineceu e a formação dos embriões ocorreu a partir das regiões meristemáticas destes calos, seguindo o padrão multicelular.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2068629 bytes, checksum: eb96e9d8515f536c1ff0792a31972219 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work, the propagation in vitro of Anthurium andraeanum cv. Eidibel through somatic embryogenesis was investigated, evaluating the induction of the embryogenic cultures (Experiment I); pre-maturation of the somatic embryos (Experiment II); and maturation of the somatic embryos with subsequent regeneration of the plants (Experiment III). In Experiment I, the subdivision of plants of anturio established in vitro was used, to obtain the explant sources. Analyzed in DIC with factorial 5 x 5 x 5, with five explant types (whole leaves were cut across the midrib of leaves; petioles; stem segments with one bud; and root segment without the apex radicular; each explant was cut into pieces of about 1.0 cm); five auxins (Picloram, ANA, AIB, 2.4-D and Picloram) in five concentrations (0.0; 2.5; 5.0; 7.5 and 10.0 μM) and five additional witness, in other words, each explant source added to the treatment without auxin. The repetition was composed by five Petri dishes (90 x 15 mm), containing 25 mL of Pierik medium, and each unit experimental nine explant/placa. Cultures were maintained in growth room, at 25 ± 2 ºC, in the darkness. After 60 days of cultivation, it was evaluated the presence of embryogenic cultures, shoots, roots and mass of the produced callus. The production of the first callus was observed in petioles and stem explants, and its production was in average containing 7.5 μM ANA and 10.0 μM Picloram. In the concentrations of 10.0 μM, there was no different statistics among the treatments with the auxins ANA, 2.4-D and Picloram, being superior to the others. For the production of shoots, the explant with the largest average was the stem segments, in average without the auxins. The proliferation of roots was observed in stem segments and roots explants, mainly in average with AIB. Histochemistry analysis were determined, through the double stained with acetocarmine and Evan's blue and lugol test. However, it was observed in histological cuts that the callus produced in Pierik medium containing 10.0 μM of ANA presented well developed embryos, with protoderm and procambium, with polarization signs. For the proliferation of the embryogenic cultures, the subdivision of the selected callus was accomplished, and inoculated in Petri dishes with Pierik medium containing 10.0 μM of ANA, in five successive subcultures, with 60 days each. In the experiment II, the callus was inoculated, produced in the proliferation of the embryogenic cultures, with about 90 mg weight, in Erlenmeyers of 125 mL, containing 25 mL of average liquid , Pierik and AA2, with different concentrations of 2.4-D (0.00; 4.52; 9.05 μM) and kinetin, (0.00; 0.47; 2.32 μM), analyzed in DIC with factorial 2 x 3 x 3, maintained at growth room at 25 ± 2 ºC, in the darkness, staying under orbital agitation of 100 rpm. After 45 days of cultivation, it was evaluated a mass of the embryogenic callus; production of somatic embryos; production of secondary somatic embryos; oxidation percentage; coloration, texture of the embryogenic callus and development of the somatic embryos produced. The production of somatic embryos was better in Pierik medium with 0.47 μM of kinetin, being observed a smaller production of secondary somatic embryos, smaller oxidation percentage, with friable texture of the callus, being one of the treatments with larger development of the embryos, proven for the histological cuts, in which it was observed embryos in the globular stadium, with polarization signs, even mature embryos, with the presence of primary leaf and meristematic zone. In the Experiment III, the callus produced were inoculated in Erlenmeyers containing 25 mL of liquid and semi-solid medium, Pierik and AA2, suplemented with the kinetin concentrations (0.0; 1.16; 2.32; 4.64 μM), analyzed in DIC with factorial 2 x 2 x 4. Cultures were maintained under a 16 hours of light, photoperiod at 36 μmol m-2 s-1 provided by cool white fluorescent lamps at 25 ± 2 ºC. The liquid medium staying under orbital agitation of 100 rpm. After 45 days of cultivation, it was evaluated the number of callus with mature embryos; percentage of conversion of plants; oxidation percentage; and number of embryos with complete maturation. Pierik medium containing 2.32 μM of kinetin is recommended, in which, it was much better to the number of embryogenic callus with mature embryos, number of embryos with complete maturation and for the best conversion in plants. The plants were acclimatized ex vitro in the bench of the laboratory and transferred, in the end of two months to a greenhouse. The present study evidenced that the induction and proliferation of embryogenic cultures starting from stem segmentswere dependent on the type and concentration of the auxins. For the pre-maturation and maturation of the somatic embryos, it is necessary the retreat or the reduction of the auxin in the medium, adding ideal concentrations of cytokinins, and obtaining high conversion of the somatic embryos in plants, in the final process. / O presente trabalho teve como objetivo estabelecer a propagação in vitro de Anthurium andraeanum cv. Eidibel via embriogênese somática, avaliando a indução das culturas embriogênicas (Experimento I); pré-maturação dos embriões somáticos (Experimento II); e maturação dos embriões somáticos e posterior regeneração das plantas (Experimento III). No experimento I, adotou-se a subdivisão de plantas de antúrio estabelecidas in vitro, para a obtenção das fontes de explante. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em disposição fatorial 53, representados por cinco tipos de explantes (folhas inteiras e seccionadas ao meio; pecíolos; segmentos nodais com uma gema; e segmento de raiz sem o ápice radicular; cada explante com ~ 1,0 cm); cinco auxinas (AIA, ANA, AIB, 2,4-D e Picloram) em cinco concentrações (0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10 μM) e cinco testemunhas adicionais, ou seja, cada fonte de explante adicionada ao tratamento sem auxina. A repetição foi composta por cinco placas de Petri (90 x 15 mm), contendo 25 mL de meio Pierik, e cada unidade experimental nove explantes/placa, mantidas em sala de crescimento, a 25 ± 2 ºC, no escuro. Após 60 dias de cultivo, avaliou-se a presença de calos embriogênicos, brotos, raízes e massa freca dos calos produzidos. A produção dos primeiros calos foi observada em explantes de pecíolo e segmento nodal, e a sua produção ocorreu, principalmente, nos meios acrescidos de ANA e Picloram, nas concentrações de 7,5 e 10,0 μM, respectivamente. Em 10,0 μM, não houve diferença estatística entre os tratamentos com as auxinas ANA, 2,4-D e Picloram, sendo superiores aos demais. Para a produção de brotos, o explante com a maior média foi o segmento nodal, em meio sem a adição de auxina. Observaram-se a proliferação de raízes em explantes de segmento nodal e radicular, principalmente em meio suplementado com AIB. A partir de análise histoquímica, determinaram-se, por meio da dupla coloração com carmim acético e azul de Evans e teste de lugol, características embriogênicas dos calos. No entanto, observou-se em cortes histológicos que os calos produzidos em meio Pierik acrescido de 10,0 μM de ANA apresentaram embriões bem desenvolvidos, com presença de procâmbio e protoderme, demostrando sinais de polarização. Para a proliferação das culturas embriogênicas, foi adotada a subdivisão dos calos selecionados, e inoculados em placas de Petri com meio de cultura Pierik acrescido de 10,0 μM de ANA, em cinco subcultivos sucessivos, com 60 dias cada. No experimento II, foram inoculados os calos produzidos na fase de proliferação, com cerca de 90 mg, em Erlenmeyers de 125 mL, contendo 25 mL de meio de cultura líquido, Pierik e AA2,com diferentes concentrações de 2,4-D (0,00; 4,52; 9,05 μM) e cinetina, (0,00; 0,47; 2,32 μM), analisados em DIC com fatorial 2 x 3 x 3, mantidos em sala de crescimento a 25 ± 2 ºC, no escuro, permanecendo sob agitação orbital de 100 rpm. Avaliadas aos 45 dias de cultivo, quanto a: massa dos calos embriogênicos; produção de embriões somáticos; produção de embriogênese somática secundária; porcentagem de oxidação; coloração, textura dos calos embriogênicos