BANDEIRA,Silviane Praciano. Coccidioidomicose no estado de Ceará (1995-2007) : características clínico-laboratoriais e análise das frações protéicas do antígeno total de Coccidioides posadasii no imunodiagnóstico. 2008. 99 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-05T16:27:26Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_spbandeira.pdf: 16064378 bytes, checksum: 09bcd7b6cc31ba256a9179dec2fc8d76 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T14:19:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_spbandeira.pdf: 16064378 bytes, checksum: 09bcd7b6cc31ba256a9179dec2fc8d76 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T14:19:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_spbandeira.pdf: 16064378 bytes, checksum: 09bcd7b6cc31ba256a9179dec2fc8d76 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coccidiodomycosis is a disease caused by dimorphic fungi of the Coccidioides genus – C. immitis and C. posadasii – which afflicts people and various animals, such as cattle, goats, rodents and dogs. It is restricted to the Americas and cases have been reported in the state of Ceará only since 1995. The infection generally results from inhaling the infectious structures arthroconidia -of the fungus. In its parasitic phase, the microorganisms responsible for the clinical signs of the disease have a spherical shape. Most cases are asymptomatic, and respiratory problems are the most common symptoms in patients that are clinically affected. The disease’s diagnosis is based on microbiological techniques such as direct examination of clinical specimens and culturing, but these procedures require specialized biosecurity level 3 facilities because the microorganism falls in biological class 3. The immunological approach appears promising because it does not require manipulation of the fungi and can be performed in various laboratories equipped for routine mycological tests. The aim of this work is to outline the clinical and laboratory profile of the cases of coccidiodomycosis that occurred in the state of Ceará between 1995 and 2007 and to report experiments to obtain antigenic fractions from fractioning Antígeno total of C. posadasii, as a possible means for immunodiagnosis of the disease. A total of 19 cases of the disease were cataloged in the study period. All the patients were young men with respiratory symptoms, except for one case. All but one of the patients reported they engaged in recreational hunting of armadillos. The laboratory approach in these cases consisted of microbiological examination combined with molecular, immunological, histopathological techniques or animal experiments. The protein fractioning of Antígeno total of C. posadasii produced three antigenic fractions with different protein content, electrophoretic profile and immunoreactivity according to the Western blotting technique. The 60-90% fraction showed an immunoreactive band of approximately 30 to 40 KDa, recognizable by sera from patients with coccidiodomycosis, but showed crossreactivity with some sera from patient with histoplasmosis. This protein band, in subsequent studies, can be characterized and purified for potential use as a tool for immunodiagnosis of the disease. / Coccidioidomicose consiste em enfermidade causada pelos fungos dimórficos do gênero Coccidioides – C. immitis e C. posadasii – que acomete o homem e diversos animais como bovinos, ovinos, roedores e cães. Restrita ao continente americano, casos da doença vem ocorrendo no Estado do Ceará desde 1995. A infecção ocorre geralmente por contato inalatório com as estruturas infectantes do fungo presentes no ambiente, os artroconídeos. Em sua fase parasitária, os microrganismos se apresentam sob a forma de esférulas responsáveis pelas manifestações clínicas da doença. A maioria dos casos cursa de forma assintomática, sendo os quadros respiratórios os mais comuns em pacientes clinicamente enfermos. O diagnóstico da doença se baseia em técnicas microbiológicas como pesquisa direta e cultura, porém estes procedimentos demandam estrutura especializada – nível de biossegurança III -por tratar-se de microrganismo de classe biológica 3. Abordagem imunológica mostra-se promissora por prescindir da manipulação fúngica e ser exeqüível em diversos laboratórios de rotina micológica. Neste trabalho, objetivou-se traçar perfil clínicolaboratorial dos casos de coccidioidomicose ocorridos no Estado do Ceará entre os anos de 1995 e 2007, além de obter frações antigênicas a partir do fracionamento de Antígeno total de C. posadasii empregáveis como imunodiagnóstico da doença. Foram catalogados 19 casos da doença no período em estudo. Todos os pacientes eram homens jovens com manifestações respiratórias, com exceção de um caso. O hábito recreativo de caçar tatus