Orientadores : Thales Rocha de Mattos Filho, Francisco Carlos Groppo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_RogerioHeladioLopes_D.pdf: 659292 bytes, checksum: 254fb5f4f10c3501c081c5129d2db30f (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Assurer la disponibilité d'un métal afin de croitre est un processus microbien vital,particulièrement critique lorsque la source devient rare comme à l'intérieur d'un hôte. Dans ces travaux, nous décrivons et étudions deux opérons prédits pour coder les différentes fonctions permettant la synthèse, l'export et la récupération d'un nouveau métallophorebactérien analogue à nicotianamine des plantes. Des études préliminaires ainsi que d'autresétudes indiquent que ces systèmes sont fonctionnels, qu'ils permettent l'import de nickel et decobalt et que les transporteurs prédits sont importants pour la virulence de S. aureus. Encombinant des approches de biochimie, de génétique et de métabolomique nous proposons lastructure de ce métallophore chez S. aureus et P. aeruginosa et proposons aussi leurs modesde biosynthèse. Ce modèle reste encore à valider par des approches complémentaires maispermettrait de décrire pour la première fois un métallophore spécifique du nickel et du cobaltet un mode de synthèse original faisant appel à une épimérase, une enzyme apparentée auxnicotianamine synthase et enfin à une protéine appartenant à la famille DUF2338. Laconnaissance et l'utilisation de ces systèmes permettent aussi d'envisager des systèmes debioremédiation ou bien de récupération du nickel et du cobalt. / Ensuring the availability of a given metal for growth is a vital microbial process,especially critical when the source becomes scarce like inside a host. In this work, wedescribe and study two operons predicted to encode the various functions for the synthesis,export and recovery of a new bacterial metallophore similar to plant's nicotianamine.Preliminary studies as well as studies in the literature indicate that these systems arefunctional, participate in the import of nickel and cobalt and that the predicted transporters areimportant for the virulence of S. aureus. By combining approaches from biochemistry,genetics and metabolomics we propose the structure of this metallophore in S. aureus and P.aeruginosa and also offer ways of their biosynthesis. This model remains to be validated butwould describe for the first time a specific metallophore for nickel and cobalt and an originalbiosynthetic route involving an epimerase, an enzyme related to nicotianamine synthase andfinally a protein belonging to the DUF2338 family. The knowledge of these systems alsooffers the possibility to exploit them in the bioremediation or recovery of nickel and cobalt.

Staphylococcus aureus, est un pathogène humain majeur responsable d’infections nosocomiales et communautaires. Avec l’utilisation excessive des antibactériens, l’incidence et l’émergence de souches de S. aureus multi-résistantes aux antibiotiques ont augmenté rapidement depuis plusieurs années et constituent un véritable problème de santé publique. Le succès de S. aureus en tant que pathogène est lié à sa capacité à s’adapter rapidement à un nouvel environnement et à produire un arsenal de facteurs de virulence dont l’expression fait intervenir des protéines mais également des ARN régulateurs (ARNrég). Au cours de cette thèse, nous avons montré que les ARNrég sprG1 et SprF1 constitue un système toxine-antitoxine (STA) de type I fonctionnel où sprG1 code pour deux peptides toxiques. En condition normale de croissance, l’expression de la toxine est régulée par l’antitoxine SprF1 au niveau transcriptionnel et/ou post-transcriptionnel et traductionnel, permettant au pathogène S. aureus de croître normalement. En revanche, lorsque la bactérie est confrontée à une carence nutritive globale, l’expression de l’antitoxine est réprimée, laissant ainsi la toxine sprG1 s’accumuler dans la cellule et traduire les peptides toxiques PepG144 et PepG131, responsables de la stase bactérienne. Les deux peptides sécrétés sont capables de lyser les bactéries compétitrices présentes dans le milieu et les érythrocytes humains. Nous avons également montré, qu’en condition de stress hyperosmotique, SprF1 fixe directement les ribosomes, probablement par l’intermédiaire d’un ou de deux sites de fixation aux ribosomes, afin de réguler la synthèse protéique globale et de favoriser la persistance de S. aureus. Ces résultats montrent que SprF1 appartient