Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-14T17:52:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1240116 bytes, checksum: 2827eceaa6ac52c3f08054f9679e6b8b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T17:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1240116 bytes, checksum: 2827eceaa6ac52c3f08054f9679e6b8b (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A família de transportadores mitocondriais (MCF) catalisam transportes específicos de vários substratos, tais como nucleotídeos, aminoácidos e cofatores. Embora alguns dos transportadores tenham sido identificados, muitas destas proteínas ainda não foram completamente caracterizadas. Do mesmo modo, o metabolismo mitocondrial sob estresse ainda não é completamente conhecido. Neste contexto, este trabalho apresenta inicialmente um estudo de um transportador mitocondrial previamente identificado e ainda não caracterizado, designado como AtSFC1, um potencial transportador de succinato/fumarato. Assim, para identificar a especificidade de substrato, a proteína AtSFC1 foi integrada em liposomas e ensaios bioquímicos foram realizados e para investigar a função fisiológica deste transportador, foram utilizadas plantas transgênicas de Arabidospis thaliana para o gene AtSFC1, cuja expressão foi reduzida pela técnica antisenso. Brevemente, a integração funcional do AtSFC1 na membrana citoplasmática de células de Escherichia coli revelou uma especificidade para citrato/isocitrato do tipo antiporte. Além disso, discutimos o potencial papel para AtSFC1 no fornecimento de intermediários para o ciclo ácido dos tricarboxílicos para suportar o crescimento nos tecidos heterotróficos. Na segunda parte desta tese, investigou-se a função de doadores de elétrons alternativos para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons (mCTE) sob deficiência de carbono, bem como após o fornecimento de aminoácidos. Os produtos de degradação de aminoácidos de cadeia ramificada podem doar elétrons para o mCTE através do complexo ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase). Este sistema está localizado na mitocôndria e induzido ao nível de transcrição em situações de estresse. Assim, a fim de obter um design detalhado de como essa via interage com outras e como ela se ajusta a diferentes requisitos celulares e metabólicas, foram realizadas abordagens metabólicas e fisiológicas utilizando cultura de células de Arabidopsis mutantes com inserção de T-DNA na região codificante do gene ETFQO. Os resultados são aqui discutidos, confirmam que o sistema ETF/ETFQO é uma via essencial capaz de doar elétrons para o pool de ubiquinona. Além disso, o comportamento dos complexos respiratórios sugere novos pontos de entrada de elétrons, os quais devem ser elucidados. / Mitochondrial carrier family (MCF) proteins catalyze the specific transport of various substrates, such as nucleotides, amino acids and cofactors. Although some of the mitochondrial transporters have been identified, many of these proteins have not yet been completely characterized. Likewise, the proteic machinery and mechanisms involved in the mitochondrial alternative respiration is still not well known. In this context, this work first presents a study of a previously identified but uncharacterized mitochondrial transporter AtSFC1, a potential succinate/fumarate carrier. Hence, to obtain the biochemical role of AtSFC1, we carried out substrate specificity and investigated its physiological function using 35S antisense transgenic lines in Arabidopsis thaliana. Briefly, the functional integration of AtSFC1 in the cytoplasmic membrane of intact Escherichia coli cells reveals a high specificity for a citrate/isocitrate in a counter exchange mode. Additionally, we discussed the potential role for AtSFC1 in the provision of intermediates of tricarboxylic acid cycle to provide carbon and energy to support growth in heterotrophic tissues. In the second part of this thesis, we investigated the function of alternative electron donors to the mitochondrial electron transport chain (mETC) during carbon deprivation as well as after the supply of amino acids. The breakdown products of branched chain amino acids can provide electrons to the mETC via the ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase) complex. This system is located in the mitochondria and induced at the level of transcription during stress situations. Thus, in order to obtain a comprehensive picture of how alternative respiration pathway interacts with other pathways and adjust to different cellular and metabolic requirements, we performed metabolic and physiological approaches using Arabidopsis cell culture ETFQO T-DNA insertion mutants. The results discussed here support that the ETF/ETFQO system is an essential pathway able to donate electrons to the ubiquinone pool. In addition, the behavior of the respiratory complexes suggest new electrons entry points, which must be elucidated.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-08-18T13:12:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3202297 bytes, checksum: ff58b805bac6e6441873e70ad76878b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T13:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3202297 bytes, checksum: ff58b805bac6e6441873e70ad76878b4 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD + ) e seu derivado NADP + são compostos essenciais em todos os organismos vivos e que estão envolvidos em transações energéticas, na sinalização celular e em diversas reações na forma de coenzimas. Alterações no catabolismo ou no anabolismo do NAD + podem modificar não apenas a sua concentração, mas também o poder redutor celular, impactando aspectos importantes do crescimento e desenvolvimento. Uma vez que as etapas finais da biossíntese de NAD + ocorrem no citosol, o mesmo precisa ultrapassar membranas biológicas para exercer suas funções dentro de organelas celulares. Neste trabalho, avaliou-se em Arabidopsis thaliana o papel dos transportadores cloroplastídico e mitocondrial de NAD + , denominados AtNDT1 e AtNDT2, respectivamente. Para tal, foram utilizadas linhagens mutantes obtidas por inserção do T-DNA e foram geradas plantas transgênicas contendo uma construção antisenso para os transportadores NDT1 e NDT2, sob o controle do promotor 35S, das quais, três linhagens com reduzida expressão de cada transportador foram selecionadas. Estas plantas foram caracterizadas extensivamente a nível fisiológico e bioquímico. Verificou-se que plantas com expressão reduzida de NDT1 apresentam maior número de folhas e área foliar específica em relação às plantas não transformadas (WT). Observaram-se também maiores taxas de fotossíntese por unidade de massa e, consequentemente, maior acúmulo de sacarose e amido em comparação com o WT. Entretanto, estas plantas apresentaram menor viabilidade do grão de pólen, redução no comprimento das síliquas e sementes abortadas. Já em plantas com reduzida expressão do transportador NDT2 descobriu-se que apesar de possuírem menor número de folhas, a área foliar aumentou. A fotossíntese nestas plantas diminuiu consideravelmente em decorrência de uma menor densidade estomática e condutância estomática. Concomitantemente, plantas com reduzida expressão de NDT2 apresentaram menor acúmulo de amido. A germinação das sementes e formação de plântulas foram menores e mais lentas em comparação com o WT. Além disso, houve aumento na concentração relativa de alguns ácidos graxos durante o estabelecimento das plântulas. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que os transportadores de NAD + estão envolvidos na determinação do número de folhas e área foliar, na fotossíntese, na condutância estomática e nas concentrações de amido. Além disso, tecidos heterotróficos também são fortemente influenciados, especialmente aqueles envolvidos em processos reprodutivos. Para compreender a função deste transportador é necessário analisar não apenas a concentração celular dos nucleotídeos de pirimidina, mas também como alterações no status redox celular afetam o metabolismo vegetal. Assim, os dados obtidos neste trabalho sugerem que alterações no estado redox em cloroplastos e mitocôndrias causadas pela diminuição da expressão de NDT1 ou NDT2 afetam processos em outras organelas que não aquela em que ocorre a redução da expressão. Estes resultados abrem possibilidades para aplicações biotecnológicas, uma vez que a regulação da biossíntese e transporte de cofatores pode ser usada como uma ferramenta para estratégias de aumento da assimilação de carbono em plantas. Para tal, é necessário, no entanto compreender mais o papel destes transportadores em outros tecidos vegetais e condições adversas bem como o papel de enzimas chave que atuam no processo. / Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) are indispensable redox-active components of all living organisms. These nucleotides play essential roles in signaling and in many reactions as they act as co-enzymes. NAD catabolism or anabolism changes impact not only the concentration of these coenzymes but also the cellular poise, modifying plant growth and development. Since the final steps of NAD + biosynthesis occurs in cytosol, this nucleotide needs to be imported by organelles to play its functions inside cellular organelles. This work analyzed the function of a plastid and a mitochondrial Arabidopsis thaliana NAD + transporter, named as AtNDT1 e AtNDT2 respectively. We have isolated T-DNA insertion mutants and three antisense lines, controlled by the 35S promoter, for NDT1 and NDT2. Plants with reduced expression of NDT1 and NDT2 were individually selected and characterized at physiological and biochemical level. It was verified that NDT1 low expression lines displayed higher leaf number and specific leaf area compared to wild type plants (WT). Interestingly, higher photosynthesis per mass unit and sucrose and starch concentration was observed. On the other hand, NDT1 low expression lines show less pollen viability and reduced silique length and increased the number of aborted seeds. The low expression NDT2 lines displayed reduced number of leaves and increased leaf area. Despite these phenotypes, the net photosynthetic rate decreased considerably due to lower stomatal conductance, possible as a consequence of lower stomatal density. Concomitantly, these plants showed lower starch accumulation during the day. The germination and seedling growth rate were reduced as compared to WT. Furthermore, the oil relative concentration increased during seedling establishment. Based on these results, we conclude that NAD + transporters have important function in determining leaf number, area, stomatal conductance, photosynthetic rate and starch accumulation. Moreover, heterotrophic tissues are strongly affected by the reduction in the expression of these transporters, especially those tissues involved in reproductive process. For a better understanding of the role played by these transporters, it is necessary to analyze not only nucleotide cellular concentration but also the redox poise in different cell compartments. Thus, the results presented in this thesis suggest that lower expression of NAD transporters alters redox poise in different organelles affecting important physiological processes. These results open possibilities for biotechnology application, once the regulation of biosynthesis and transport of cofactors might be used as a tool for increasing carbon assimilation in plants. Nonetheless, it is necessary understanding the role of these transporters in other plant tissues and plant cultivated under stress conditions involved in these processes.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-08-18T17:50:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6874332 bytes, checksum: 3e055e6f18562c6805d6dba9dcef9c86 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T17:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6874332 bytes, checksum: 3e055e6f18562c6805d6dba9dcef9c86 (MD5) Previous issue date: 2015-07-17 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Mitocondrias vegetais estão envolvidas em vários processos chaves da célula, vão além da produção de energica, tais como morte celular programada, amadurecimento de frutos, ou mesmo aqueles processos dependente de luz como fotossíntese e fotorrespiração. Dessa forma, aquisição mitocondrial pela célula hospedeira trouxe avanços para as atuais células vegetais: desde a manutenção de diversas vias metabólicas que incluem o metabolismo energético bem como processos de bissíntese de lipidios, nucleotidios e vitaminas. No tocante ao metabolismo energ- etico, destaca-se a herança do ciclo do ácido tricarboxílico. Este ciclo é uma via essencial relacionada com a produção de poder redutor (NADH e FADH 2 ), assimilação de nitrogênio e otimização da fotssíntese. Acredita-se que o ciclo do ácido tricarboxílico oprerasse como passos isoladados antes do processo endossimbiótico e somente após a aquisição da mitocôndria resultou que aquele organizar-se e atuasse como uma via cíclica. O cíclo do ácido tricarboxílico é composto por oito enzimas. Contudo, cada enzima é codificada por vários genes os quais são endereçados para diversos compartimetos celulares e, não somente, mitocôndrias. Essas enziimas locallizadas em diferentes comparimentos subcelulares acarretaram em uma possível ampla conecção entre mitocôndrias e outras organelas (peroxissomos e cloroplastos) permitindo fluxos alternativos dos intermediários do ciclo cujo resultado alterou seu funcionamento para um não convencional modo não cíclico. É bastante aceito que sob estresses, no quais reduzem os níveis de carboidratos. O ciclo do ácido tricarboxílico pode funcionar no modo não cíclico, devido a perda de esquelos carbônico que entram se fazendo necessário ser alimentado por reações anapleuróticas. Portanto, aminoácidos tornam-se fundamentais para suprir a respiração e síntese de ATP sob tais situações. Fortes evidencias demonstraram que aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e lisina podem fornecer elétrons para o sistema a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial pela ação do sistema flavoproteína de transferência de elétrons (ETF)- ETF: ubiquinona oxidorredutase (ETF/ETFQO). Em plantas, duas enzimas: Isovaleril-CoA desidorgenase (IVDH) e (D)-2-hidroxidoglutarato desidrogenase (D2HGDH) foram caracterizadas como doadores de elétrons para o pool de ubiquinone através do