foi relatado por 18 pacientes. A abordagem laboratorial destes casos consistiu em estudo microbiológico, associado a técnicas moleculares, imunológicas, histopatológicas ou de experimentação animal. O fracionamento protéico do Antígeno total de C. posadasii originou três frações antigênicas com teor protéico distinto, perfil eletroforético diferenciado e imunorreatividade pela técnica de Western blotting. A fração 60-90% revelou banda imunorreagente de aproximadamente 30 a 40 KDa reconhecida por soros de coccidioidomicose, porém apresentando reatividade cruzada com alguns soros de paciente com histoplasmose. Esta banda protéica, em estudos posteriores, poderá ser caracterizada e purificada com potencial utilização como ferramenta para o imunodiagnóstico da doença.

SILVA, Silvana de Fátima Ferreira da, também é conhecida em citações bibliográficas por: FERREIRA, Silvana / Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-27T21:44:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Silvana de Fátima Ferreira da Silva.pdf: 1951264 bytes, checksum: a74e449927a46092c45afce0bc99d7eb (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-05T19:01:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Silvana de Fátima Ferreira da Silva.pdf: 1951264 bytes, checksum: a74e449927a46092c45afce0bc99d7eb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-05T19:01:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Silvana de Fátima Ferreira da Silva.pdf: 1951264 bytes, checksum: a74e449927a46092c45afce0bc99d7eb (MD5) Previous issue date: 2005-06-27 / A toxoplasmose é uma zoonose de larga distribuição mundial, causada pelo Toxoplasma gondii, protozoário intracelular obrigatório. Uma vez o indivíduo infectado, o parasito se mantém latente por vários anos, pois o rápido avanço da imunidade humoral e celular restringe eficientemente a ação patogênica do parasito. Entretanto, a imaturidade do sistema imune (como em fetos e recém-nascidos) ou a sua deficiência (no caso dos indivíduos imunodeprimidos) pode causar séria morbidade ou mortalidade. A parasitose apresenta uma variedade de sinais e sintomas clínicos, e o diagnóstico laboratorial torna-se uma ferramenta de importância fundamental. O emprego de uma metodologia diagnóstica que consiga discernir entre infecção latente e ativa é o principal meio para diminuir os danos provocados pelo parasita. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma estratégia diagnóstica na tentativa de elucidar a fase da doença. Para alcançar esse objetivo foi desenvolvido um ensaio sorológico enzimático (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA) utilizando anticorpo monoclonal da classe IgA (mab-IgA - monoclonal antibodies IgA) contra a enzima Nucleosil Trifosfato Hidrolase (NTPase), produzida por taquizoítos de Toxoplasma gondii (forma ativa do parasito). Para desenvolvimento do método, o mab-IgA foi produzido por expansão celular e purificado por meio de sistema de duas fases aquosa: polietileno glicol e fosfato (SDFA: PEG-Fosfato). O anticorpo purificado foi fixado em placas de ELISA e testado frente a soros de indivíduos na fase ativa da infecção, apresentando a forma ocular da doença, diagnosticados clinicamente por meio de fundoscopia. Os resultados revelaram uma concordância entre o teste desenvolvido e o diagnóstico clínico, apresentando especificidade de 86,30% e sensibilidade de 85,18%, com eficiência de 0,89 revelando a capacidade do método em identificar infecção ativa. Diante dos resultados, o presente estudo sugere a possibilidade da utilização de anticorpo monoclonal anti-NTPase de Toxoplasma gondii como marcador de fase ativa. / Toxoplasmosis is a worldwide spread zoonotic disease caused by Toxoplasma gondii, an obligate intracellular protozoan. Once an individual is infected, the parasite remains latent for several years, since the fast advance of humoral and cellular immunity effectively restrains the parasite’s pathogenic action. However, an immature immune system (as in fetuses and newborns) or its deficiency (as is the case of immunocompromised individuals) may cause serious morbidity or mortality. The parasitosis presents a variety of clinical signs and symptoms, and laboratory diagnosis becomes a fundamental tool. The use of a diagnostic methodology capable to distinguish between latent and active infection is the main means to reduce the damages caused by the parasite. The objective of this study was to develop a diagnostic strategy in an attempt to elucidate the stage of the disease. To achieve that goal, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed using an IgA-class monoclonal antibody against the Nucleosil Triphosphate Hydrolase enzyme (NTPase), produced by Toxoplasma gondii tachyzoites (the parasite’s active form). To develop the