à une nouvelle classe émergente d’ARNrég régulant la traduction par fixation directe sur le ribosome. Le STA sprG1/SprF1 est le premier exemple de STA de type I où l’antitoxine est le principal acteur de la fonction biologique. / Staphylococcus aureus is a major human pathogen responsible for nosocomial and community-acquired diseases. With the excessive use of antibiotics, incidence and emergence of multidrug-resistant strains of S. aureus have rapidly increased over the last decade and constitute a serious public health concern. The success of S. aureus as a pathogen is due to its ability to adapt quickly to new environment and to produce an arsenal of virulence factors whose expressions are regulated by proteins and regulatory RNA (regRNA). During my PhD thesis, we showed that RNAs sprG1 and SprF1 constitute a functional type I toxin-antitoxin system (TAS) where sprG1 encodes two toxic peptides. During normal growth conditions, toxin expression is regulated by the antitoxin SprF1 at transcriptional and/or post-transcriptional and translational level, allowing the pathogen to grow. Conversaly, when bacteria are confronted to global nutritive starvation, the antitoxin expression is repressed. This allows accumulation of the sprG1 toxin in cell and translation of both toxic peptides, PepG144 and PepG131, responsible for bacterial stasis. Interestingly, both secreted peptides are able to lyse competitor bacteria in the medium and human erythrocytes. We also showed that upon hyperosmotic stress, SprF1 directly binds ribosomes, probably though one or two ribosome-binding sites, to regulate overall protein synthesis and promote S. aureus persistence. These results suggest that SprF1 belongs to the new emerging class of regRNA regulating translation by direct ribosome-binding. The sprG1/SprF1 TAS is the first example of type I TAS where antitoxin is the leading player of the biological function.

Magister Scientiae (Medical Bioscience) - MSc(MBS) / Staphylococcus aureus is a Gram-positive coccus belonging to the Stapylococcaeae family. S. aureus causes a wide range of infections that range from skin infections to lifethreatening infections such as pneumonia and endocarditis and is the major cause of hospital and community-acquired infections. Despite antibiotics being available for the treatment of S.aureus infections, resistance to a number of antibiotics has developed over the years due to their improper and continuous use. S. aureus develops resistance to various drugs via different mechanisms, one of which is the extrusion of the antibiotics through efflux pumps that play a role in its acquisition of multidrug resistance. The ability of methicillin-resistant S.aureus to develop resistance to a variety of antibiotics is causing global concern as treatment options are being limited. Various antimicrobial studies carried out on purified plant-based flavonoids have shown that flavonoids enhance the antibacterial effect of antibiotics. This study analysed antibacterial effects of the antibiotics; tetracycline, ampicillin, methicillin and vancomycin and three flavonoids; chrysin, naringenin and 7-hydroxyflavone, against methicillin-sensitive ATCC 25923 (MSSA) and methicillin-resistant ATCC 33591 (MRSA) S. aureus strains, using the Kirby-Bauer disk diffusion and microtitre microdilution assays. In the Kirby- Bauer assay, the antibiotics demonstrated inhibitory effects on the growth of MSSA ATCC 25923. However MRSA ATCC 33591 was only susceptible to vancomycin, with minimal inhibition zones observed with ampicillin. The flavonoids did not enhance or reduce the antibacterial activities of the antibiotics as the zones of inhibition sizes remained unchanged in the combination studies. Microtitre assay results revealed that naringenin enhanced the antibacterial activities of the antibiotics tetracycline and ampicillin, against MSSA ATCC 25923 and MRSA 33591. This was evident as calculated synergistic ratios by the Abbot formula showed that naringenin had an additive effect. The presence of the efflux pump genes in MSSA ATCC 25923 and MRSA ATCC 33591 was compared using polymerase chain reaction (PCR). The mepA and gyrA genes were identified in both strains whereas sepA was identified in MRSA ATCC 33591. The presence of efflux pump genes in both MSSA ATCC 25923 and MRSA ATCC 33591 also confirmed that the presence or absence of the genes may contribute to antibiotic resistance. The presence of sepA in the MRSA and not the MSSA confirmed that this gene plays a role in conferring drug resistance.