sistema ETF/ETFQO a partir da degradação de BCAA e lisina, respectivamente. Na verdade, o catabolismo de BCAA mostra-se de uma importância fundamental para nutrir o ciclo do ácido tricarboxílico, principalmente, em situações de estresse enquanto lisina mostra uma estreia associação com o ciclo do ácido tricarboxílico sendo importante para fazer um elo da degradação de aminoácido com a geração de energia. A transferência de elétrons através da fdoacadeia transportadora de elétrons mitocondrial acopla a síntese de ATP a partir da regeneração de NADH e FADH 2 para fosforilar ADP a ATP. Contudo, o conhecimento com relação a organização do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e sua via alternativa sob limitação energética permanece escasso. Assim, essa tese, a qual se concentra no funcionamento da respiração em um contexto que o ciclo do ácido tricarboxílico e via alternativa como doador de elétrons para cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, é composta por três independentes capítulos centrados no metabolismo energético e respiração alternativa em Arabidopsis thaliana. Por isso, para se obter uma visão global de como ocorre o envolvimento e interação do ciclo do ácido tricarboxílico juntamente da via alternativa para coordenar o ajustamento das necessidades metabólicas e celulares, três abordagens experimentais foram usadas (i) uma abordagem in silico, nós investigamos a história evolucionária dos genes do ciclo do ácido tricarboxílico gerando um modelo para a origem dos genes do ciclo em plantas bem como seu comportamento submetido a uma série de estresse; (ii) a importância da biossíntese de lisina foi investigado usando mutante de Arabidopsis com reduzida atividade da enzima L,L-diaminopimelato aminotransferase (dapat) da via biossintética de lisina; (iii) reprogramação metabólica do sistema OXPHOS associado a limitação de carbono foi investigado. Rapidamente, os resultados apresentados aqui forneceram resultados que permitiu, no mínimo um prévio, a elaboração de mecanismo do metabolismo energético junto a vias alternativas. Primeiramente, permitiu a elucidação da origem evolutiva dos constituintes do ciclo do ácido tricarboxílico em plantas fornecendo elemento para a origem das isoformas presentes nos diferentes compartimentos subcelulares os quais que devem ser associados com eventos de transferência gênica ou com novas cópias geradas por duplicação genômica. Ademais, análises de co-expressão dos genes do ciclo em diferentes condições estressantes em ambos tecidos parte aérea e raiz demonstrou a presença de plasticidade molecular e forneceu uma explicação para o funcionamento do ciclo do ácido tricarboxílico em plantas. Após isso, o uso de Arabidopsis mutante com reduzida atividade para biossíntesi de lisina L,L-diaminopimelato aminotransferase (dapat) foi demonstrada que biossíntese de lisina simula condições de estresse e impacta no crescimento e metabolismo foliar. Por fim, uma avaliação de como o comportamento do sistema OXPHOS sob limitação de carbono e como vários aminoácidos podem impactar os complexos respiratórios foi possível demonstrar que o sistema OXPHOS tem sua função afetada por diferentes fontes de carbono e que vias alternativas são induzidas sob essas condições. Ademais, imunoensaios revelaram que é mais provável ser regulado por modificações pós traducionais. Juntos, esses resultados realçam a complexidade e especificidade da respiração vegetal durante evolução e que é differentemente afetado por linitações energéticas e pelo uso de substratos alternativos. Os resultados discutidos aqui suportam que ETF/ETFQo é uma via essencial capaz de doa elétrons para a cadeia transportadora de elétrons e que amioácidos são substratos alternativos para manter a respiração sob limitação de carbono. Os resultados obtidos são discutidos em um contexto de evolução metabólica mostrando estreia associação da metabolismo energético com metabolismo de aminoácidos e onde possível mcanísticos são devidamente discutidos. Palavras chaves: ciclo do ácido tricarboxílico; escassez de energia; evolução mitochondrial; fosforilação oxidativa; genes parálogos, metabolismo mitocondrial; neofuncionalização; respiração; resposta a estresse; substratos alternativos / Plant mitochondrion are involved in several key cellular processes that goesbeyond energy production being also associated with programmed cell death, fruit ripening and even light- associate process including phorespiration and photosynthesis. In this context, mitochondria acquisition by host cell brought evolutionary advances for the existing plant cell by the preservation of diverse metabolic pathways including both those related to energy metabolism as well as those associated with lipids, nucleotides and vitamin biosynthesis. The most notorious heritage is related to the tricarboxylic acid (TCA) cycle. The TCA cycle is an essential pathway which is related to reducing power (NADH and FADH2) generation, nitrogen assimilation and photosynthesis optimization. It has been suggested that the TCA cycle operated as isolated steps prior endosymbiosis events and that only after mitochondria acquisition it was possible for it to be organized and function as a cycle. The TCA cycle is composed by a set of eight enzymes. However, each enzyme is encoded by several genes which are targeting not just to mitochondria, but that are also imported into others subcellular compartments. These TCA enzymes located in other subcellular compartiments result in likely a broader connection between mitochondria and other organelles (e.g. peroxissome and chloroplast) allowing a bypass of the intermediates of the cycle switching his operation to an unusual in non-cyclic modes flux. It is also currently accepted that under stress conditions, which leads to decreases in carbohydrate levels, the TCA cycle can function in non-cyclic flux mode due to diminishing of carbon skeleton the enter it making required that be fed by anauplerotic reactions. Therefore, amino acids become essential to support respiration and ATP synthesis under such situations. Compelling evidence have demonstrated that branched chain amino acids (BCAA) and lysine can supply electrons to the mitochondrial electron transport chain (mETC) by the action of the electron transfer flavoprotein (ETF)-ETF: ubiquinone oxidoreductase (ETF/ETFQO) system and associated dehydrogenases. In plants, only isovaleryl- CoA dehydrogenase (IVDH) and (D)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D2HGDH) have been characterized as electron donnor to the ubiquinol pool via this system so far by the degradation of BCAA and lysine, respectively. In fact, BCAA catabolism is of pivotal importance to provide intermediates to TCA cycle, particularly under stress situations, whereas lysine shows a strict association with the TCA cycle being required to couple amino acid degradation and energy generation. The electron transfer through the mETC is tightly coupled to ATP synthesis and use electron donates by NADH and FADH 2 to phosphorylate ADP to ATP. However, our knowledged regarding the organization of the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system and its alternatives pathways under energy limitation