method, an IgA monoclonal antibody was produced by cell expansion and purified by means of an aqueous two-phase system: polyethylene glycol and phosphate (ATPS: PEG/Phosphate). The purified antibody was fixed on ELISA plates and tested against sera from individuals in the active phase of the infection, presenting the ocular form of the disease, clinically diagnosed by ophtalmoscopy. The results showed conformity between the developed test and the clinical diagnosis, presenting specificity of 86.30% and sensitivity of 85.18%, with an efficiency of 0.89 revealing the method’s capability to identify active infections. In view of these results, the present study suggests the possibility of using Toxoplasma gondii’s anti-NTPase monoclonal antibody as an active phase marker.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-03T22:40:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T15:34:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T15:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Paracoccidioidomicose (PCM) apresenta múltiplas manifestações clínicas é causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. PCM é diagnosticada pela detecção microscópica de células leveduriformes multibrotantes em amostras clínicas, pela cultura cotonosa e/ou cerebriforme e testes sorológicos. Os objetivos desta pesquisa foram padronizar antígenos de P. brasiliensis de cultura selvagem e de culturas obtidas na Coleção de Culturas Micoteca URM. As estruturas leveduriformes multibrotantes evidenciadas a partir da termoconversão demonstraram que as referidas culturas depositadas na Micoteca URM são compatíveis às descritas de P. brasiliensis, contudo algumas culturas apresentaram características morfológicas atípicas e perda da habilidade dimórfica. Os critérios adotados para seleção das culturas para obtenção de antígenos foram baseados nos aspectos macroscópicos das colônias e da termoconversão das células de P. brasiliensis, os quais permitiram selecionar as culturas URM 3634, 3635 e a cultura selvagem 5378. Com NGTA os antígenos produzidos foram padronizados pela titulação, concentração de proteínas e identificação de frações protéicas. O título dos antígenos foi 1/4, 1/8 e 1/32 e a concentração de proteínas 541μg/mL, 658μg/mL e 808μg/mL respectivamente das culturas URM 3634, 3635 e 5378. Os exoantígenos apresentaram várias frações protéicas. Com soros adquiridos de bancos de soros, foram realizados testes sorológicos com as técnicas de imunodifusão (ID), contraimunoeletroforese (CIE) e imunobloting (IB). Com o teste de ID, os soros apresentaram 86,0% de sensibilidade, com CIE 98,0%. Com IB 100% de 29 soros testados reconheceram a molécula de 43 KDa, gp43, considerada o principal antígeno usado no imunodiagnóstico da PCM. Todos os testes expressaram 100% de especificidade. / Paracoccidioidomycosis (PCM) presents multiples clinical manifestations being caused by thermally dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. PCM is diagnosed by detection microscopic of yeast cells that reproduces by multiple budding in clinical samples, by culture cottony and/or cerebriform and by serological tests. The aims of research were to standard antigens of P. brasiliensis wild strain and strain obtained at the Coleção de Culturas - Micoteca URM. Like-yeast structures multiple-budding in thermoconversion ensured that the strains deposited at the Micoteca URM are P. brasiliensis; however some strains showed atypical morphological patterns and loss for dimorphic ability. The adopted criterion from selection of the fungi strains aiming at antigen production were based in observation macroscopic of the colonies and of the cells thermoconvertion from P. brasiliensis, wich it allowed to select the strains URM 3634, 3635 and the wild strain URM5378. The antigens produced with NGTA were standardized by titers, protein content and identifications of proteins fraction. The titers of antigens produced were of 1/4, 1/8 e 1/32 and the protein content was 541μg per ml, 658μg per ml and 808 μg per ml for strains URM3634, 3635 and 5378 respectively; the exoantigens apresented several antigenic fractions. The serological tests immunodiffusion (ID), counterimmunoelectrophoresis (CIE) and Immunobloting (IB) were made with serum samples obtained from a bank of sera. The ID and CIE tests presented 86.0% and 98.0% of sensitivity, respectively. The IB test realized with 29 sera showed that all it (100%) recognized the 43-KDa molecule, gp 43, considered to the main antigen used for immunodiagnostic of PCM. All of the tests expressed 100% specificity.