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are reported worldwide as a high prevalence of pathogens in the etiology of infections, both nosocomial and community. This study aimed to determine the prevalence of MRSA in the University Hospital of Santa Maria (HUSM), 2007-2011, as well as evaluating the sensitivity to vancomycin front of MRSA isolates collected from May to December 2011. We analyzed retrospectively the clinical data of all patients diagnosed with MRSA infections between January 2007 and December 2011. During this period, 1,852 samples of S. aureus foram isolated in HUSM, and 616 (33.3%) were resistant to oxacillin. There was a significant reduction in the prevalence rates of this pathogen which rose from 43.4% in 2007 to 33.9% in 2008, 30.4% in 2009, 28.1% in 2010 and 27.5% in 2011. Infections were more prevalent in male patients, aged 41 to 70 years, hospitalized in Medical clinic (16.28%), Adult Intensive Care Unit (15.13%), First Aid Post (13%), Adult Emergency Care (12.67%) and Surgery Clinic (12.5%). A greater isolation of MRSA in blood samples (16.9%), followed by tracheal aspirates (16.5%), urine (10.4%), sputum (8.7%), surgery wound secretion (8.1%) and lower limb secretion (7.8%). As for the determination of susceptibility to vancomycin, 125 samples from S. aureus were collected prospectively from May to December 2011, which 31 (24.8%) were MRSA. The minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin was determined using a conventional methodology manual broth microdilution. The MIC most frequent among all S. aureus were the 1μg/mL, presented by 53.6% of the strains, whereas among MRSA, there was a higher frequency of MIC of 2 mg/mL (48.4%). Therefore all isolates belonging to this study were sensitive to this antimicrobial of choice for infections caused by MRSA strains. Thus, given the high rates of morbidity and mortality associated with these infections, this study demonstrated the importance of recognizing the prevalence and profile of susceptibility to vancomycin of MRSA so that effective measures for the treatment and control of MRSA to take effect. / Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) são relatados mundialmente como patógenos de elevada prevalência na etiologia de infecções, tanto nosocomiais como comunitárias. Este trabalho teve por objetivo determinar a prevalência dos MRSA no Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM), de 2007 a 2011, bem como avaliar o perfil de sensibilidade frente à vancomicina de isolados de MRSA, coletados de maio a dezembro de 2011. Analisaram-se retrospectivamente, dados clínicos de todos os pacientes diagnosticados com infecções por MRSA entre janeiro de 2007 e dezembro de 2011. Durante este período, 1.852 amostras de S. aureus foram isoladas no HUSM, sendo que 616 (33,3%) foram resistentes à oxacilina. Houve uma redução significativa nas taxas de prevalência deste patógeno que passou de 43,4% em 2007 para 33,9% em 2008, 30,4% em 2009, 28,1% em 2010 e 27,5% em 2011. As infecções foram mais prevalentes em pacientes do sexo masculino, com idades entre 41 e 70 anos, internados na Clínica Médica (16,28%), Unidade de Terapia Intensiva adulto (15,13%), Ambulatório (13%), Pronto Atendimento adulto (12,67%) e Clínica Cirúrgica (12,5%). Houve maior isolamento dos MRSA em amostras de sangue (16,9%), seguido de secreção traqueal (16,5%), urina (10,4%), escarro (8,7%), secreção de ferida operatória (8,1%) e de membro inferior (7,8%). Já para a determinação da sensibilidade à vancomicina, foram coletadas prospectivamente 125 amostras de S. aureus de maio a dezembro de 2011, das quais 31 (24,8%) foram MRSA. A concentração inibitória mínima (CIM) da vancomicina foi determinada através de metodologia convencional manual de microdiluição em caldo. A CIM mais frequente dentre todos os S. aureus foi a de 1μg/mL, apresentada por 53,6% das cepas, enquanto que dentre os MRSA, houve maior frequência da CIM de 2 μg/mL (48,4%). Portanto todos os isolados pertencentes ao presente estudo foram sensíveis a este antimicrobiano de escolha para infecções causadas por cepas MRSA. Desta forma, diante das altas taxas de morbidade e mortalidade associadas a estas infecções, este estudo demonstrou a importância do reconhecimento da prevalência e do perfil de sensibilidade à vancomicina dos MRSA, para que medidas eficazes para o tratamento e controle dos MRSA sejam efetivadas.