remains elusive. Thus, this thesis, which is focused on the function of respiration within the context of the role of the TCA cycle as well as the function of alternative electron donors to the mETC, iscomprised by three independent stand-alone chapters focusing on energy metabolism and alternative respiration in Arabidopsis thaliana. Hence to obtain a compreenhesive picture of how the TCA cycle evolved and to which extend its alternative pathways interact to adjust to different cellular and metabolic requirements, three experimental approaches were used: (i) by using bioinformatic approaches we investigated the evolutionary history of TCA cycle genes allowing the generation of a model for the origin of the TCA cycle genes in plants and connected its evolution with TCA cycle behavior under a range of stress; (ii) the importance of lysine deficiency were investigated by using an Arabidopsis mutant with reduced activity of the lysine biosynthesis enzyme L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapat), and (iii) the metabolic reprograming associated with the OXPHOS system were investigated following carbon limitation.. In brief, the results presented here provided several novel findings and allowed, at least preliminarly, mechanistic interpretation thereof. First, it facilitate the elucidation of the evolutionary origem of the TCA cycle in land plants providing support to the contention that the origin of isoforms present in different subcellular compartments might be associated either with gene-transfer events which did not result in correct targeting or with new gene copys generated by genome duplication and horizontal transfer gene. Additionally, coexpression analyses of TCA cycle genes following different stress conditions in both shoot and root tissues demonstrated the presence of a large molecular plasticity and provided an explanation for the modular operation of the TCA cycle in land plants. Secondly, by using an Arabidopsis mutant with reduced activity of the Lys biosynthesis enzyme L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapat) it was demonstrated that lysine biosynthesis deficiency mimics stress situation and impacts both plant growth and leaf metabolism.Thirdly, by evaluating OXPHOS system behavior following carbon starvation and how a range of amino acids can impact respiratory complexes it was possible to further demonstrate that OXPHOS is affected in function of the carbon source and that alternative pathways are induced under this condition.In addition, immunoblotting assays revealed that OXPHOS system is most likely regulated by posttranslational modification. When considered together these results highlight the complexity and specificity of plant respiration during evolution and that it is differently affected following energy limitation by the usage of alternative substrates. The results discussed here support the contention that ETF/ETFQO is an essential pathway able to donate electrons to the mETC and that amino acids are alternative substrates maintaining respiration under carbon starvation.The results obtained are discussed in the context of current models of metabolic evolution showing the strict association of energy metabolism with amino acids metabolism, and where possible, mechanistic insights are properly discussed. Key-words: alternative substrate respiration; energy deprivation; mitochondria evolution; mitochondria metabolism; neofunctionalization; OXPHOS; paralogous genes; stress response; TCA cycle;

Patógenos necrotróficos matam as células por meio de suas agressivas moléculas toxicas e enzimas líticas não específicas. Jasmonato (JA) é um importante hormônio produzido, para entre outras funções, regular positivamente genes envolvidos na defesa a necrotróficos. Um passo importante nesta rota é a produção do ácido linolênico, um ácido graxo de (18:3) que é dessaturado de (18:2) pelas enzimas FAD3, FAD7 e FAD8. Uma ferramenta muito utilizada hoje é o silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) que se utiliza de um mecanismo natural de defesa das plantas a vírus, para a descoberta da função gênica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre A. thaliana e isolados do gênero Pythium sp., com os genes FAD3, FAD7 e FAD8 silenciados. Para alcançar tal objetivo um fragmento de 325 pb do gene FAD7 de A. thaliana foi isolado e clonado no vetor viral TRV2b. As plantas foram agro-infiltradas com o vetor TRV1 e TRV2b-GFP (controle) ou TRV2b-FAD7 (silenciada), após foi realizada a inoculação dos isolados de Pythium sp. e atribuídas notas de severidade, referente ao fenótipo e medido o comprimento das raízes. A agro-infiltração do vetor viral TRV2b-FAD7 ocasionou uma redução significativa na quantidade de mRNA dos genes FAD3 e FAD7, não interferindo na quantidade de mRNA do FAD8. Esta redução na expressão interferiu negativamente na resistência de A. thaliana a P. deliense, causando sintomas mais severos na parte aérea, sintomas que estão correlacionados significativamente com o comprimento de raiz. O silenciamento destes genes ocasionou a redução na expressão da defensina PDF1.2, induzida na infecção por patógenos necrotróficos. A resistência a P. deliense foi restituída pela adição de metil-jasmonato, pois a aplicação exógena deste, ocasionou a indução de PDF1.2, evidenciando a importância da produção de JA na indução desta defensina e na resistência a P. deliense. / Necrotrophic pathogens kill plant cells through its aggressive and nonspecific lytic enzymes and toxic molecules. Jasmonate (JA) is an important hormone that positively regulates genes involved in necrotrophic defense, among other functions. An important step in this pathway is the production of linolenic acid, a fatty acid (18:3) that is desaturated to (18:2) by FAD3, FAD7, and FAD8 enzymes. Virus induced gene silencing (VIGS) is a widely used tool today, which takes advantage of a natural defense mechanism of plants against viruses, for the discovery of gene function. The aim of this study was to evaluate the interaction between A. thaliana and isolates of the genus Pythium sp., after gene silencing of FAD3, FAD7, and FAD8. For this purpose, a 325 bp fragment of FAD7 from A. thaliana was isolated and cloned into a viral vector TRV2b. Plants were agro-infiltrated with the vector and TRV1 TRV2b-GFP (control) or TRV2b-FAD7 (silenced). Then, plants were inoculated with Pythium sp. isolates and disease severity was evaluated, based on phenotype and measures of root length. Agroinfiltration of TRV2b-FAD7 caused a significant reduction in the amount of mRNA from FAD3 and FAD7 but did not interfere in the amount of mRNA from FAD8. This down regulation had a negative influence on the resistance of A. thaliana to P. deliense, causing more severe symptoms in the shoot, symptoms that are significantly correlated with root length. Gene silencing led to a reduction in the expression of PDF1.2 defensin, which is induced in infections caused by necrotrophic pathogens. Resistance to P. deliense was restored by adding exogenous methyl jasmonate, which induced PDF1.2 expression. These results indicate the importance of JA in the induction of this defensin leading to resistance against P. deliense in A. thaliana.

