CETTE thèse est consacrée à la conception d'un système d'aide au diagnostic dédiéau muscle squelettique humain. Au cours du premier volet de ce manuscrit nousproposons une nouvelle représentation basée sur les modèles parcimonieux dans le cadrede la segmentation d'Images de Résonances Magnétiques (IRM) T1 du muscle squelettiquedu mollet. Notre méthode Sparse Shape Model/ Modèle de Formes Parcimonieux(MFP), apprend un modèle statistique de formes et de textures locales annoté et réussità en tirer une représentation réduite afin de reconstruire le mécanisme musculaire sur unexemple test. Dans la seconde partie du manuscrit, nous présentons une approche baséesur des ondelettes de diffusion pour la segmentation du muscle squelettique. Contrairementaux méthodes de l'état de l'art, notre approche au cours de la phase d'apprentissagepermet à optimiser les coefficients des ondelettes, ainsi que leur nombres et leur positions.Le modèle prend en charge aussi bien les hiérarchies dans l'espace de recherche,que l'encodage des dépendances géométriques complexes et photométriques de la structured'intérêt. Notre modélisation offre ainsi l'avantage de traiter des topologies arbitraires.L'évaluation expérimentale a été effectué sur un ensemble de mollets acquisespar un scanner IRM, ainsi qu'un ensemble d'images tomodensitométriques du ventriculegauche.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

[Résumé traduit automatiquement par le site web Reverso : Un problème majeur dans la biologie de cellule souche pour la recherche de base et clinique est l'accessibilité aux cellules souches de sain ou des individus de malade et le maintien(la maintenance) de leur puissance pour l'expérimentation, des écrans de médicament(drogue) thérapeutiques, ou des transplantations. Ici nous rapportons des conditions pour l'isolement de cellules myogenic squelettiques viables et fonctionnelles de l'homme jusqu'à 17 jours et la souris jusqu'à 14 jours post-mortem, significativement au-delà des rapports précédents. Les cellules souches de muscle ont été enrichies dans le mouchoir en papier(le tissu) post-mortem suggérant un avantage de survie sélectif comparé à d'autres types cellulaires. Les transplantations de 4 jour le muscle de souris post-mortem et des cellules souches haematopoietic ont régénéré des mouchoirs en papier(des tissus) solidement. La quiétude cellulaire contribue à cette viabilité de cellule souche de muscle où les cellules adoptent un état inerte réversible caractérisé par l'activité métabolique réduite, une phase de décalage prolongée avant la première division cellulaire et un statut transcriptional moins prêt pour l'engagement. Plus loin(De plus), nous montrons que la réponse de stress(d'accent) de cellules souches à l'environnement post-mortem est NF-? B-independent et que des cellules souches de muscle post-mortem sont caractérisées par les niveaux élevés de ROS, plus haut mitochondrial le contenu d'ADN et l'activité inférieure d'oxyde super dismutases, pourtant ils ne montrent(n'affichent) pas de changements(monnaies) de niveaux de redox. Finalement, l'hypoxie sévère(grave), ou l'anoxie sont critiques pour maintenir(entretenir) la viabilité de cellule souche et la capacité régénératrice robuste. Ces découvertes ont des implications majeures pour des études fondamentales et cliniques sur des cellules souches et ils peuvent aussi être prolongés(étendus) à d'autres systèmes de cellule souche de normal et des patients de malade (comme un exemple que nous avons aussi montré que des cellules souches hematopoietic survivent pendant une période prolongée(étendue) après la mort dans des mouchoirs en papier(des tissus) et restent fonctionnelles in vivo).] / A major issue in stem cell biology for basic and clinical research is the accessibility to stem cells from healthy or diseased individuals, and the maintenance of their potency for experimentation, therapeutic drug screens, or transplantations. Here we report conditions for the isolation of viable and functional skeletal myogenic cells from human up to 17 days, and mouse up to 14 days post mortem, significantly beyond previous reports. Muscle stem cells were enriched in post mortem tissue suggesting a selective survival advantage compared to other cell types. Transplantations of 4 day post mortem mouse muscle and haematopoietic stem cells regenerated tissues robustly. Cellular quiescence contributes to this muscle stem cell viability where cells adopt a reversible dormant state characterised by reduced metabolic activity, a prolonged lag phase before the first cell division, and a transcriptional status less primed for commitment. Further, we show that the stress response of stem cells to the post mortem environment is NF-κB-independent, and that post mortem muscle stem cells are characterised by elevated levels of ROS, higher mitochondrial DNA content, and lower activity of super oxide dismutases, yet they do not display changes in redox levels. Finally, severe hypoxia, or anoxia is critical for maintaining stem cell viability and robust regenerative capacity. Ces découvertes ont des implications majeures pour des études fondamentales et cliniques sur des cellules souches et ils peuvent aussi être prolongés(étendus) à d'autres systèmes de cellule souche de normal et des patients de malade (comme un exemple que nous avons aussi montré que des cellules souches hematopoietic survivent pendant une période prolongée(étendue) après la mort dans des mouchoirs en papier(des tissus) et restent fonctionnelles in vivo).