e desenvolvimento dos embriões somáticos produzidos. A produção de embriões somáticos foi superior no meio Pierik acrescido de 0,47 μM de cinetina, observando-se a menor produção de embriogênese somática secundaria, menor porcentagem de oxidação, com textura friável dos calos, sendo um dos tratamentos com maior desenvolvimento dos embriões, comprovado pelos cortes histológicos, no qual observaram embriões no estádio globular, com sinais de polarização, até embriões maturados, com a presença de folha primária e zona meristemática. No Experimento III, os calos produzidos na fase de pré-maturação foram inoculados, em Erlenmeyers contendo 25 mL de meio líquido e semi-sólido, Pierik e AA2, suplementados com as concentrações de cinetina (0,0; 1,16; 2,32; 4,64 μM), formando um DIC com fatorial 2 x 2 x 4, mantidos em sala de crescimento, a 25 ± 2 ºC, sob fotoperíodo de 16 horas, irradiância luminosa de 36 μmol m-2 s-1. Os meios líquidos permaneceram sob agitação orbital de 100 rpm. Avaliou-se aos 45 dias de cultivo quanto ao número de calos com embriões maturados; porcentagem de conversão em plantas; porcentagem de oxidação; e número de embriões com maturação completa. Recomenda-se o meio Pierik suplementado com 2,32 μM de cinetina, no qual, foi superior para o número de calos embriogênicos com embriões maturados, número de embriões com maturação completa e principalmente pela melhor conversão em plantas. As plantas produzidas foram aclimatizadas ex vitro na bancada do laboratório e transferidas, no final de dois meses, para casa de vegetação. O presente estudo evidenciou que a indução e proliferação de calos embriogênicos a partir de segmentos nodais de antúrio foi dependente do tipo e da concentração das auxinas. Para as fases de pré-maturação e maturação dos embriões somáticos, é necessária a retirada ou a redução da auxina no meio de cultura, adicionando concentrações ideais de citocinina para cada fase, e assim, obtendo máxima conversão dos embriões somáticos em plantas, no final do processo.

A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis

Araucaria angustifolia é a única conífera nativa com importância econômica no Brasil. A espécie está incluída na lista oficial de espécies de plantas ameaçadas de extinção. A embriogênese somática é considerada como uma das ferramentas biotecnológicas mais promissoras na área de biotecnologia de plantas. A identificação de marcadores, que possam ser utilizados, para a seleção de genótipos aptos ao desenvolvimento do embrião somático é altamente desejável, uma vez que o desenvolvimento apropriado do embrião somático é extremamente dependente do genótipo. O presente trabalho teve como objetivo estudar e identificar marcadores bioquímicos e moleculares associados à competência para embriogênese somática em A. angustifolia. Culturas embriogênicas de genótipos com diferentes potenciais embriogênicos apresentaram diferenças nos parâmetros bioquímicos e moleculares avaliados (Poliaminas, expressão dos genes AaSERK1 e AaPP2C, proteoma). O presente trabalho propõe a utilização destes parâmetros como possíveis marcadores do potencial embriogênico no sistema A. angustifolia. / The Araucaria angustifolia is the only native conifer species with economical importance in Brazil. Recently, the species was included in the official list of endangered plant species. Somatic embryogenesis, i.e., in vitro asexual production of embryos is considered one of the most promising biotechnological tools in the area of plant biotechnology. Since the development of somatic embryos is dependent of the genotype, the identification of markers that could be used in the selection of genotypes which can develop somatic embryos is highly desirable. The main objective of the present work is to study and identify biochemical and molecular markers associated with competence for somatic embryogenesis in A. angustifolia. The evaluation of biochemical and molecular aspects (Polyamines, AaSERK1 and AaPP2C gene expression and proteome) indicated differences between embryogenic cultures of genotypes with different embryogenic potential. This work proposes the utilization of these parameters as possible markers of embryogenic potential in the system A. angustifolia.