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478795-Texto+Completo-0.pdf: 3480923 bytes, checksum: c145d85afafb9cc7cd5782a17ac34cfb (MD5) Previous issue date: 2015 / Angiostrongylus cantonensis is a nematode parasite, main etiologic agent of the eosinophilic meningitis (EM) in humans, a disease endemic in many tropical and sub tropical countries. The diagnosis of EM involves clinical evaluation, eosinophils counting >10% in liquor, and consuming historical of raw mollusks, as they are the intermediate hosts of the Angiostrongylus. Definitive diagnosis through larvae visualization in the liquor is rare. Serological test, mainly involving the 31-kDa component detection, which presents high sensitivity and specificity, has been employed as an alternative way for diagnostic. The 31-kDa antigen is composed for glycoproteins and tentatives in producing it in a recombinant way, using either prokaryotic or eukaryotic models, were inable to mantain immunological recognition, probably due the lack or deficient glycosilation of the molecules. Due the lack of information about A. cantonensis glycans and the need of producing a standard antigen able to be used worldwide in a diagnostic test, the main goal of this work was to study the A. cantonensis glycan profile and their role on the immune diagnosis of EM. It was used total soluble extract (TE) and excretory-secretory products (ES) as sources of glycans and glycoconjugates. The N-linked glycans and glycoconjugates from A. cantonensis female TE and 31-kDa antigen were analyzed and identified by mass spectrometry (MS) and lectin array, and the immunogenecity of these molecules were characterized by dot blot and Western blots. Furthermore, It was investigated the biosynthesis routes of glycans using in silico analysis of the Angiostrongylus genome and transcriptome dataset. N-glycans containing complex structures, with truncated antennas containing terminal with galactose and N-acetylgalactosamine, and core α1-6 fucosylated were identified. Lectin array analysis could also dentify Gal and GalNAc structures in Angiostrongylus glycoconjugates. Eight genes involved with biosynthesis of N-glycans, among them GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 and FUT8; and three involved with O-glycan biosynthesis, GALNT, C1GALT1 e OFUT1 were found by in silico analysis. Immunogenicity of the 31-kDa antigen is tottaly dependent of N-glycans and not to O-glycans. Modeling of proteins of the 31kDa component showed N-glycosilation sites and predicted structures that were the same identified by MS analysis. Taking together, the data generated in this study shown the glycan importance for angiostrongyliasis diagnosis and also the glycan repertoire that Angiostrongylus produces. This work is an important contribution to the development of a standard diagnosis for EM and also for new perspectives in the study of angiostrongyliasis diagnosis, parasite biology and host-parasite relationship. / Angiostrongylus cantonensis é um nematódeo parasita, principal agente etiológico da meningite eosinofílica (ME) em humanos, doença endêmica em diversos países tropicais e subtropicais. A ME se caracteriza pela eosinofilia >10% no líquor, e histórico de ingestão de moluscos crus, já que estes são hospedeiros intermediários do Angiostrongylus. O diagnóstico definitivo é raramente possível através da visualização da larva no liquor. Testes sorológicos envolvendo principalmente a detecção do componente de 31-kDa, que apresenta alta sensibilidade e especificidade, tem sido empregados como uma alternativa diagnóstica. O antígeno de 31-kDa é composto por glicoproteínas e tentativas em produzi-lo de maneira recombinante, em modelos procarióticos ou eucarióticos, não tiveram sucesso em manter o reconhecimento imunológico, provavelmente pela incorreta ou insuficiente glicosilação das moléculas. Devido à falta de informação sobre glicídios de A. cantonensis e a necessidade de produzir um antígeno padrão capaz de ser usado em um teste de diagnóstico para distribuição mundial, o objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil glicídico de A. cantonensis e o papel dessas moléculas no imunodiagnóstico da ME. Foram utilizados extratos solúveis totais (ET) de vermes adultos machos e fêmeas e produtos de excreção e secreção (ES) como fontes dos glicídios e glicoconjugados estudados. Os N-glicídios e glicoconjugados do ET de verme fêmea de A. cantonensis e o antígeno de 31-kDa foram analisados e identificados por espectrometria de massa (EM) e lectina array, e a importância imunogênica destas moléculas foi caracterizada por tratamento com glicosidases aliado a dot blot ou Western blot. Além disso, foi investigada a presença de enzimas envolvidas na síntese de diferentes glicídios a partir de análises in silico do genoma e transcriptoma do Angiostrongylus. Diversos N-glicídios foram identificados nas amostras analisadas. Estes continham estruturas complexas, com antenas truncadas contendo