Orientadora: Profa. Dra. Hana Paula Masuda / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / Polarização celular e divisão assimétrica são eventos cruciais durante o desenvolvimento vegetal uma vez que estão associados com estabelecimento de novos padrões de desenvolvimento. No entanto, pouco é sabido acerca do processo de polarização celular em plantas. Em animais, uma das vias que atua nesse processo envolve a proteína MO25, cuja homóloga em plantas ainda não foi caracterizada. Neste trabalho, estudamos genes homólogos de Mo25 de plantas, em especial de um dos homólogos de Mo25 de Arabidopsis thaliana aqui chamado de AtMo25. Para melhor compreender a evolução deste gene e sua função em plantas, nós (1) elaboramos a filogenia da proteína MO25 de plantas e realizamos estudos da estrutura gênica de AtMo25 para entender sua origem evolutiva;(2) modelamos a estrutura por threading para elucidar seu folding e fizemos análise de pressão de seleção nos resíduos da proteína AtMO25; (3) analisamos a expressão gênica de AtMo25 por PCR em tempo real em plantas do tipo selvagem e tecidualemente observando expressão do gene marcador GUS sob o controle do promotor de AtMo25 em A. thaliana (ProMo25::GUS) e (4) analisamos os fenótipos de linhagens SALK com inserção de T-DNA e níveis reduzidos da expressão de AtMo25. Nossos dados mostram que AtMo25 foi duplicado pelo menos uma vez na base de Embriófitas e que em A. thaliana outras duas duplicações ocorreram. Uma das cópias de A. thaliana, a AtMo25 (código de acesso At2g03410), possivelmente foi duplicado por um evento de retrotransposição e apresenta uma taxa de evolução acelerada. Além disso, dados de PCR em tempo real mostram que AtMo25 é expresso em órgãos relacionados com o processo reprodutivo, como botão floral, flor aberta e flor fertilizada e dados de plantas proMo25::GUS apresentaram expressão de GUS em grãos de pólen, raízes e em locais que sofreram injúrias mecânicas. Para melhor compreensão dos possíveis processos de atuação do nosso gene, foi feita a modelagem da proteína codificada pelo mesmo, a qual mostrou que o folding é do tipo Armadillo, semelhante aos homólogos já descrito em outros eucariotos, sugerindo que o homólogo de A. thaliana possa atuar em processos celulares semelhantes, possivelmente como uma proteína scaffold, característico de proteínas com domínio ARM. Finalmente, análise de mutantes da linhagem SALK, onde há redução da expressão de AtMo25, apresentaram área da roseta, tamanho das folhas e das células e grãos de pólen menores quando comparados com indivíduos do tipo selvagem sugerindo que AtMo25 possa estar envolvido com expansão celular ou ainda com a formação e/ou manutenção de células polarizadas e assimétricas. / Cell polarization and asymmetric division are crucial events during plant development since they are associated with the establishment of new patterns. However, little is known about the process of cell polarization in plants. In animals, one of the pathways that controls this process involves a protein complex that contains MO25 protein. In plants, homologs of Mo25 still need to be characterized. In this work, we studied plant homologs of MO25, particularly one homologs of Arabidopsis thaliana that was named AtMo25. To better understand the evolution of this gene and its function in plants, we: (1) studied MO25 protein phylogeny in plants and AtMo25 gene structure to understand its evolutionary origin; (2) modelled the AtMO25 protein structure by threading and analyzed residues under selective pressure to elucidate its folding; (3) analyzed the gene expression of AtMo25 using RealTime PCR in wild type plants and observing the expression of the gene marker GUS under the control of AtMo25 promoter in A. thaliana transformed plants (ProMo25:GUS); and (4) analyzed the phenotypes of SALK lines with insertion of T-DNA and reduced expression of AtMo25. Our data shows that AtMo25 was duplicated at least once at the base of Embryophyta and twice again in A. thaliana. One of the A. thaliana copies, the AtMo25 (access code At2g03410), was possibly duplicated by retrotransposition and showed an accelerated evolution rate. RealTime PCR data show that AtMo25 is expressed in reproductive organs, like floral buds, open and fertilized flower, and proMo25::GUS plants data showed GUS expression in pollen, roots and mechanical injured regions. To better understand in which cellular processes AtMO25 protein is involved, we modeled AtMO25 and found that this protein folding is basically composed of alpha-helices organized in Armadillo repeats, similar to the orthologs of other eukarya. This suggests that AtMo25 from A. thaliana may act in similar cellular processes, probably as a scaffold protein, characteristic of ARM-containing proteins. Finally, phenotypic analyses of SALK mutants with reduced AtMo25 expression showed small pollen grains and small rosettes, leaves and pavement cells of the leaf epidermis when compared to the wild type. This suggests that AtMo25 may be involved in cell expansion or in the formation and/or the maintenance of the polarized and asymmetric cells.