L’ARNIII de S. aureus est considéré comme un régulateur majeur de la virulence de la bactérie. Il agit au niveau post‐transcriptionnel en interagissant avec ses ARNm cibles, permettant la répression des protéines d’adhésion et l’expression des exotoxines. Des expériences de chromatographie d’affinité ont permis d’identifier deux protéines se liant à l’ARNIII, l’endoribonucléase III (RNase III) et Tex. Alors que la RNase III dégrade les duplexes ARNIII-ARNm, la fonction de Tex n'est pas connue. Tex (Toxin Expression) est l'orthologue de la protéine eucaryote Spt6 impliquée dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Elle contient deux domaines de liaison à l'ADN (HhH et Hth) et à l'ARN (S1 et YqgF). Afin de déterminer sa fonction chez S. aureus, un variant délété du domaine S1 a été construit (Tex delta S1) et la liaison de Tex et Tex delta S1 aux ARN a été analysée par des techniques in vitro. Nous avons montré que Tex se lie aux motifs simples brins riches en A/U de plusieurs ARN régulateurs et que le domaine S1 constitue en soi, le domaine de liaison aux ARN. Des données préliminaires suggèrent que d’autres domaines seraient aussi impliqués dans ces interactions. La fonction de Tex a ensuite été étudiée par la construction de mutants d'insertion. Les souches sauvages et mutées montrent une croissance identique en milieu riche et minimum, indiquant que Tex n’est pas essentielle pour S. aureus. Les mutants produisent plus de biofilms que les sauvages, indiquant un rôle de Tex dans la virulence. Des expériences d’immunoprécipitation et protéomique ont montré un rôle de Tex dans la régulation transcriptionelle et/ou post‐transcriptionnelle des facteurs de virulence précoces, lors de la phase de transition de la colonisation à la dissémination dans l’hôte. / S. aureus RNAIII is considered as a master regulator of virulence gene expression. The RNA regulates gene expression at the post-transcriptional level allowing repression of surface proteins and activation of exotoxins. In vitro pulled-down experiments led to the identification of two proteins interacting with RNAIII, the endoribonuclease III (RNase III), known to degrade RNAIII‐mRNA duplexes and Tex. Tex (Toxin Expression) is an ortholog of the eukaryotic protein Spt6, known to be involved in transcriptional and post‐transcriptional regulation. It is composed of two DNA binding domains (HtH and HhH) and two RNA binding domains (S1 and YqgF). To decipher the RNA binding capacity of Tex, we have constructed a variant of the protein lacking the putative RNA‐binding domain S1 (TexΔS1), and analyzed the binding properties of both the wild type and the Tex‐ΔS1 protein by different in vitro techniques. Indeed Tex recognizes preferentially unpaired A/U rich sequences of several regulatory RNAs, and that the S1 domain is per se, the RNA‐binding domain. However, other domains of Tex seem to be also involved in RNA binding. To better define the function of Tex in vivo, we inserted an intron into the coding region of tex. Wild type and mutant strains grew at the same rate in rich and minimal media, meaning that Tex is not essential. On the other hand, mutated strains produced more biofilm than the wild type strains, suggesting a role of Tex in virulence. Finally, a combination of immunoprecipitation and proteomics experiments highlighted a possible role of Tex in the regulation of virulence factors expression at the transcriptional and/or posttranscriptional level during the transition from colonisation to invasion of the host.