galactose e N-acetilgalactosamina em posições terminais e núcleo α1-6 fucosilado. As mesmas estruturas terminais foram identificadas pela análise de Lectin Array. Em relação a análise in sílico da biossíntese de glicídios em Angiostrongylus, foram identificados oito genes envolvidos na síntese de N-glicídios, entre eles GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 e FUT8; e pelo menos três genes envolvidos na síntese de O-glicídios, GALNT, C1GALT1 e OFUT1. Os N-glicídios se mostraram essenciais para a imunogenicidade do antígeno de 31-kDa quando soros positivos para A. cantonensis foram testados. Uma modelagem in silico dos componentes de 31-kDa, demonstrou sítios de glicosilação para N-glicídios, e previu as mesmas estruturas que foram identificadas por EM. Em conjunto, os dados gerados neste estudo mostraram a importância de glicídios para o diagnóstico de angiostrongilíases e também o repertório de glicídios que este parasito pode produzir. Este trabalho é uma contribuição importante para o desenvolvimento de um diagnóstico padrão para a ME e também para novas perspectivas no estudo do diagnóstico de angiostrongilíases, biologia do parasito e relação parasito-hospedeiro.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-04T17:28:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2871487 bytes, checksum: 93ead2c58375b69782a5d7277b06e620 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T17:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2871487 bytes, checksum: 93ead2c58375b69782a5d7277b06e620 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmania infantum chagasi é um protozoário intracelular responsável por causar uma doença fatal em humanos, a leishmaniose visceral. Identificar moléculas que estejam envolvidas no processo de infecção da célula do hospedeiro pelo parasito é importante para a concepção de estratégias para o controle da doença. Dentre estas moléculas estão as Proteínas Ligantes de Heparina (PLH’s), cuja característica principal é a capacidade de se ligar a carboidratos presentes em glicoproteínas ou glicolipídios. Há evidências de que PLH’s presentes na superfície de Leishmania participam dos processos de adesão e penetração dos parasitos nos tecidos e células, tanto dos hospedeiros vertebrados quanto dos invertebrados. Portanto, compreender as interações entre a PLH de L. chagasi (PLHLc) e o açúcar ao qual ela se liga, a heparina, bem como demonstrar propriedades da proteína, é importante para desenvolver mecanismos que interrompam a progressão da infecção. Este trabalho foi dividido em dois manuscritos onde foi proposto para o primeiro identificar e realizar análises estruturais in silico e análises funcionais da PLHLc. A proteína foi sequenciada e identificada como sendo a proteína LPG3 de L. infantum chagasi, que foi então sintetizada, clonada e a composição da sua estrutura foi determinada. Cromatografia de gel filtração, eletroforese em gel não desnaturante e ensaio de cross- linking sugerem que a rPLHLc/LPG3 está organizada como um tetrâmero. Calorimetria de titulação isotérmica confirma a capacidade da proteína em se ligar a heparina com afinidade micromolar. A inibição da atividade ATPásica pela presença da heparina, juntamente com as análises in silico, sugerem que o sítio de ligação a heparina sobrepõe ao sitio de ligação ao ATP. No segundo trabalho a proteína recombinante produzida foi avaliada para o imunodiagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina apresentando sensibilidade de 79-87% e especificidade de 63-83%, indicando o potencial da rPLHLc/LPG3 recombinante no diagnóstico imunológico da LVC. / Leishmania infantum chagasi is an intracellular protozoan parasite responsible for causing a fatal disease in humans, visceral leishmaniasis. Identification of molecules from the parasites involved in the host cell infection process is important for designing strategies to control this disease. Among these molecules is Heparin Binding Protein (HBP), whose main characteristic is the ability to bind to carbohydrates present in glycoproteins or glycolipids. Evidence suggests that HBP's present on Leishmania surface participate in the adhesion of parasites to tissues of both vertebrate and invertebrate hosts as well as in cell invasion. Therefore, understanding the interactions between L. chagasi HBP (HBPLc) and the sugar to which it binds, heparin, as well as demonstrating protein properties, is important to develop mechanisms that interrupt the infection progression. This work was divided into two manuscripts where it was proposed to first identify and perform in silico structural and functional PLHLc analyzes. The protein was sequenced and identified as the L. infantum chagasi LPG3 protein, which was then synthesized, cloned and the composition of its structure determined. Gel filtration chromatography, non-denaturing gel electrophoresis and cross-linking assay suggest that rPLHLc/LPG3 is organized as a tetramer. Isothermal titration calorimetry confirms the ability of the protein to bind heparin with micromolar affinity. Inhibition of ATPase activity by the presence of heparin, together with in silico analyzes, suggests that the heparin binding site overlaps the ATP binding site. In the second study, the recombinant protein was evaluated for the Canine Visceral Leishmaniasis immunodiagnosis presenting a sensitivity of 79-87% and specificity of 63-83%, indicating the potential of recombinant rPLHLc/LPG3 in the immunological LVC diagnosis.

Made available in DSpace on 2015-10-16T12:52:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 renata_barros_ini_mest_2013.pdf: 649069 bytes, checksum: ccf984958e0979b9f8cb5d6df59ab3fd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário Toxoplasma gondii que acomete várias espécies de vertebrados, inclusive o ser humano. Os gatos, assim como os outros felinos, têm papel de suma importância na epidemiologia da infecção, pois são os hospedeiros definitivos do T. gondii. Esse trabalho teve como objetivo determinar a frequência de anticorpos anti-T.gondii associados a fatores de risco e co-infecções em 213 gatos com esporotricose oriundos da região metropolitana do Rio de Janeiro e assistidos no LAPCLIN-DERMZOO, no período de novembro de 2007 a fevereiro de 2011. Esses animais foram acompanhados mensalmente devido ao tratamento para esporotricose, até os seus desfechos clínicos. Foram realizadas sorologias seriadas para toxoplasmose por meio da hemaglutinação indireta (HAI) e pela reação da imunofluorescência indireta (RIFI) e diagnóstico para o feline imunnodeficiency virus (FIV) e o feline leukemia vírus (FeLV) através de um imunoensaio rápido. Dos 213 gatos, 14 (6,6%) apresentaram anticorpos anti-T. gondii na RIFI (IgG) e na HAI. Houve um caso único de soroconversão, no quarto acompanhamento Houve variação de pelo menos dois títulos na IgG-RIFI nos acompanhamentos de dois animais. Apenas um animal (7,1%) apresentou co-infecção de toxoplasmose com o FIV e três animais (21,4%) com o FeLV. Não foi detectada associação entre as variáveis e co-infecções estudadas e a presença de anticorpos anti-T. gondii, porém 78,6% dos gatos com infecção toxoplásmica apresentaram falência terapêutica no tratamento para esporotricose, sendo quatro deles (27,3%) FIV ou FeLV positivos. A frequência da infecção toxoplásmica nos gatos estudados foi baixa, houve uma maior frequência de animais soropositivos para T. gondii entre aqueles que tinham livre acesso a rua, conviviam com outros gatos e possuíam mais de três anos de idade e foi observada 100% de concordância no teste diagnóstico para T. gondii entre a RIFI e a HAI / Toxoplasmosis is a zoonotic disease caused by the Toxoplasma gondii protozoan that affects several species of vertebrates, incl uding human s . Cats, as well as other felines, a re important in the epidemiology of the infection because they are the definite hosts of T . gondii . This study aim ed to determine the frequency of anti - T . gondii antibodies associated with risk factors and coinfections in 213 cats infected with sporotrichosis in the metropolitan Rio de Janeiro and assisted in the LAPCLIN - DERMZOO , in the period of november 2007 to february 2011. These animals were monthly evaluate d due to sporotrichosis treatment until their sporotrichosis treatment outcomes. Serologic series for toxoplasmosis were performed through indirect he magglutination assay (IHA) and indirect fluorescence antibody test (I F A T) , and feline immunodeficiency vi rus (FIV) and feline leukemi a vi rus ( FeLV) diagnose s were made by fast immunoassay. Am ong the 213 studied cats, 14 (6. 6%) showed anti - T. gondii antibodies in the I F A T and in the IHA. There was only one occurrence of seroconversion in the fourth clinical evaluation . There was a variation of at least two titles in the I F A T - IgG in the clinical follow up of two animals. Just one animal (7. 1%) showed coinfection of toxoplasmosis with FIV a nd three animals (21. 4%) with FeLV. The association between variables a nd studied coinfections with the presence of T. gondii antibodies has not been detected, nonetheless 78.6% of the infected cats showed therapeutical failure in the sporotrichosis treatment , and four of them (27. 3%) were FIV or FeLV positive. The frequency of toxoplasmosis infection in the cats was low ; cats that had free access to the street , coexisted with other cats and were older than three years showed a higher rate of T. gondii positivity and a 100% concordance in the diagnostic test for T. gondii between IFAT and IHA was also observed.