A teca (Tectona grandis L. f) é uma espécie lenhosa originária da Ásia que possui grande interesse econômico devidos as características nobres de sua madeira. Muito usada para construção de embarcações e móveis de luxo para exposição em ambientes abertos, seu consumo tem aumentado a cada ano, principalmente nos países produtores. Com a pressão das políticas ambientais sobre o uso da madeira de espécies nativas, a teca se mostra uma ótima alternativa para o mercado de madeira serrada. Contudo, a produção comercial desta espécie encontra algumas barreiras, sendo a principal delas, a propagação de matrizes adultas cujas características se adequam ao manejo silvicultural. Para possibilitar a reprodução fiel das árvores selecionadas e, para se realizar o rejuvenescimento do material adulto procedente dessas matrizes, faz-se uso de algumas técnicas, sendo uma delas, o uso da cultura de tecidos. Uma maneira bastante considerada no processo de rejuvenescimento e obtenção de mudas de espécies agrícolas e florestais é a formulação de protocolos de embriogênese somática. A embriogênese somática pode ser descrita como o processo pelo qual células somáticas desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma sequência ordenada de estágios embriogênicos característicos, sem ocorrência de fusão de gametas. Para tanto, o desenvolvimento de um protocolo eficiente de tal técnica exige muitos estudos preliminares. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a calogênese em diferentes explantes de teca, através de uma sequência de indução utilizando difrentes fitorreguladores visando a obtenção de embriões somáticos. Para avaliar a resposta dos calos a cada etapa da indução foram realizadas análises histológica e histoquímica dos tecidos. Como respostas foram encontrados os balanços auxina/citocinina mais adequado para produção de calos, sendo eles 1,5/1,0 e, 1,5/4,0mgL-1 de picloram e BAP respectivamente. Verificou-se que o pulse com TDZ foi responsivo na obtenção de massas próembriogênicas, e que o uso da zeatina e da glutamina, não favorecem a maturação de tais estruturas, além de ocasionarem a morte celular programada das células da massa calosa. Contudo, os resultados mostram-se positivos e auxiliam na formulação de novos tratamentos e técnicas de indução da embriogênese somática para a espécie estudada. / Teak (Tectona grandis L. f) is a native woody species from Asia that has great economic interest due the noble characteristics of its wood. Widely used for building ships and luxury furniture for display outdoors, their consumption has increased every year, especially in producing countries. With the pressure of environmental policies on the use of native species of wood, teak shown a great alternative to the market for lumber. However, commercial production of this species has some barriers, the main one, being the propagation of mature breeders whose characteristics are suited to forestry management. In order to enable the faithful reproduction of the selected trees, and to perform the rejuvenation of these matrices derived of adult material, some techniques can be used, one of them is the use of tissue culture. Considered in a way quite rejuvenating and seedlings of agricultural and forest species process is the formulation of somatic embryogenesis protocols. Somatic embryogenesis can be described as the process by which somatic cells develop structures similar to zygotic embryos, through an ordered sequence of characteristic embryogenic stages without occurrence of the fusion of gametes. Thus, the development of an efficient protocol for this technique requires a lot of preliminary studies. Thus, the present work aimed to study the callus induction in different explants of teak, through a sequence induction using different growth regulators in order to obtain somatic embryos. To assess the response of each stage during callus induction, histological and histochemical tissue analysis were performed. Responses as the most suitable for callus production auxin / cytokinin balance sheets were found, they 1.5 / 1.0 and 1.5 / 4,0mgL-1 picloram/BAP, respectively. It was found that TDZ pulse was responsive to obtain pro-embryogenic masses, and that the use of zeatin and glutamine, are not conducive to maturation of such structures, and enacting the programmed cell death of the cell calli mass. However, the results show up positive and assist in the formulation of new treatments and techniques for induction of somatic embryogenesis of this species.

A família Bromeliaceae apresenta importância ecológica e econômica, desta forma, o desenvolvimento de protocolos para a micropropagação de espécies dessa família, faz-se necessário, a fim de suprir sua demanda comercial e mesmo ecológica. A escolha do meio de cultura e do explante utilizado durante a micropropagação são fundamentais para um protocolo eficaz. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças quantitativas e qualitativas no desenvolvimento de explantes de Neoregelia sp em meios de cultura e monitorar as vias morfogênicas dos propágulos obtidos em explantes foliares. Para tanto, brotos de microcepas e explantes foliares procedentes de um micro jardim clonal, foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação MS, ½ MS e WPM, todos suplementados com 0,050 mg.L-1 ANA e 0,50 mg.L-1 de BAP, onde foram mantidos por 120 dias e submetidos a diversas análises morfofisiológicas. Paralelamente, explantes foliares foram mantidos em meio de cultura MS de multiplicação para o monitoramento das vias morfogênicas durante os processos regenerativos. Para os experimentos com brotos de microcepas verificou-se que o meio de cultura MS proporcionou a melhor taxa de multiplicação, maior crescimento dos brotos, obtendo os valores mais elevados de peso de matéria fresca e seca, além disso, apresentaram maior acúmulo de nitrogênio total e proteico. No entanto, os meios de cultura ½ MS e WPM promoveram uma taxa de multiplicação semelhante a do MS, mas com brotos menores e menos vigorosos, porém, mais homogêneos, com isso, na dependência do objetivo do cultivo in vitro, não deve ser desconsiderada a possibilidade de utilização dos meios de cultura ½ MS e WPM. Os explantes foliares não se desenvolveram bem no meio de cultura WPM, não havendo diferença entre os meios MS e ½ MS, visto que ambos apresentaram resultados satisfatórios. As análises histológicas e histoquímicas identificaram células parenquimáticas, que atuam como células-tronco, manifestando capacidade morfogênica para toti ou pluripotência, dando origem respectivamente a embriões somáticos e gemas adventícias, em resposta aos estímulos in vitro. / The Bromeliaceae family has an ecological and economic importance, therefore, the protocols development for micropropagation of species of this family becomes necessary in order to meet its business and even its ecological demand. The choice of culture medium and the explant used during micropropagation are essential for an effective protocol. Thus, the aim of this study was to evaluate the quantitative and qualitative differences in the explants development of Neoregelia sp in the culture media and monitor the morphogenetic pathways of obtained propagules from leaf explants. Consequently, shoots and leaf explants coming from microcloning garden were transferred to the MS, ½ MS and WPM multiplication culture media, all supplemented with 0.050 mg.L-1 NAA and 0.50 mg.L-1 BAP, where they were held for 120 days and submitted to morphological and physiological analysis. Therefore, leaf explants were kept on MS-medium multiplication for monitoring morphogenetic pathways during the regenerative processes. Furthermore, MS medium showed the best multiplication rate for the sprouts of the microstumps, increased growth of shoots, obtaining the highest values of fresh and dry matter weight, and also showed higher accumulation of total nitrogen and protein. However, the ½ MS and WPM culture media promoted a similar multiplication rate to the MS medium, with the development of the smaller and less vigorous shoots, but with greater homogeneity. This way, depending on the purpose of in vitro culture, their use in the micropropagation for this species should not be disregarded. The leaf explants are not well developed in WPM medium, and don\'t had significant difference between the MS and ½ MS culture medium, as both showed satisfactory results. The histological and histochemical analysis identified the presence of the parenchymatic cells, which act as stem cells, expressing morphogenic ability for toti or pluripotency, leading respectively to somatic embryogenesis or adventitious organogenesis in response to in vitro stimuli.

Orientador: Marcelo Carnier Dornelas / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T19:57:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cazoto_JulianaLacorte_D.pdf: 5127995 bytes, checksum: 832b6cadc45544f0ef0e0353cad06755 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante o desenvolvimento vegetal, o meristema apical caulinar e o meristema apical radicular são determinados durante o processo de embriogênese, enquanto que outros órgãos como folhas, flores e frutos são produzidos durante o desenvolvimento pós-embrionário. Durante o desenvolvimento vegetal, a expressão de diferentes fatores de transcrição em um determinado local e tempo culminam com a ativação de domínios celulares responsáveis pelo estabelecimento e manutenção dos meristemas. Foi hipotetizado que os mesmos genes que são ativados durante o desenvolvimento embrionário zigótico são também ativados durante a embriogênese somática. Portanto, o padrão de expressão de genes preferencialmente expressos durante o desenvolvimento embrionário em espécies modelo nesses dois processos foi analisado e comparado. Para este propósito, o processo de embriogênese zigótica e somática em Passiflora edulis foram caracterizados anatomicamente. Posteriormente, genes preferencialmente expressos durante a embriogênese somática e zigótica foram identificados e caracterizados. Foram selecionados genes das famílias YABBY, WOX e Aux/IAA. Estes genes foram encontrados por meio de análises