Le muscle strié squelettique est un tissu richement vascularisé. Cependant, les vaisseaux ne sont pas seulement des pourvoyeurs d'oxygène et de nutriments, mais participent activement à l'homéostasie tissulaire en interagissant avec les cellules souches musculaires. La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie associée à un dommage musculaire, des cycles de nécrose/régénération, un remodelage tissulaire et une plasticité vasculaire. Nous avons en effet, démontré par des études in vivo un défaut d'organisation du réseau vasculaire en 3D grâce au croisement entre une souris mdx et une souris Flk1-GFP (modèle murin de la DMD fluorescente pour les cellules endothéliales), ainsi qu'une atteinte histologique du réseau vasculaire (analyse quantitative et morphométrique des vaisseaux) incluant un défaut de vascularisation des fibres musculaires. L'atteinte histologique est associée à un défaut de perfusion du muscle que nous avons démontré en RMN (résonnance magnétique nucléaire), une technique sophistiquée et non invasive nous permettant d’étudier à la fois la perfusion et le métabolisme énergétique. Dans le modèle du muscle strié squelettique, qui régénère complètement après une lésion, l'angiogenèse et la myogenèse sont concomitantes. Notre hypothèse générale est que le couplage entre myogenèse et angiogenèse est altéré dans les myopathies dégénératives mais leurs mécanismes cellulaires et moléculaires restent mal connus. Nos travaux ont mis en évidence l'existence d'un couplage cellulaire et moléculaire fonctionnel entre la myogenèse et l'angiogenèse en utilisant des modèles in vitro et in vivo dans lesquels les cellules endothéliales (ECs) et les cellules précurseurs myogéniques (MPCs) sont associées. Nos résultats montrent que MPCs et ECs s'attirent réciproquement, suggérant la sécrétion de facteurs chimiotactiques spécifiques. Les ECs stimulent fortement l'entrée des cellules souches du muscle dans le programme de différenciation myogénique (prélude indispensable à la formation des structures multinucléées et contractiles). Nous avons également démontré, grâce à une technique de coculture en 3 dimensions, que les MPCs présentent un potentiel pro-angiogénique important, permettant la formation de structures vasculaires différenciées. Ces résultats ont été validés in vivo (angiogenèse en plug sous-­‐cutanés) et démontrent ainsi que la myogenèse et l'angiogenèse sont des processus couplés au cours de la régénération musculaire. Nous avons identifié trois déterminants moléculaires mis en jeu, suite à l’analyse d’un transcriptome des cellules souches musculaires et des cellules endothéliales, isolées à partir du muscle à différents temps au cours de la régénération. Ces données indiquent que l'environnement vasculaire contrôle le destin des cellules souches musculaires, qui en retour, interagissent sur leur environnement proche. Par ces interactions, les cellules vasculaires jouent donc un rôle central dans le remodelage tissulaire après un phénomène destructif. Ce travail montre pour la première fois que l'organisation et la fonction des vaisseaux sont altérées au cours des pathologies musculaires dégénératives et l'importance des interactions entre cellules souches du parenchyme et cellules endothéliales des vaisseaux dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, et ouvrent une réflexion sur la prise en compte du processus d'angiogenèse associé étroitement à la réparation tissulaire – ici la myogenèse – dans une perspective thérapeutiques. / Skeletal muscle is highly vascularized and has the outstanding capacity to regenerate ad integrum after an injury. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions vessel cells establish with muscle stem cells. Duchenne Muscular Dystrophy is characterized by the lack of dystrophin, a sarcolemma anchoring protein, and by cycles of necrosis/regeneration, tissue and vessel remodeling that lead to progressive loss of muscle force. In this severe context, our aim was to decipher alterations of the vascular network structural organization and better understand the functional repercussions on the muscle tissue. We performed a confrontation between morphological and functional approaches using a non-invasive protocol. Histology and morphometry were performed using Flk1GFP/+ crossed with mdx mice (model for the human DMD where all blood vessels express GFP). Multiparametric and functional nuclear magnetic resonance consisted in simultaneous acquisition of arterial spin labelling imaging of perfusion and 31P spectroscopy of phosphocreatine kinetic. We demonstrated for the first time that the vascular system displayed marked alterations in 12 month--‐old mdx mice, more specifically at the capillary scale. Histological results confirmed these observations