During meiosis eukaryotes produce four haploid gametes from a single diploid parental cell. In meiotic S-phase homologous chromosomes, which were inherited from maternal and paternal parents, are replicated. Homologous chromosomes then pair and undergo reciprocal crossover, which generates new mosaics of maternal and paternal sequences. Meiosis also involves two rounds of chromosome segregation, meaning that only one copy of each chromosome is finally packaged into the resulting haploid gametes. In this work I sought to genetically engineer two elements of meiosis, in order to generate tools which may be useful for plant breeding. The first project sought to generate a second division restitution (SDR) population, where the second meiotic division is skipped. This is created by crossing an SDR mutant, omission of second division1, which produces diploid pollen due to a defective meiosis-II, to a haploid inducer line, whose chromosomes are lost from the zygote post-fertilisation. This was intended to give rise to diploid plants possessing chromosomes from just the SDR parent. Importantly, the SDR parent used was heterozygous, meaning that SDR progeny should show mostly homozygous chromosomes, but with regions of residual heterozygosity, determined by crossover locations. This project succeeded in creating a small number of plants with the predicted SDR genotype, although a range of aberrant genotypes were also observed. I present several hypotheses that could account for the observed progeny genotypes. In a second project I attempted to direct meiotic recombination using DNA double strand breaks targeted to specific sites. This project used a spo11-1 mutant, which is unable to produce the endogenous meiotic DNA DSBs that normally mature into crossovers. Instead, TALFokI nucleases (TALENs) were expressed from meiotic promoters in order to generate exogenous DSBs at sites determined by the DNA binding specificity of the TAL repeat domains. The project succeeded in transforming TALENs into spo11-1 mutants and confirming their expression. However, this was not sufficient to recover the spo11-1 mutant infertility or direct crossovers. Potential reasons for this non-complementation are discussed, as well as their implications for control of meiotic recombination in plant genomes.

Orientadores: Ione Salgado, Cecilia Alzira Pinto-Maglio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seligman_Kelly_M.pdf: 3879828 bytes, checksum: 479952026f21e4da513fff98938d5538 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O radical óxido nítrico (NO), que pode ser produzido nos organismos pela oxidação de arginina ou redução de nitrito, é uma importante molécula sinalizadora em plantas atuando como modulador de diversos processos metabólicos e de desenvolvimento. Recentemente foi identificado como um dos sinais envolvidos no processo de floração. A transição da fase de crescimento vegetativo para a fase reprodutiva é atrasada em plantas mutantes que superproduzem NO, enquanto que a floração é precoce em plantas mutantes deficientes na síntese deste radical. O principal objetivo deste trabalho foi identificar os sítios de produção de NO durante o desenvolvimento floral de Arabidopsis thaliana L. Foram utilizados os indicadores fluorescentes 4,5-diacetato de diaminofluoresceína (DAF-2 DA) e 1,2-diaminoantraquinona (1,2-DAA) para localizar in situ, por microscopia de fluorescência, a produção de NO em botões florais de A. thaliana em diferentes estágios de desenvolvimento. Ainda, a produção de NO pelas estruturas florais foi comparada entre plantas do tipo selvagem e mutante duplo defectivo para os genes estruturais da enzima nitrato redutase - NR - (nia1 nia2) que apresentam conteúdo reduzido de aminoácidos e nitrito e, consequentemente, de NO em suas folhas. Foi analisado também o efeito do seqüestrador de NO, CPTIO, na prevenção da emissão de fluorescência. Os resultados mostraram que o NO é sintetizado em células e tecidos específicos da estrutura floral e que sua produção aumenta com o desenvolvimento floral até a antese: a fluorescência dos indicadores, prevenida pelo seqüestrador de NO, ficou restrita às papilas estigmáticas em gineceus imaturos e a grãos de pólen produzidos pela antera no estame. Plantas mutantes de A. thaliana nia1 nia2 apresentaram o mesmo padrão de emissão de NO nos órgãos florais que o tipo selvagem. Sépalas e pétalas não apresentaram produção significativa de NO em ambos os genótipos analisados. A validação dos resultados obtidos por microscopia foi feita através da incubação de tecidos florais intactos com DAF-2, quantificando-se, por espectrofluorimetria, o composto DAF-2T resultante da reação do indicador com o NO emitido pelos tecidos. Os dados obtidos por espectrofluorimetria mostraram que a intensidade de fluorescência emitida por botões florais foi maior durante o estágio 11 de desenvolvimento, corroborando os dados obtidos de localização por microscopia de fluorescência. Ainda, foi possível quantificar que as plantas do tipo selvagem apresentam, em média, maior intensidade de fluorescência emitida, que plantas nia1 nia2: 1,39 e 1,89 vezes maior nas fases 11 e 13 de desenvolvimento, respectivamente. Um segundo objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da enzima NR na indução floral. Os dados obtidos revelam que plantas nia1 nia2 possuem floração precoce, 6 dias em média, quando comparadas com plantas do tipo selvagem. Para verificar se a floração precoce no mutante nia1 nia2 era conseqüência apenas da deficiência do radical NO, ou também da deficiência de aminoácidos, foram analisados os parâmetros de indução floral em plantas nia1 nia2 tratadas com os aminoácidos arginina ou glutamina, para a recuperação dos níveis basais de aminoácidos. A floração neste mutante permaneceu precoce, sugerindo que o fenótipo de floração precoce é conseqüência da deficiência de NO nestas plantas durante a fase vegetativa. Estes resultados sugerem que o NO pode ter um importante papel no processo de floração e no sucesso da reprodução vegetal / Abstract: The radical nitric oxide (NO), that can be produced in the organism by arginine oxidation or nitrite reduction, is an important signaling molecule in plants acting as modulator of several metabolic and developmental processes. Recently NO was identified as one of several signals involved in flowering. The transition from vegetative to reproductive growth is delayed in mutant plants that overproduce NO, while this process is precocious in mutant plants deficient in NO synthesis. The main objective of this study was to identify the sites of NO production during floral development of Arabidopsis thaliana. The fluorescent probes, 4,5-daminofluorescein diacetate and 1,2-diaminoanthraquinone, were utilized to localize in situ, by fluorescence microsopy, the NO production in floral buds of A. thaliana at different stages of development. Still, NO production by the floral structures was compared between wild-type and double defective mutant plants for structural genes of nitrate reductase enzyme - NR - (nia1 nia2) which have reduced content of amino acids and nitrite and, consequently, of NO in their leaves. It was also analyzed the effect of the NO scavenger, CPTIO, in preventing the fluorescence emission. The results showed that NO is synthesized in specific cells and tissues in the floral structure and its production increases with the floral development until anthesis: the fluorescence of the indicators, prevented by NO scavenger, was restricted to the stigmatic papillae, in the gynoecium, and to pollen grains produced by anther in stamen. Mutant plants of A. thaliana nia1 nia2 showed the same pattern of NO emission by the floral organs to that observed in the wild type genotype. Sepals and petals showed no significant NO production in both genotypes analyzed. Validation of the results obtained by fluorescence microscopy was realized by incubating floral tissues with DAF-2 and quantifying, by spectrofluorimetry, the DAF-2T resulted from reaction between the probe and the NO emitted by the tissues. Data obtained by spectrofluorimetry showed that the fluorescence intensity emitted by floral buds was higher during stage 11 of development, corroborating localization data obtained by fluorescence microscopy. Additionally, wild type plants showed greater intensity of fluorescence emission, on average, than nia1 nia2 plants: 1,39 and 1,89 times higher in phases 11 and 13 of development, respectively. A second objective of this work was to evaluate the role of the NR enzyme in floral induction. Data obtained revealed that nia1 nia2 plants flowers earlier, 6 days on average, than the wild-type plants. To verify whether the early flowering phenotype in nia1 nia2 was only consequence of the NO deficiency, or was also due to the amino acids deficiency, it were analyzed the parameters of floral induction in nia1 nia2 plants treated with the amino acids arginine or glutamine for the recovery of the amino acids levels. Flowering in this mutant remained precocious, suggesting that the early flowering phenotype is a consequence of NO deficiency in these plants during the vegetative growth. These results suggest that NO may have an important role in the flowering process and to the reproductive success of the plant / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Patógenos necrotróficos matam as células por meio de suas agressivas moléculas toxicas e enzimas líticas não específicas. Jasmonato (JA) é um importante hormônio produzido, para entre outras funções, regular positivamente genes envolvidos na defesa a necrotróficos. Um passo importante nesta rota é a produção do ácido linolênico, um ácido graxo de (18:3) que é dessaturado de (18:2) pelas enzimas FAD3, FAD7 e FAD8. Uma ferramenta muito utilizada hoje é o silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) que se utiliza de um mecanismo natural de defesa das plantas a vírus, para a descoberta da função gênica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre A. thaliana e isolados do gênero Pythium sp., com os genes FAD3, FAD7 e FAD8 silenciados. Para alcançar tal objetivo um fragmento de 325 pb do gene FAD7 de A. thaliana foi isolado e clonado no vetor viral TRV2b. As plantas foram agro-infiltradas com o vetor TRV1 e TRV2b-GFP (controle) ou TRV2b-FAD7 (silenciada), após foi realizada a inoculação dos isolados de Pythium sp. e atribuídas notas de severidade, referente ao fenótipo e medido o comprimento das raízes. A agro-infiltração do vetor viral TRV2b-FAD7 ocasionou uma redução significativa na quantidade de mRNA dos genes FAD3 e FAD7, não interferindo na quantidade de mRNA do FAD8. Esta redução na expressão interferiu negativamente na resistência de A. thaliana a P. deliense, causando sintomas mais severos na parte aérea, sintomas que estão correlacionados significativamente com o comprimento de raiz. O silenciamento destes genes ocasionou a redução na expressão da defensina PDF1.2, induzida na infecção por patógenos necrotróficos. A resistência a P. deliense foi restituída pela adição de metil-jasmonato, pois a aplicação exógena deste, ocasionou a indução de PDF1.2, evidenciando a importância da produção de JA na indução desta defensina e na resistência a P. deliense. / Necrotrophic pathogens kill plant cells through its aggressive and nonspecific lytic enzymes and toxic molecules. Jasmonate (JA) is an important hormone that positively regulates genes involved in necrotrophic defense, among other functions. An important step in this pathway is the production of linolenic acid, a fatty acid (18:3) that is desaturated to (18:2) by FAD3, FAD7, and FAD8 enzymes. Virus induced gene silencing (VIGS) is a widely used tool today, which takes advantage of a natural defense mechanism of plants against viruses, for the discovery of gene function. The aim of this study was to evaluate the interaction between A. thaliana and isolates of the genus Pythium sp., after gene silencing of FAD3, FAD7, and FAD8. For this purpose, a 325 bp fragment of FAD7 from A. thaliana was isolated and cloned into a viral vector TRV2b. Plants were agro-infiltrated with the vector and TRV1 TRV2b-GFP (control) or TRV2b-FAD7 (silenced). Then, plants were inoculated with Pythium sp. isolates and disease severity was evaluated, based on phenotype and measures of root length. Agroinfiltration of TRV2b-FAD7 caused a significant reduction in the amount of mRNA from FAD3 and FAD7 but did not interfere in the amount of mRNA from FAD8. This down regulation had a negative influence on the resistance of A. thaliana to P. deliense, causing more severe symptoms in the shoot, symptoms that are significantly correlated with root length. Gene silencing led to a reduction in the expression of PDF1.2 defensin, which is induced in infections caused by necrotrophic pathogens. Resistance to P. deliense was restored by adding exogenous methyl jasmonate, which induced PDF1.2 expression. These results indicate the importance of JA in the induction of this defensin leading to resistance against P. deliense in A. thaliana.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-15T14:42:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2839884 bytes, checksum: ce7d91680d52bd13d3d8301ea862a08d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T14:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2839884 bytes, checksum: ce7d91680d52bd13d3d8301ea862a08d (MD5) Previous issue date: 2016-11-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glifosato (N-(fosfonometil) glicina) é um herbicidas mais utilizados no mundo. Poucos estudos elucidam quais são os efeitos que ele pode provocar em espécies não agricultáveis e na espécie modelo Arabidopsis thaliana Deste modo, o presente trabalho tem como objetivos: avaliar os efeitos que o glifosato provoca nas espécies arbóreas Handroanthus chrysotrichus (Mart. ex DC.) Mattos (Bignoniaceae) e Garcinia gardneriana (Planch. & Triana) Zappi (Clusiaceae) tendo em vista as alterações bioquímicas, fisiológicas e anatômicas em resposta ao estresse provocado por ele e quais ajustes metabólicos que ocorrem no sistema antioxidante de A. thaliana quando exposta ao mesmo herbicida. Para tal, indivíduos de H. chrysotrichus e G. gardneriana com oito meses de idade foram submetidos a aplicação na parte aérea, do herbicida RoundUp® ultra, contendo 65% (m/m) de glifosato [N- (fosfonometil) glicina] como ingrediente ativo concentrações de 0, 360, 720, 1080 e 1440 g. ia ha -1 . 72 HAA (horas após a aplicação), foram avaliados os parâmetros bioquímicos e aos 7 DAA (dias após a aplicação) foram obtidos fragmentos foliares para análises anatômicas em microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. O glifosato provocou alterações no metabolismo do carbono, fotossíntese e fluorescência em H. chrysotrichus. Foram observadas alterações no sistema antioxidativo enzimático e houve incremento da peroxidação lipídica em ambas espécies. Ocorreram altrações anatômicas a nível ultraestrutural, estrutural e visual, esta última apenas em H. chrysotrichus. H. chrysotrichus mostrou-se ser a espécie mais sensível ao herbicida por apresentar danos mais pronunciados, tendo, portanto, potencial biosindicador/biosensor de áreas impactadas pelo herbicida glifosato. Plantas de A. thaliana foram germinadas em placa de petri contendo meio de cultivo e 20 M de glifosato, após 14 dias, houve coleta das plantas e realização das análises bioquímicas. Houve detecção histoquímica de O 2.- e de peroxidação lipídica nas plantas tratadas e aumento de oxidação de proteínas, indicando que a produção de ROS colocou a planta sob estresse. Ocorreu aumento da atividade das principais enzimas do sistema antioxidativo e do ciclo ascorbato-glutationa nas plantas tratadas, acompanhado da diminuição do teor de H 2 O 2 . Glicose-6 fosfato desidrogenase (G6PDH) e 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH) foram as desidrogenases com maior atividade nas plantas tratadas. Além disso, 6PGDH se mostrou a enzima mais estável quando tratamos A. thaliana com diferentes poderes redutores e oxidantes, sugerindo que esta enzima pode ser crucial para o fornecimento de poder redutor nesta espécie quando tratada com o herbicida glifosato. A. thaliana apesar de apresentar sintomas de estresse como redução de crescimento e murcha da parte aérea quando tratada com Glyphose é capaz de reajustar seu sistema antioxidante de forma a minimizar os danos causados por este estresse, o que garante a sua sobrevivência neste tempo de exposição e doses utilizadas. / Glifosato (N- (phosphonomethyl) glycine) is the most used herbicide in the world. Few studies have display what effects it can cause in not cultivable species and in the model species Arabidopsis thaliana. Thus, this study aims to Thus, this study aims to evaluate the effects that glifosato causes the species Handroanthus chrysotrichus (Mart. ex DC.) Mattos (Bignoniaceae) e Garcinia gardneriana (Planch. & Triana) Zappi (Clusiaceae) in view of the changes biochemical, physiological and anatomical response to stress caused by it and what metabolic adjustments that occur in the antioxidant system of A. thaliana when exposed to same herbicide. Individuals of H. chrysotricus and G. gardneriana eight months age were subjected to application in the shoot, the herbicide RoundUp® ultra containing 65% (m / m) of glifosato [N- (phosphonomethyl) glycine] as an active ingredient concentrations of 0 , 360, 720, 1080 and 1440 g. ai ha -1 . 72 HAA (hours after application) were evaluated biochemical parameters and 7 DAA (days after application) were obtained leaf fragments to anatomical analyzes in light microscopy and scanning electron microscopy. Glifosato caused changes in carbon metabolism, photosynthesis and fluorescence in H. chrysotrichus. Changes were observed in antioxidant enzyme system and there was an increase in lipid peroxidation in both species. There were anatomical alterations in the ultrastructural, structural and visual levels, the latter one only in H. chrysotrichus. H. chrysotrichus proved to be the most sensitive species to the herbicide to present more pronounced damage and therefore potential biosindicador / biosensor areas impacted by the glifosato herbicide. A. thaliana plants were germinated in petri dishes containing culture medium 20 M glifosato and after 14 days, was collected from plants and conducting biochemical analyzes. There histochemical detection O2.- and lipid peroxidation in the treated plants and increased oxidation of proteins, indicating that ROS production plant placed under stress. There was increased activity of key enzymes of the antioxidant system ascorbate and glutathione cycle in treated plants, together with the reduction of H 2 O 2 content. Glucose-6 phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) were desidrogenases with greater activity in the treated plants. Furthermore, 6PGDH proved the most stable enzyme when dealing with different A. thaliana reducing and oxidizing power, suggesting that this enzyme may be critical to provide reducing power in this species when treated with glifosato. A. thaliana despite symptoms of stress as shoot growth and wilting reduction when treated with Glyphose is able to adjust its antioxidant system in order to minimize the damage caused by this stress, which ensures its survival in this time exposure and doses used.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.