de bioinformática no banco de dados de etiquetas de sequências expressas (ESTs) de Passiflora, PASSIOMA. As sequências putativas de aminoácidos codificadas pelos genes estudados, juntamente com seus possíveis homólogos em Arabidopsis, foram alinhadas e analisadas. O padrão de expressão desses genes foi estudado por RT-PCR, qPCR e hibridização in situ durante diferentes estágios do desenvolvimento embrionário somático e zigótico em P. edulis. A caracterização morfo-anatômica do embrião zigótico nessa espécie resultou na elaboração de um cronograma que identifica, a partir do dia da polinização, os diferentes estágios de desenvolvimento do mesmo. Além disso, os dados de expressão gênica sugerem que os mecanismos moleculares responsáveis pelos processos de embriogênese zigótica e somática apresentaram padrão de expressão similar no início do desenvolvimento embrionário vegetal em P. edulis / Abstract: During plant development, the shoot apical meristem (SAM) and the root apical meristem (RAM) are established during the embryo formation process, while the other organs as leaves, flowers and fruits are produced during the post-zygotic development. During plant embryogenesis, the expression of different transcription factors in a given time and place culminates with the activation of cellular domains responsible for the establishment and maintenance of the meristems. We hypothesized that the same genes that are activated during zygotic embryo development are also activated during somatic embryogenesis. Therefore we analyzed and compared the expression patterns of genes preferably expressed during embryo development in these two processes. For this purpose, we characterized anatomically both somatic and zygotic embryogenesis in Passiflora edulis (passion fruit). Later, we identified and characterized genes preferably expressed during somatic and zygotic embryogenesis in this species. Among the identified genes are members from YABBY, WOX and Aux/IAA families. These genes were selected by bioinformatics analysis from the PASSIOMA database of Passiflora reproductive expressed sequence tags (ESTs). The putative protein sequences encoded by the studied genes, together with possible horologes in Arabidopsis, were analyzed by sequence alignment. The expression patterns of these genes were studied by RT-PCR, qPCR and in situ hybridization during different developmental stages of P. edulis somatic and zygotic embryogenesis. The morpho-anatomical characterization of zygotic embryos in this specie resulted in a schedule elaboration that identifies, from the first day of pollination, the different developmental stages of the embryo. Moreover, the gene expression data suggest that the molecular mechanisms responsible for the processes of zygotic and somatic embryogenesis presented similar expression pattern during the beginning of the plant embryo development in P. edulis / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal

Abstract Biotechnology has become a necessity, not only in research, but also in the culture and breeding of lilies. Various methods in tissue culture and molecular breeding have been applied to the production of commercially important lily species and cultivars. However, scientific research data of such species and varieties that have potential in the northern climate is scarce. In this work, different biotechnological methods were developed and used in the production and culture of a diversity of lily species belonging to different taxonomic groups. The aim was to test and develop further the existing methods in plant biotechnology for the developmental work and the production of novel hardy lily cultivars for northern climates. Most of the plant material was started from seeds, which provided genetic variability and new material for breeding. Different features in seed structure were studied with light microscopy and SEM, and different parameters affecting germination were tested. Several tissue culture protocols were also compared with different species using both solid and liquid media. Molecular biological methods were used in assessing genetic background of traditionally grown lilies. Somatic embryogenesis in callus differentiation of callus cultures was studied, and gene expression behind differentiation processes was analyzed with various molecular biological methods. Particle bombardment system was used in genetic transformation. In addition, protoplast isolation methods from various tissues were tested. The main results indicate that many tissue culture methods can be used in research and in mass production with all tested species. Especially in a large-scale production, temporary immersion system is promising. In addition to the conventional bulb scale material, seeds were found to be a suitable starting material for genetic variability required for production of new cultivars, and in the preservation of natural populations. RAPD techniques proved a suitable method for revealing phylogenetic relations of different lily species and cultivars. Methods in DNA and RNA isolation, cloning and analysis were optimized for lily material. In addition, particle bombardment system was successfully used for genetic transformation of lily callus. In the future, more information is needed to understand better the germination and differentiation processes, focusing especially in the genes, their products and function. In addition, the large and still mostly unknown lily genome is a challenge for research in the future. However, the currently presented results provide good opportunities for further developmental work and research of hardy lily species.