showing strong perturbations of the microvascular network that are directly linked to the muscle lesions. In parallel, we analyzed the repercussions of these disruptions on skeletal muscle physiology. Our results demonstrated that after a hypoxic stress, blood perfusion was decreased in mdx mouse. During skeletal muscle regeneration, myogenic precursor cells (MPCs) interact with neighboring cells to expand and differentiate. Among them, endothelial cells (ECs) have to be considered. Their close proximity suggests that myogenesis and angiogenesis take place together during muscle regeneration. Our aim was to investigate the existence of such a coupling and to identify the underlying molecular mechanisms. We demonstrated a functional interplay between the two cell types as both cells attracted each other, suggesting the secretion of specific attractive factors. ECs strongly stimulated MPC differentiation and using 3D co-cultures, we revealed that MPCs promoted angiogenesis. These results were validated in vivo using matrigel plug assay. By analyzing transcriptomic from ECs and MPCs sorted at different time points during muscle regeneration, we evidenced and validated the role of the 3 novel molecules regulating angiogenesis/myogenesis coupling: Apelin, Oncostatin M and Periostin, that each plays specific roles during early and late phases of muscle regeneration. Thus, interactions between vessel cells and MPCs seem to play a central role in the tissue remodeling after an injury. Collectively our results point out, for the first time, strong perturbations of the vascular network with functional repercussions on muscle tissue perfusion in dystrophinopathic muscle. In light of our results evidencing the coupling between myogenesis and angiogenesis during skeletal muscle regeneration, due to the specific interactions between ECs and MPCS, it is likely that, coupling between myogenesis and angiogenesis could be affected in pathological context.

A la suite d’un criblage pangénomique, nous avons montré que l’inhibition d’un miARN de la famille let-7, miR-98, entraîne une forte accélération de la différenciation musculaire avec hypertrophie des myotubes. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment miR-98 retarde la différenciation du muscle strié squelettique. Des analyses transcriptomiques dans des myoblastes où ce miARN a été inhibé ont montré la perturbation de l’expression d’environ 240 gènes. Parmi eux, j’ai montré que le répresseur transcriptionnel E2F5 est important pour la régulation de la différenciation musculaire via miR-98, et est directement ciblé par ce miARN. L’inhibition de E2F5 permet de rétablir un niveau de différenciation normal malgré l’inhibition de miR-98. E2F5 est un régulateur important du cycle cellulaire. Sa fonction dans le muscle n’avait pas encore été explorée. Mes résultats montrent que E2F5 accélère le processus de différenciation musculaire. J’ai ensuite montré que E2F5 peut réguler directement des gènes répresseurs de la différenciation musculaire, comme ID1 et HMOX1, et indirectement des répresseurs de la voie TGF-β, expliquant son action sur la différenciation. Au final, miR-98 régule la différenciation du muscle strié squelettique en agissant directement sur l’expression de E2F5, et indirectement sur ses multiples cibles. Mes résultats ont ainsi mis en évidence une nouvelle voie de régulation de la différenciation musculaire : la voie let-7 – E2F5. / A genome-wide screen had previously shown that knocking-down miR-98, a miRNA of let-7 family, leads to a dramatic increase of terminal myogenic differentiation, with myotube hypertrophy. My PhD project aimed to understand how miR-98 delays skeletal muscle differentiation. Transcriptomic analysis of human myoblasts with knocked-down miR-98 revealed that approximately 240 genes were sensitive to miR-98 depletion. Among these potential targets, I have identified the transcriptional repressor E2F5, which turned out to be important for miR-98 regulation of muscle differentiation. Knocking down E2F5 and miR-98 simultaneously had almost fully restored normal differentiation. I have subsequently shown that E2F5, an important cell cycle regulator, is a direct target of miR-98 in muscle, where its function had never been investigated before. My results show that E2F5 is a positive regulator of the muscle differentiation process. E2F5 can directly repress inhibitors of muscle differentiation, such as ID1 and HMOX1, and indirectly regulate TGF-β pathway family members. In conclusion, miR-98 regulates skeletal muscle differentiation by directly regulating E2F5 expression, and thus controlling the expression of multiple E2F5 targets. My results have highlighted a new regulatory pathway of muscle differentiation: the let-7 – E2F5 pathway.

Le vieillissement musculaire (sarcopénie) conduit inéluctablement à une perte d'autonomie, et à une moindre capacité à lutter contre les agressions métaboliques. Or, les mécanismes mis en jeu sont complexes et restent mal connus. Ainsi, au cours de cette thèse, une étude protéomique comparative a été développée afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs potentiels de la sarcopénie chez la femme âgée post-ménopausée, et 73 protéines exprimées différentiellement dans le muscle âga ont été identifiées. En plus des altérations du muscle squelettique, l'âge est connu comme étant un facteur favorisant l'apparition du syndrome métabolique (SM), facteur de risque pour les maladies cardiovasculaires et le diabète de type II. Cependant, les effets du SM sur le muscle squelettique des personnes âgées sont peu décrits dans la littérature. Des marquages immunohistologiques ont été réalisés à partir de biopsies du muscle vastus lateralis provenant de personnes jeunes (25 ans) et âgées avec ou sans SM (75 ans), afin de décrire les altérations structurales et fonctionnelles du muscle squelettique liées à l'âge et au MS. Les résultats montrent une atrophie des fibres de type II ayant une déformation accrue lors du vieillissement. Chez les personnes âgées atteintes de SM, l'aire des fibres est augmentée par rapport aux personnes âgées contrôles, et une forte diminution de l'activité cytochrome c oxydase a été observée. De plus, le vieillissement et plus particulièrement le SM sont associés à une forte accumulation de lipides intramusculaires. Enfin, alors que peu de différences ont été observées chez les personnes âgées contrôles, le contenu en capillaire est fortement altéré chez les individus atteints de SM. Par la suite, une étude protéomique comparative a permis d'identifier 42 biomarqueurs potentiellement impliqués dans le vieillissement musculaire et/ou dans le syndrome métabolique. L'ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse devrait permettre d'améliorer notre compréhension des facteurs impliqués dans le développement de la sarcopénie, et pourrait permettre d'identifier à la fois de nouvelles voies de régulation et suggérer des cibles thérapeutiques potentielles. / Muscle aging (sarcopenia) contributes to both loss of autonomy and decreased capacity to prevent metabolic aggressions, but the mechanisms involved are complex and remain unclear. Therefore in this thesis, we have undertaken a top-down differential proteomic approach to reveal novel potential biomarkers of sarcopenia, and 73 differentially expressed proteins were identified. In addition to alterations of skeletal muscle, aging favors metabolic syndrome (MS), a risk factor for cardiovascular disease and type II diabetes. However, the effects of MS on skeletal muscle in old individuals have poorly been investigated. Immunohistochemical studies were performed with vastus lateralis muscle biopsies from young (25 years) and old (75 years) men with and without MS, to reveal the importance of age-dependent and MS-associated modifications on fiber-type characteristics. An atrophy of type-II fibers and altered fiber shape characterized muscle aging in lean healthy men. In contrast, increased cross sectional area of fibers, and reduced cytochrome c oxidase activity in all fiber types characterized MS, even in active elderly men. Moreover, aging and particularly MS were associated with accumulation of intramyocellular lipid droplets. Finally, while few differences were observed in lean healthy men, the capillary supply was strongly altered in old men with MS. Thereafter, a differential proteomic approach identified 42 potential biomarkers implicated in muscle aging and/or in metabolic syndrome. Overall the results obtained in this thesis may improve our understanding of the factors influencing sarcopenia, and may both identify new regulatory pathways and provide potential therapeutical targets.

La sarcopénie est une maladie dégénérative liée à l’âge qui se caractérise par une perte progressive et involontaire de la masse et de la force musculaire. Elle s’accompagne d’une atteinte de la régénération musculaire et d’une accumulation des espèces réactives de l’oxygène. Les cavéoles sont des invaginations de la membrane plasmique. Dans le muscle, elles jouent un rôle dans la différenciation des cellules satellites et dans le maintien de l’unité contractile dans le muscle différencié. Certaines formes de myopathies sont consécutives à l’absence de cavéoles dans le muscle. Elles sont également impliquées dans la médiation de signaux liés à la régulation du stress oxydant. Afin de mieux comprendre les mécanismes régulant la mise en place de la sarcopénie, nous avons étudié ici les relations existant entre le stress oxydant et les cavéoles. Des cellules musculaires de souris ont été traitées par l’H2O2 et une diminution du taux des cavéolines-1et -3 a été mise en évidence dans des myoblastes et les myotubes, respectivement. Il apparaît donc que les protéines constitutives des cavéoles sont effectivement sensibles au stress oxydant dans les cellules musculaires. En présence d’H2O2, la fonction des cavéoles (endocytose et résistance au stress mécanique) était également significativement altérée dans des myoblastes. L’ensemble des résultats obtenus suggère que le stress oxydant aurait un effet sur les cavéoles, ce qui pourrait entraîner des conséquences sur la régénération et le maintien de l’intégrité musculaire au cours du vieillissement. / Sarcopenia is an age-related degenerative disease which is characterized by a progressive and involuntary loss of muscle mass and strength. It is accompanied by an impairment of muscle regeneration and accumulation of reactive oxygen species. Caveolae are invaginations of the plasma membrane. In muscle, they play a role in the differentiation of satellite cells and in maintaining the contractile unit of the differentiated skeletal muscle. Some myopathies are resulting from the absence of caveolae in muscle. Caveolae are also involved in mediating signals related to the regulation of oxidative stress. To better understand the mechanisms involved in the development of sarcopenia, we investigated here the relationship between oxidative stress and caveolae. Mouse muscle cells were treated with H2O2 and decreased levels of caveolin-1 and -3 were demonstrated in myoblasts and myotubes, respectively. It therefore appears that caveolae constituent proteins are actually sensitive to oxidative stress in muscle cells. In the presence of H2O2, caveolae functions (endocytosis and resistance to mechanical stress) were also significantly degraded in myoblasts. Altogether, these data suggest that oxidative stress would affect caveolae, which could have consequences on regeneration and maintenance of muscle integrity during aging.

Sirt1 (Sirtuine 1) est une protéine histone déacétylase dépendante de NAD+ qui stimule la néoglucogénèse et inhibe la glycolyse dans le foie, et qui augmente l'oxydation des acides gras dans le muscle strié squelettique. Le but de ce travail de thèse a été de définir les fonctions métaboliques de Sirt1 dans le muscle strié squelettique. Nous avons tout d'abord montré, à l'aide d'un modèle de souris déficientes pour le gène Sirt1, que Sirt1 régulait l'expression de l'hexokinase II et de SREBP-1c, protéine régulatrice de l'expression de l'hexokinase. De plus, un modèle d'électrotransfert de gènes permettait de mettre en évidence que Sirt1 régulait l'expression de SREBP-1c de façon LXR dépendante. Enfin, l'inhibition de Sirt1 par l'EX527 aboutissait à une diminution de la consommation de glucose chez des myotubes C2C12. Prises ensemble, ces données suggèrent un rôle important de Sirt1 dans la régulation du métabolisme du glucose dans le muscle strié squelettique. Dans un second temps, nous avons déterminé le rôle potentiel de Sirt1 lors d'un jeûne chez des myotubes C2C12. Un jeûne entraînait une augmentation de l'activité cathepsine B + L et une déphosphorylation des protéines AktS473, GSK3S21/S9, p70S6KT412 et S6 S235/S236 qui précédait une amyotrophie des myotubes. La renutrition aboutissait à une rephosphorylation de ces protéines et à un retour à la normale de la taille des myotubes. L'activité cathepsine B + L restait cependant élevée. Enfin, le niveau en ARNm de Sirt1 était augmenté de façon transitoire lors de la renutrition. D'autres mesures de marqueurs des voies protéolytiques et de l'activité de Sirt1 sont à envisager. Nos données ainsi que celles de la littérature suggèrent que Sirt1 pourrait avoir un rôle dans la régulation de l'autophagie lors du jeûne. Pour conclure, ce travail de thèse met en évidence un rôle pour Sirt1 dans la régulation du métabolisme du glucose dans le muscle strié squelettique et apporte de nouvelles perspectives dans l'étude de la régulation de ce métabolisme en conditions pathologiques

Cette thèse propose des techniques pour le traitement d'images IRM de diffusion. Les méthodes proposées concernent l'estimation et la régularisation, le groupement et la segmentation ainsi que le recalage. Le cadre variationnel proposé dans cette thèse pour l'estimation d'un champ de tenseurs de diffusion à partir d'observations bruitées exploite le fait que les données de diffusion représentent des populations de fibres et que chaque tenseur peut être reconstruit à partir d'une combinaison pondérée de tenseurs dans son voisinage. La méthode de segmentation traite aussi bien les voxels que les fibres. Elle est basée sur l'utilisation de noyaux défini-positifs sur des probabilités gaussiennes de diffusion afin de modéliser la similarité entre tenseurs et les interactions spatiales. Ceci permet de définir des métriques entre fibres qui combinent les informations de localisation spatiale et de tenseurs de diffusion. Plusieurs approches de groupement peuvent être appliquées par la suite pour segmenter des champs de tenseurs et des trajectoires de fibres. Un cadre de groupement supervisé est proposé pour étendre cette technique. L'algorithme de recalage utilise les noyaux sur probabilités pour recaler une image source et une image cible. La régularité de la déformation est évaluée en utilisant la distortion induite sur les distances entre probabilités spatialement voisines. La minimisation de la fonctionnelle de recalage est faite dans un cadre discret. La validation expérimentale est faite sur des images du muscle du mollet pour des sujets sains et pour des patients atteints de myopathies. Les résultats des techniques développées dans cette thèse sont encourageants.

Lors d'un exercice physique prolongé, les muscles produisent et libèrent de l'interleukine-6 (IL-6). Cette production est corrélée à l'intensité de l'exercice et à la baisse des réserves musculaires en glycogène. L'IL-6 agirait par voie endocrine en favorisant la production endogène de glucose par le foie.<br />Notre premier objectif était d'étudier le contrôle de l'expression du gène IL-6 dans le muscle squelettique à l'exercice chez le rat et plus particulièrement l'importance de la voie de signalisation de la calcineurine, activée par la contraction musculaire. Nous avons d'abord montré que la transcription du gène IL-6 avait lieu dans les fibres musculaires oxydatives (I et IIa) et était associée à une activité importante de la voie de la calcineurine. Nous avons ensuite montré que l'administration d'inhibiteurs pharmacologiques de la calcineurine (ciclosporine A ou FK506) diminuait significativement la transcription du gène IL-6 dans les muscles lents/oxydatifs, prévenant ainsi l'apparition de la protéine dans le plasma. Nous avons ainsi démontré l'implication de la voie de la calcineurine dans le contrôle du gène codant IL-6 dans le muscle en réponse à un exercice unique. <br />Notre deuxième objectif était d'étudier l'action d'IL-6 sur le foie à l'exercice, plus particulièrement sur le contrôle du gène codant une enzyme clé de la néoglucogenèse, la phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). Nous apportons des arguments expérimentaux en faveur d'un effet direct d'IL-6 sur le tissu hépatique et d'un contrôle possible de la transcription du gène codant PEPCK par l'IL-6 circulante. D'autre part nous suggérons l'implication d'acteurs moléculaires nouveaux, Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator alpha (PGC-1α) et Farnesoid X receptor (FXR), dans le contrôle de la néoglucogenèse à l'exercice.