Staphylococcus aureus est responsable de nombreuses infections nosocomiales etcommunautaires dont la diversité est liée à l’expression de nombreux facteurs de virulence.L’expression de ces facteurs est temporellement coordonnée au cours de l’infection par desfacteurs de transcription, des systèmes à 2 composants et des ARN régulateurs (ARNnc). Ungrand nombre d’ARNnc potentiels a été prédit dans le génome de S. aureus mais leur fonctionreste méconnue.L’objectif premier de ce travail a été de caractériser le rôle dans la régulation de la virulence del’un des ARNnc identifiés par notre équipe, RsaA. Des approches phénotypiques in vitro ontpermis de démontrer que RsaA active la formation du biofilm et réprime la synthèse de lacapsule bactérienne, avec une incidence sur l’opsonophagocytose de la bactérie et sur soninternalisation dans les macrophages. Au niveau moléculaire, RsaA réprime la traduction dufacteur de transcription MgrA, répresseur de la formation de la biofilm et activateur de lacapsule, par un mécanisme de type antisens entre RsaA et l’ARNm mgrA. Parallèlement, RsaAréprimerait l’opéron yabJ-spoVG, activateur de la synthèse de capsule. Ainsi, RsaA active laformation de biofilm et réprime la synthèse de capsule.Le second objectif de ce travail a été de caractériser l’expression in vivo de RsaA, E, G, H ainsique l’ARN III dans des prélèvements d’infections aiguës (abcès cutanés), chroniques (crachatsde patients mucoviscidiques) ou de portages nasales. L’étude de l’expression de ces ARN parRT-PCR, a permis de montrer que tous ces ARN sont exprimés avec une grande variabilité dansles prélèvements infectieux par rapport aux prélèvements de portages. / Staphylococcus aureus is responsible for many nosocomial and communityinfections with a diversity linked to the expression of many virulence factors. Their expression istemporally coordinated during infection by transcription factors, two- component systems but alsoregulatory RNAs called non coding RNAs (ncRNAs). A large number of potential ncRNAs waspredicted in the genome of S. aureus but their function remains unknown.The first aim of this thesis was to characterize the role of one ncRNA identified by our team,RsaA, in the regulation of bacterial virulence. Several in vitro approaches allowed todemonstrate that RsaA activates biofilm formation and inhibits the bacterial capsule synthesis,with an impact on the bacterial opsonophagocytosis and internalization into macrophages. RsaArepresses the translation of mgrA mRNA by an antisense mechanism. mgrA codes for atrancriptional regulator known to repress biofilm formation but to activate capsule synthesis. Inparallel, RsaA represses the translation of the yabJ-spoVG operon, an activator of capsuleproduction. In this way, RsaA enhances biofilm formation and represses capsule synthesis.The second objective was to characterize the in vivo expression of RNA III and RsaA, E, G, HsRNAs in samples of acute infections (cutaneous absesses), chronicle infections (cystic fibrosis)and nasal carriage. The expression study (quantitative RT-PCR) allowed to demonstrate that allsRNA are expressed into samples but they have a high expression variability depending ofinfectious samples compared to asymptomatic carriage.

Dans le cadre d'infections ostéo-articulaire (IOA), l'utilisation de matériels étrangers peut, en cas de contamination, aboutir à la formation d'un biofilm associé à un risque plus important d'échec du traitement et de récidive. Les bactéries sous forme de biofilm sont en effet protégées de l'action du système immunitaire et ont une tolérance plus importante aux antibiotiques. A l'heure actuelle, l'activité des antibiotiques est déterminée par la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice), mais cette valeur ne tient pas compte de la forme sessile des bactéries. C'est pourquoi, la société BioFilm Control a développé un nouveau test, l'Antibiofilmogramme®, permettant de déterminer la CMI biofilm (CMIb) reflétant la capacité préventive des antibiotiques sur l'installation des microorganismes en biofilm. L'objectif de ma thèse a été dans un premier temps de participer à la démonstration de la valeur clinique de ce nouveau test dans le cadre des IOA à Staphylococcus aureus. Nous avons pu mettre en place un recueil prospectif et réaliser les premiers essais in vitro. Nos résultats obtenus pour la cloxacillin ont pu par la suite être confirmés sur un modèle in vivo d'infection sur matériel. Dans un second temps, nous avons pu caractériser la capacité de formation de biofilm des souches cliniques en fonction des profils de résistance obtenus en Antibiofilmogramme®. Nous avons pu mettre en évidence des profils différents liés à la clonalité des souches. Enfin, nous avons pu mettre au point une nouvelle méthode de rinçage et de quantification des biofilms pour les modèles en microplaque via l'utilisation de vapeur. Cette approche simple améliore grandement la reproductibilité des résultats et préserve l'intégrité structurelle des biofilms / In the context of Bone and Joint Infections (BJIs), the orthopedic devices are preferential surface for microorganisms to adhere and form biofilm associated with high rates of failures and relapses. Within biofilm, bacteria are protected from the host immune response and are able to survive in the presence of high concentration of antibiotics. The standard Minimal Inhibitory Concentration (MIC) informs on the antibiotic susceptibility of planktonic bacteria, but is not suited for biofilm. The company BioFilm Control developed a new test named Antibiofilmogram® which measures early-stage biofilm growth in presence of antibiotics, and provides a biofilm Minimal Inhibitory Concentration (bMIC). The aim of my PhD research was first to take part in the demonstration of the clinical value of this new test for Staphylococcus aureus BJIs. We established a prospective collection of data and strains and realized the first in vitro assays. Our results for cloxacillin were confirmed in an in vivo model of catheter-associated infection. Second, we characterized the biofilm formation capacity of various clinical isolates based on the Antibiofilmogram® resistance profile. We showed that the biofilm formation capacity is correlated with clonal lineage. Finally, we were able to develop a new method of washing and quantifying biofilms for microplate system using steam. This simple approach preserves the biofilm integrity and lead to highly reproducible data

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène de l'homme impliquée dans de nombreuses infections nosocomiales et communautaires. Comme elle acquiert régulièrement de nouvelles résistances à diverses classes d'antibiotiques, il devient urgent de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certains ARN régulateurs (ARNrég) sont importants dans le contrôle de la virulence et de la pathogénie de la bactérie. Au cours de ma thèse, nous avons étudié la fonction d'un ARNrég, appelé SprX (alias RsaOR), exprimé par Staphylococcus aureus. Dans un premier temps, nous avons montré que, dans les souches N315 et HG001, l'expression de SprX varie au cours de la croissance et lors de différentes conditions expérimentales. Dans un second temps, nous avons identifié, par une analyse comparative du protéome, plusieurs protéines dont l'expression est dépendante de SprX et découvert le mécanisme de régulation de l'une de ces protéines par SprX. En effet, SprX interagit avec l'ARNm yabJ-spoVG au niveau des signaux d'initiation de la traduction de SpoVG par un mécanisme antisens qui conduit à la répression de sa traduction. Une boucle accessible de SprX, qui contient un motif riche en C, est impliquée dans la régulation de l'expression de SpoVG et est nécessaire à la modulation de la résistance aux antibiotiques de S. aureus. Nous avons également étudié l'effet des modifications dans la séquence des différentes copies de SprX sur la régulation de l'expression de SpoVG. Ainsi, parmi les deux copies de SprX dans la souche HG001, SprX2 possède une meilleure affinité pour l'ARNm yabJ-spoVG que la copie SprX1. L'ensemble de ces résultats suggèrent que les ARNrég peuvent altérer la résistance des bactéries aux antibiotiques et il est a prévoir que d'autres exemples seront découverts prochainement. / Staphylococcus aureus is a serious human pathogen responsible for both hospital and community-acquired infections. As it becomes alarmingly and increasingly resistant to antibiotics, studies on the mechanisms involved in its virulence is a promising path to develop new treatments. Some, small regulatory RNAs (sRNAs) are important actors in bacterial virulence and pathogenicity. During my thesis, we investigated the functions and the mechanisms of action of a sRNA, named SprX (also known as RsaOR), expressed by the Staphylococcus aureus. First, we demonstrated that, in strains N315 and HG001, SprX expression varies through the growth and among numerous environmental conditions. By a comparative proteomic study, we identified several proteins whose expressions are ‘SprX-dependent’ and elucidated the mechanism of SprX action on one of those proteins. Indeed, SprX interacts specifically with the SpoVG translational initiation site of the yabJ-spoVG mRNA by an antisense mechanism inhibiting its expression. An accessible loop within SprX structure contains a C-rich domain involved in SpoVG regulation and is required and sufficient to modulate bacterial antibiotic resistance. We also studied whether the nucleotides changes between SprX sequence copies could influence SpoVG regulation triggered by SprX. Therefore, among the two copies of SprX in strain HG001, SprX2 has a higher affinity for yabJ-spoVG mRNA than SprX1. Altogether, our results showed that a regulatory RNA can alter bacterial resistance to antibiotics, and additional examples will probably be detected in the near future for more sRNAs and antibiotics.

La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus