L'obésité est maintenant perçue comme un problème de santé majeur dans notre société. C'est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires liés au développement de cette maladie est primordiale. Des études comparatives entre des poulets de lignées grasses et des poulets de lignées maigres ont montré que la lipogénèse hépatique était plus élevée chez les animaux gras. La Synthétase des Acides Gras (FAS) est connue comme étant responsable de la synthèse des lipides saturés à longues chaînes. Des études antérieures ont démontré que ce gène est régulé à la fois par l'état nutritionnel et hormonal. Dans ce contexte, l'objectif de la présente étude était d'examiner le rôle de l'hormone thyroïdienne (T3), et aussi d'un mélange de T3 et d'insuline, sur l'activité transcriptionnelle du gène aviaire de la FAS. Certains des éléments agissant au niveau de la réponse à l'insuline ont déjà été identifiés chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Afin d'identifier l'effet de la T3 et d'un mélange de T3 et d'insuline, un fragment d'ADN de 1,6 Kpb de la partie promotrice de FAS a été isolé, séquencé et cloné dans un vecteur contenant le gène rapporteur codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT). Cette construction nommée 1.6FAS-pJFCAT1 a ensuite été transfectée de façon transitoire dans les cellules HepG2 et les hépatocytes embryonnaires de poulet. Les analyses d'expression ont démontré une augmentation de l'activité du gène rapporteur codant pour CAT de 2.5 fois, suite à une stimulation de 48 heures avec 1.6µM de T3. Ce promoteur posséderait donc un élément de réponse nécessaire à la modulation par cette hormone. Des constructions contenant des délétions successives de ce grand fragment d'ADN et des alignements de séquences ont permis l'identification de la région interne localisée entre -902/ -577 pb où se retrouve l'élément de réponse à la T3, appelé TRE pour 'Thyroïd Hormone Response Element'. Des analyses de retard sur gel (EMSA) utilisant comme TRE un oligonucléotide contenant les bases -732 à -692 ont ensuite permis d'identifier des protéines se fixant sur ce fragment d'ADN en réponse à la T3, renforçant ainsi la présence possible d'un TRE. Une augmentation de l'activité CAT de 2.3 fois a d'ailleurs aussi été obtenue après 48 heures de stimulation à la T3 lors d'expériences de transfections transitoires avec la construction contenant le fragment -765/-663 placé devant le promoteur TK. Le TRE correspondrait donc à la séquence CGCCCTgtggTAACCT, séquence très différente du consensus établi et très différente des T3RE retrouvés dans la partie promotrice du gène de l'enzyme malique. Il a toutefois une forte homologie avec un TRE retrouvé dans le gène FAS chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Ceci semble démontrer la forte variation de ces éléments de réponse. L'analyse par retard sur gel révèle qu'en présence de T3 seulement il y a fixation du récepteur TR alors que lorsque l'insuline est aussi présente, il semble que le facteur de transcription RXR se fixe aussi. Ceci suggérerait l'idée que la formation d'hétérodimères TR/RXR serait grandement favorisée en présence d'insuline. Ces informations, en combinaison avec les résultats récents obtenus par d'autres équipes sur la régulation de la FAS, serviront à la compréhension des mécanismes de régulation de la transcription d'un gène clé de la lipogenèse hépatique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hormone thyroïdienne, TRE, Synthétase des acides gras, FAS, Lipogenèse.

Les Innus du Labrador sont des consommateurs de nourriture traditionnelle. Cette dernière est nutritive et intègre divers aspects social, culturel, traditionnel, spirituel et économique fondamentaux pour leur bien-être. Malgré ses bénéfices, elle peut aussi contenir des polluants environnementaux potentiellement dangereux pour leur santé. Les hormones thyroïdiennes (THs) sont impliquées dans diverses fonctions dont la lactation, principalement contrôlée par la prolactine (PRL). Certains polluants sont connus pour affecter ces hormones. La constitution exacte du mélange de polluants dans la nourriture traditionnelle, ainsi que leurs effets sur les hormones des Innus sont méconnus et préoccupants. Cette étude caractérise les profils alimentaire et d'exposition aux polluants sanguins [mercure (Hg), cadmium (Cd), manganèse (Mn), plomb (Pb), sélénium (Se), biphényles polychlorés (BPCs) et pesticides organochlorés (POCs)], évalue les relations entre la diète et la multicontamination, ainsi que les effets de ces polluants sur la thyrotropine (TSH), les THs et la PRL. En 2002 et 2003, une étude transversale utilisant l'approche écosystémique à la santé a été réalisée (n=162). Des questionnaires de fréquence alimentaire, sociodémographique et médicale ont été administrés et des échantillons de sang ont été récoltés. Les échantillons sanguins ont été analysés au TOXEN par des essais radioimmunologiques (hormones), au Centre Hospitalier de l'Université Laval par des méthodes enzymatiques (lipides), au Centre de Toxicologie du Québec par une spectrométrie de masse à plasma d'argon induit (Cd, Pb et Se), par une spectométrie d'absorption atomique (Mn), par une technique manuelle à vapeur froide (Hg total) et, au Centre for Indigenous People's Nutrition and Environment de l'Université McGill par des disques en phase solide et une chromatographie gazeuse couplée à une spectrométrie de masse (BPCs et POCs). Des analyses de correspondance ont été utilisées pour établir les profils alimentaire et d'exposition et des analyses canoniques de correspondance partielle, pour évaluer les relations entre la diète et la multicontamination. Des régressions linéaires multiples ont été effectuées séparément pour les participants âgés de moins et de plus de 40 ans afin d'évaluer les relations entre les concentrations sanguines des hormones et des contaminants. Les profils alimentaire et d'exposition varient selon l'âge, le genre, la scolarité et le tabagisme. Les jeunes sont davantage exposés aux métaux et les plus âgés, aux BPCs et aux POCs. Le Hg, le Mn, le Cd, l'Aroclor 1260, les chlordanes et le DDT expliquent 11% de la variance résiduelle dans la composition de la diète des participants (n= 140). Le Hg est significativement corrélé à l'axe 1 et le Mn, à l'axe 2. Malgré que ces polluants expliquent significativement une partie de la variance dans la diète, il semblerait que leur présence dans le sang ne soit pas fortement reliée à la diète innue. Pour les participants de moins de 40 ans, des relations significatives inverses avec la PRL (Cd, hexachlorobenzène et BPC 170) et la T4 (BPC 156), ainsi que des relations significatives positives avec la PRL (alpha-hexachlorohexane) ont été trouvées. Pour les participants de 40 ans et plus, des relations significatives inverses avec la T3 (Cd) et la T4 (hexachlorobenzène et BPC 101), de même que des relations significatives positives avec la PRL (heptachlor) et laT 4 (BPC 187) ont été observées. Ainsi, les Innus sont exposés par diverses sources alimentaires à de faibles niveaux de métaux, de BPCs et de POCs qui affectent principalement les niveaux sanguins des THs et de la PRL (n=142). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Innus, nourriture traditionnelle, thyrotropine, hormones thyroïdiennes, prolactine, métaux, biphyényles polychlorés et pesticides organochlorés.

Le mercure (Hg) et les biphenylpolychlorés (BPC) sont des polluants ubiquitaires qui menacent la santé des écosystèmes et des humains par leur rémanence, leur mobilité, leur toxicité et leur capacité de se bioaccumuler dans la chaine trophique. Par conséquent, on peut retrouver des niveaux élevés de ces contaminants dans les poissons, particulièrement les piscivores. Au cours des dernières années, les bénéfices et les risques potentiels pour la santé suite à une consommation régulière de poissons sont au centre des polémiques. Les poissons sont à la fois source de bénéfices nutritifs et de bienfaits sur la santé, ainsi que la principale source d'exposition au mercure et aux BPC. De nombreux effets sur la santé en lien avec ses polluants ont été rapportés par des études épidémiologiques chez les grands consommateurs de poisson. La présente étude faisait partie du projet COMERN (Collaborative Mercury Research Network), un réseau pancanadien de recherche sur le mercure. Composé de plusieurs groupes de recherche (sur la santé, l'environnement, l'éducation et la biogéochimie du Hg), ce réseau avait pour objectif d'étudier les sources de mercure, sa transmission dans les écosystèmes et ses impacts sur la santé humaine. La présente étude a été menée par le groupe de recherche en santé du projet COMERN. Cette équipe a établi le bilan de la consommation de poisson et de l'apport en Hg chez deux populations riveraines provenant de deux écosytèmes différents. Elle a étudié les effets potentiels sur la santé associés à la consommation de poissons et a proposé des mesures permettant de réduire l'apport et l'exposition au Hg afin de maximiser les bienfaits tout en minimisant les risques relié à la consommation de poisson. Cette étude transversale d'observation a été menée auprès de deux communautés riveraines provenant de deux écosystèmes différents du Québec : 130 participants du lac Saint-Pierre et 130 participants de 3 lacs de la région de l'Abitibi (Lacs Malartic, Preissac et Duparquet). Un questionnaire auto-administré a servi à collecter des données socio-démographiques. Un questionnaire de fréquences de consommation de poisson d'eau douce, de poisson du marché et de sauvagine a été administré par entrevue. Des prélèvements de sang, et de cheveux ont été collectés pour le dosage du Hg, des métaux (plomb, cadmium et sélénium) et des organochlorés (16 congénères de BPC et 17 pesticides organochlorés). De plus, des mesures anthropométriques (taille et poids) et de pression artérielle ont été effectuées pour chaque participant. Afin d'étudier les effets neurotoxiques de l'exposition chronique aux faibles doses en Hg et en BPC et pesticides organochlorés, des tests neuropsychomoteurs (cognitifs, moteurs et sensoriels) ont été administrés aux participants. Finalement afin d'étudier l'effet des polluants sur l'homéostasie les hormones thyroïdienne, la triodothyronine (T3), la thyroxine (T4) et la thyroid stimulating hormone (TSH) ont été mesurées dans le sérum. Dans un premier temps, nous avons estimé l'apport quotidien en Hg exprimé en µg Hg/kg poids corporel/jour. Pour ce faire, nous avons utilisé les données des niveaux de Hg dans les poissons pêchés dans les lacs étudiés fournis par l'équipe environnement du COMERN et par le ministère de l'environnement. Pour le poisson du marché et la sauvagine, nous avons utilisé les données publiées au Canada et aux États-Unis. Ces données associées aux quantités de poisson consommées nous ont permis d'estimer l'apport quotidien en mercure pour les deux groupes. Nous avons ensuite examiné la relation entre la consommation du poisson, l'estimation de l'apport en Hg et les biomarqueurs d'exposition au Hg. Les résultats ont montré que les participants du lac Saint-Pierre (LSP), comparativement à ceux de l'Abitibi, consommaient significativement plus de poisson mais présentaient des concentrations de Hg significativement moins élevées aussi bien dans les cheveux que dans le sang. L'apport en Hg chez les participants du LSP était également inférieur à celui des participants de l'Abitibi. Pour les deux groupes, c'est principalement la consommation de poisson d'eau douce qui était positivement associée aux bioindicateurs du Hg. Les estimations des apports journaliers en Hg (provenant de la consommation de poisson d'eau douce et de la consommation totale de poisson) étaient significativement reliées aux biomarqueurs du Hg. Nous avons également observé une relation positive entre la consommation de poisson d'eau douce, l'estimation de l'apport en Hg et le mercure inorganique sanguin. Nos résultats ont démontré que la quantité de poisson exprimée en nombre de repas ou en quantité de poisson, lesquels sont largement utilisés par de nombreuses études, seraient de moins bons bioindicateurs d'exposition au Hg par rapport à l'estimation de l'apport en Hg. Dans la seconde partie de notre travail, nous avons examiné la relation entre les hormones thyroïdiennes sériques: (T3, T4 et TSH), et les POP sériques, les bioindicateurs du Hg et le plomb sanguin (Pb) chez 211 consommateurs de poissons d'eau douce (124 hommes et 87 femmes). Les niveaux des hormones thyroïdiennes étaient dans l'étendu des valeurs normales. L'analyse des relations stratifiées par genre a montré que les effets observés sur les hormones thyroïdiennes étaient différents selon le sexe : chez les femmes, les concentrations sériques de T3 étaient négativement reliées aux concentrations sériques de différents congénères des BPC ainsi que le p,p’-DDE alors qu'aucune relation n'a été observée avec la T4. La TSH était négativement reliée au Pb sanguin. Chez les hommes, par contre, nous avons observé une diminution de la T4 et une augmentation de la TSH en relation avec les BPC et le Hg. En revanche, aucun effet n'a été observé sur la T3. Ces constations suggèrent que malgré les faibles concentrations, ces contaminants environnementaux peuvent interférer avec la fonction thyroïdienne et les effets pourraient être différents selon le genre. Ces résultats confirment les recommandations du Groupe de Travail sur les Méthodologies en Évaluation des Risques des Produits Chimiques « Scientific Group on Methodologies for the Safety Evaluation Chemicals (SGOMSEC) » qui mettent de l'avant l'importance des effets observés séparément chez les femmes et les hommes en prenant en considération les covariables spécifiques pour chaque genre. Finalement, afin d'étudier les effets neurotoxiques de l'exposition chronique aux faibles doses en Hg et en POP, nous avons examiné les relations entre les scores des tests cognitifs, moteurs et sensoriels avec les niveaux sériques des POP, et les biomarqueurs du Hg dans le sang et les cheveux. Nous avons également examiné les effets synergiques potentiels entre le Hg et les BPC en prenant en considération toutes les variables pouvant influencer les scores. En premier lieu, nous avons réalisé des analyses statistiques continues sur l'ensemble des participants des deux écosystèmes réunis (N=260). Dans un deuxième temps, afin de vérifier l'hypothèse selon laquelle les effets neurologiques étaient différents selon le genre, nous avons effectué des analyses stratifiées par sexe. Pour les deux analyses, nous n'avons observé aucun effet concluant. Dans un troisième temps, nous avons réalisé des analyses stratifiées selon l'âge (inférieur et supérieur à 50 ans) en nous basant sur l'hypothèse selon laquelle les personnes âgées seraient plus sensibles aux polluants neurotoxiques du fait de leur charge corporelle en polluants et, également, en raison de la baisse de l'activité de la dopamine et de nombreux neurotransmetteurs observée au cours du vieillissement. Cette analyse a montré que pour l'ensemble des tests, les scores augmentaient significativement avec l'âge. Pour le groupe des moins de 50 ans, il n'existe aucune relation entre les scores des tests neuropsychomoteurs et les biomarqueurs de Hg, les BPC et le p-p’ DDE. En revanche, pour le groupe d'adultes de plus de 50 ans, la performance à de multiples tests cognitifs était significativement et inversement associée à l'exposition aux BPC alors qu'aucune relation n'a été observée avec les performances motrices. Ces résultats confirmaient notre hypothèse selon laquelle, chez les personnes âgées, les performances neurofonctionnelles, plus particulièrement la fonction cognitive, étaient plus sensibles et plus vulnérables à l'exposition aux polluants neurotoxiques et cela même à de faibles niveaux d'exposition. Par ailleurs, les niveaux de Hg mesurés étaient de loin inférieurs à ceux d'autres groupes de grands consommateurs de poisson pour lesquels des effets neurotoxiques du Hg ont été observés. Contrairement à ces études, nos résultats ont montré une amélioration significative de différentes performances motrices en relation avec le Hg dans les cheveux et le sang. Ces observations pourraient suggérer un phénomène de compensation précédant, en général, l'installation tardive de troubles de la fonction motrice, associée à l'exposition chronique à de très faibles doses en Hg. Par ailleurs, nous n'avons pas observé d'effet synergique entre les BPC et le Hg sur les scores des tests neuropsychomoteurs. Nos travaux ont mis en évidence la perturbation de l'homéostasie de la fonction thyroïdienne ainsi que des effets neurotoxiques à de faibles doses en BPC et en mercure. Depuis plusieurs années, une baisse considérable des niveaux de BPC et de Hg a été observée dans l'environnement et dans les différents medias biologiques. Malgré ces niveaux bas, des effets néfastes ont néanmoins été observés particulièrement chez les personnes âgées. Il serait donc important de promouvoir les études qui œuvrent à trouver les moyens d'atténuer l'exposition humaines aux polluants et, de soutenir celles qui dénoncent les sources primaires de pollution. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Mercure, organochlorés, apport en mercure, hormones thyroïdiennes, performances neurologiques.

Le but de la première partie de ce travail était de mieux comprendre la tumorigenèse thyroïdienne à<p>partir de modèles murins transgéniques développant des tumeurs de la thyroïde. Nous avons ainsi<p>analysé par microarrays l’expression génique au sein de thyroïdes de souris Tg-RP3 exprimant le<p>réarrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroïde chez l’homme (PTC), et<p>de souris Tg-E7 exprimant l’oncogène E7, responsable de cancers du col de l’utérus chez la femme.<p>Ces deux gènes étaient exprimés exclusivement dans la thyroïde grâce à un promoteur thyroglobuline.<p>Nous avons comparé les profils d’expression entre les différents génotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-<p>E7) mais également entre différents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7<p>développaient d’énormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquée, mais n’ont pas démontré<p>de réelles lésions de carcinomes aux différents âges étudiés. Les thyroïdes de souris Tg-RP3<p>démontraient quand à elle une prolifération cellulaire et une croissance plus modérées, mais des<p>remaniements tissulaires plus importants, présents dès 2 mois, avec apparition de lésions de carcinome<p>chez de nombreux animaux essentiellement à 6 et 10 mois. Les résultats de l’analyse de l’expression<p>génique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroïdes E7, ce sont<p>essentiellement les gènes impliqués dans le cycle cellulaire qui ont démontré une surexpression<p>significative. Dans les thyroïdes RP3, les processus cellulaires les mieux représentés par les gènes<p>surexprimés étaient déjà décrits comme des processus ayant un rôle important dans la tumorigenèse<p>thyroïdienne humaine :l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenèse. De<p>plus, plusieurs gènes classiquement surexprimés dans les PTC humains, l’étaient également dans les<p>thyroïdes RP3. Parmi ceux-ci le récepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase<p>(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamine<p>D3, ont particulièrement retenu notre attention étant donné une littérature croissante sur les effets antiprolifératifs<p>et immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons donc<p>étudié dans la deuxième partie de notre travail les effets anti-prolifératifs et transcripionnels du<p>calitriol sur plusieurs modèles thyroïdiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu démontrer d’effets<p>concluants sur des lignées de cancers thyroïdiens humains, nous avons par contre démontré un effet<p>anti-prolifératif, le plus souvent dose-réponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroïdes de<p>souris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivation<p>de la vitamine D, et le récepteur à la TSH ont démontré une surexpression significative en présence de<p>calcitriol par RTQ-PCR. Une étude d’expression génique par microarrays sur des cultures primaires de<p>thyroïdes RP3 et humaines traitées par éthanol (contrôle) ou calcitriol a permis de mettre en évidence<p>3 gènes significativement régulés dans le même sens, en l’occurrence sous-exprimés, en présence de<p>calcitriol :la nébulette, la thymopoïétine et la cycline E2. Le rôle exact joué par ces trois protéines<p>dans l’effet anti-prolifératif observé reste à déterminer. Les études in vivo de carence alimentaire en<p>vitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas démontré de différences significatives entre le groupe carencé<p>et non carencé que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression génique, après 2 ou 6<p>mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimée après 2<p>mois, surexpression disparaissant après 6 mois. Cette régulation pourrait témoigner d’un mécanisme<p>d’adaptation de la thyroïde qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant la<p>concentration locale de vitamine D active. Ce phénomène disparaissant à 6 mois, il serait intéressant<p>de prolonger la carence au-delà de 6 mois pour assurer une réelle carence locale en 1,25-<p>dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traité des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variables<p>de CD578, un analogue « non calcimimétique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effet<p>significatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) était également la dose la<p>plus toxique, entrainant une hypercalcémie parfois létale. Le protocole principal a du être écourté en<p>raison d’un excès de mortalité. Le petit nombre d’animaux ayant survécu ne nous a pas permis de<p>conclure à une différence d’expression significative du Ki67 dans les thyroïdes de souris traitées par<p>CD578 par rapport aux souris contrôles. De nouvelles expériences devront donc être réalisées aux<p>doses les moins toxiques, administrées sur une plus longue période et sur un plus grand nombre<p>d’animaux, afin d’augmenter la probabilité d’observer un effet sur la prolifération, voire la<p>différenciation tissulaire. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’hypothyroïdie congénitale par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) est la condition endocrinienne néonatale la plus fréquemment rencontrée, avec une incidence d’un cas sur 4000 naissances vivantes. L’HCDT comprend toutes les anomalies du développement de la thyroïde. Parmi ces anomalies, le diagnostic le plus fréquent est l’ectopie thyroïdienne (~ 50% des cas). L’HCDT est fréquemment associée à un déficit sévère en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdisme) pouvant conduire à un retard mental sévère si non traitée. Le programme de dépistage néonatal assure un diagnostic et un traitement précoce par hormones thyroïdiennes. Cependant, même avec un traitement précoce (en moyenne à 9 jours de vie), un retard de développement est toujours observé, surtout dans les cas les plus sévères (c.-à-d., perte de 10 points de QI). Bien que des cas familiaux soient rapportés (2% des cas), l’HCTD est essentiellement considérée comme une entité sporadique. De plus, plus de 92% des jumeaux monozygotiques sont discordants pour les dysgénésies thyroïdiennes et une prédominance féminine est rapportée (spécialement dans le cas d’ectopies thyroïdiennes), ces deux observations étant clairement incompatible avec un mode de transmission héréditaire mendélien. Il est donc cohérent de constater que des mutations germinales dans les facteurs de transcription thyroïdiens connus (NKX2.1, PAX8, FOXE1, and NKX2.5) ont été identifiées dans seulement 3% des cas sporadiques testés et furent, de plus, exclues lors d’analyse d’association dans certaines familles multiplex. Collectivement, ces données suggèrent que des mécanismes non mendéliens sont à l’origine de la majorité des cas de dysgénésie thyroïdienne. Parmi ces mécanismes, nous devons considérer des modifications épigénétiques, des mutations somatiques précoces (au stade du bourgeon thyroïdien lors des premiers stades de l’embryogenèse) ou des défauts développementaux stochastiques (c.-à-d., accumulation aléatoire de mutations germinales ou somatiques). Voilà pourquoi nous proposons un modèle «2 hits » combinant des mutations (épi)génétiques germinales et somatiques; ce modèle étant compatible avec le manque de transmission familial observé dans la majorité des cas d’HCDT. Dans cette thèse, nous avons déterminé si des variations somatiques (épi)génétiques sont associées à l’HCTD via une approche génomique et une approche gène candidat. Notre approche génomique a révélé que les thyroïdes ectopiques ont un profil d’expression différent des thyroïdes eutopiques (contrôles) et que ce profil d’expression est enrichi en gènes de la voie de signalisation Wnt. La voie des Wnt est cruciale pour la migration cellulaire et pour le développement de plusieurs organes dérivés de l’endoderme (p.ex. le pancréas). De plus, le rôle de la voie des Wnt dans la morphogénèse thyroïdienne est supporté par de récentes études sur le poisson-zèbre qui montrent des anomalies du développement thyroïdien lors de la perturbation de la voie des Wnt durant différentes étapes de l’organogénèse. Par conséquent, l’implication de la voie des Wnt dans l’étiologie de la dysgénésie thyroïdienne est biologiquement plausible. Une trouvaille inattendue de notre approche génomique fut de constater que la calcitonine était exprimée autant dans les thyroïdes ectopiques que dans les thyroïdes eutopiques (contrôles). Cette trouvaille remet en doute un dogme de l’embryologie de la thyroïde voulant que les cellules sécrétant la calcitonine (cellules C) proviennent exclusivement d’une structure extrathyroïdienne (les corps ultimobranchiaux) fusionnant seulement avec la thyroïde en fin de développement, lorsque la thyroïde a atteint son emplacement anatomique définitif. Notre approche gène candidat ne démontra aucune différence épigénétique (c.-à-d. de profil de méthylation) entre thyroïdes ectopiques et eutopiques, mais elle révéla la présence d’une région différentiellement méthylée (RDM) entre thyroïdes et leucocytes dans le promoteur de FOXE1. Le rôle crucial de FOXE1 dans la migration thyroïdienne lors du développement est connu et démontré dans le modèle murin. Nous avons démontré in vivo et in vitro que le statut de méthylation de cette RDM est corrélé avec l’expression de FOXE1 dans les tissus non tumoraux (c.-à-d., thyroïdes et leucocytes). Fort de ces résultats et sachant que les RDMs sont de potentiels points chauds de variations (épi)génétiques, nous avons lancé une étude cas-contrôles afin de déterminer si des variants génétiques rares localisés dans cette RDM sont associés à la dysgénésie thyroïdienne. Tous ces résultats générés lors de mes études doctorales ont dévoilé de nouveaux mécanismes pouvant expliquer la pathogenèse de la dysgénésie thyroïdienne, condition dont l’étiologie reste toujours une énigme. Ces résultats ouvrent aussi plusieurs champs de recherche prometteurs et vont aider à mieux comprendre tant les causes des dysgénésies thyroïdiennes que le développement embryonnaire normal de la thyroïde chez l’homme. / Congenital hypothyroidism from thyroid dysgenesis (CHTD) is the most common congenital endocrine disorder with an incidence of 1 in 4,000 live births. CHTD includes multiple abnormalities in thyroid gland development. Among them, the most common diagnostic category is thyroid ectopy (~ 50 % of cases). CHTD is frequently associated with a severe deficiency in thyroid hormones (hypothyroidism), which can lead to severe mental retardation if left untreated. The newborn biochemical screening program insures the rapid institution of thyroid hormone replacement therapy. Even with early treatment (on average at 9 d), subtle developmental delay is still be observed in severe cases (i.e., IQ loss of 10 points). Although there have been some reports of familial occurrence (in 2% of the cases), CHTD is mainly considered as a sporadic entity. Furthermore, monozygotic (MZ) twins show a high discordance rate (92%) for thyroid dysgenesis and female predominance is observed in thyroid dysgenesis (especially thyroid ectopy), these two observations being incompatible with simple Mendelian inheritance. In addition, germline mutations in the thyroid related transcription factors NKX2.1, PAX8, FOXE1, and NKX2.5 have been identified in only 3% of sporadic cases and linkage analysis has excluded these genes in some multiplex families with CHTD. Collectively, these data point to the involvement of non-Mendelian mechanisms in the etiology of the majority of cases of thyroid dysgenesis. Among the plausible mechanisms are epigenetic modifications, somatic mutations occurring in the thyroid bud early during embryogenesis, or stochastic developmental events. Hence, we proposed a two-hit model combining germline and somatic (epi)genetic variations that can explain the lack of clear familial transmission of CTHD. In this present thesis, we assessed the role of somatic (epi)genetic variations in the pathogenesis of thyroid dysgenesis via a genome-wide as well as a candidate gene approach. Our genome wide approach revealed that ectopic thyroids show a differential gene expression compared to that of normal thyroids, with enrichment for the Wnt signalling pathway. The Wnt signalling pathway is crucial for cell migration and for the development of several endoderm-derived organs (e.g., pancreas). Moreover, a role of Wnt signalling in thyroid organogenesis was further supported by recent zebrafish studies which showed thyroid abnormalities resulting from the disruption of the Wnt pathway during different steps of organogenesis. Thus, Wnt pathway involvement in the etiology of thyroid ectopy is biologically plausible. An unexpected finding of our genome-wide gene expression analysis of ectopic thyroids was that they express calcitonin similar to normally located (orthotopic) thyroids. Such a finding, although in contradiction with our current knowledge of the embryological development of the thyroid attributes C cell origins to extrathyroidal structures (ultimobrachial bodies) upon fusion with a fully-formed, normally situated gland. Using a candidate gene approach, we were unable to demonstrate any differences in the methylation profile between ectopic and eutopic thyroids, but nevertheless we documented the presence of a differentially methylated region (DMR) between thyroids and leukocytes in the promoter of FOXE1, a gene encoding the only thyroid related transcription factor known to play a crucial role in regulating the migration of the thyroid precursors during development as shown by animal studies. We demonstrated by in vivo and in vitro studies that the methylation status of this DMR is correlated with differential expression of FOXE1 in non-tumoral tissues (thyroids and leukocytes). Knowing that DMRs are hotspots for epi(genetic) variations, its screening among CTHD patients is justifiable in our search for a molecular basis of thyroid dysgenesis, currently underway in a case-control study. The results generated during my graduate studies represent unique and novel mechanisms underlying the pathogenesis of CHTD, the etiology of which is still an enigma. They also paved the way for many future studies that will aid in better understanding both the normal and pathogenic development of the thyroid gland.

Le fipronil, insecticide largement utilisé, est un perturbateur thyroïdien chez le rat modulant le catabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes. Ses effets chez le mouton, considéré comme un modèle plus pertinent que le rat pour étudier une régulation de la fonction thyroïdienne chez l'Homme, sont plus limités. Le but de cette thèse était de caractériser au niveau hépatique le mode d'action du fipronil sur la fonction thyroïdienne en s'intéressant 1) au rôle potentiel du principal métabolite du fipronil formé in vivo, le fipronil sulfone, et 2) aux différences interspécifiques de métabolisme du fipronil et/ou de sensibilité à la perturbation thyroïdienne qui peuvent préjuger de la pertinence des différents modèles animaux pour l'analyse du risque du fipronil pour la santé humaine. L'efficacité du fipronil sulfone à induire l'expression et/ou l'activité d'enzymes responsables du métabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes ou du fipronil était la même que celle du fipronil autant in vivo chez le rat que in vitro sur hépatocytes. L'utilisation d'un modèle de souris déficientes pour des récepteurs nucléaires xénosenseurs suggérait fortement une implication des récepteurs nucléaires Constitutive Androstane Receptor et/ou Pregnane X Receptor dans la perturbation thyroïdienne induite par le fipronil / The widely used insecticide fipronil is a thyroid disruptor in rat acting on thyroid hormone hepatic metabolism. In sheep, a more relevant species for the human thyroid regulation, fipronil-induced thyroid-disruption is much more limited. The goal of this thesis was to characterize the mode of action of fipronil on thyroid function at the hepatic level focusing on 1) the potential role of fipronil sulfone, the main fipronil metabolite formed in vivo, and on 2) interspecific differences in terms of fipronil metabolism and/or sensitivity to thyroid disruption that can prejudge of the relevance of the different animal models for the risk assessment of fipronil for human health. Fipronil sulfone was as efficient as fipronil to induce the expression and/or activity of enzymes involved in thyroid hormone or fipronil hepatic metabolism both in vivo in rat and in vitro on hepatocytes. The use of knock-out mice for xenosensors nuclear receptors strongly suggested an implication of the nuclear receptor Constitutive Androstane Receptor and/or Pregnane X Receptor on fipronil-induced thyroid disruption

L'hormone thyroïdienne (T3) contrôle à la fois les processus développementaux et physiologiques. Elle agit via les récepteurs de l'hormone thyroïdienne (TR), membres de la famille des récepteurs hormonaux nucléaires. Ils agissent comme des facteurs de transcription dépendants du ligand. La méthylation de l'ADN en position 5 de la cytosine est une modification épigénétique importante qui affecte la structure de la chromatine et l'expression des gènes. Des études récentes ont établi un rôle important des protéines de la famille TET (Ten-eleven translocation) dans la régulation de la dynamique de la méthylation de l'ADN. Elles convertissent la 5-méthyl-cytosine (5mC) en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC). D’autres études ont démontré que les protéines TET (TET1, TET2 et TET3) possèdent des fonctions de régulation transcriptionnelle dépendantes et indépendantes de leur activité catalytique. Notre étude a identifié TET3 comme une nouvelle protéine interagissant avec TR. Le domaine AF2 de TR ainsi que le domaine catalytique et le domaine CXXC de TET3 sont responsables de cette interaction. Celle-ci permet la stabilisation de TR lié à la chromatine, entraînant une potentialisation de son activité transcriptionnelle. L'effet de modulation de TET3 sur TR présenté ici est indépendant de son activité hydroxylase de TET3. Ainsi, cette étude met en évidence un nouveau mode d'action de TET3 en tant que régulateur non classique de TR, modulant sa stabilité et son accès à la chromatine plutôt que son activité de transcription intrinsèque. Des mutations du gène codant pour TRα provoquent le symptôme RTHα dont la gravité varie en fonction de la mutation. Les différentes capacités d’interaction des mutants TRα, pertinents pour la maladie de RTHα humaine, avec TET3 pourraient expliquer les différences d’effet dominant négatif. La fonction de régulation de TET3 pourrait s’appliquer plus généralement aux facteurs de transcription des récepteurs nucléaires, car différents membres de la superfamille des récepteurs nucléaires présentent la même interaction avec TET3, tels que AR (récepteur des androgènes), ERR (récepteur des œstrogènes) et RAR (récepteur de l'acide rétinoïque). L'interaction entre TET3 et RAR implique le domaine de liaison ADN de RAR. La pertinence fonctionnelle de l'interaction TET3 / RAR a été étudiée plus en détail dans les cellules souches embryonnaire (cellules ES). L’absence combinée des trois TET a entraîné la diminution de 5hmC et la dérégulation des gènes impliqués dans la différenciation des cellules ES. Parmi les gènes dérégulés, nous avons identifié un sous-ensemble de gènes cibles de l’acide rétinoïque, suggérant que les RAR (récepteurs d'acide rétinoïque) et les TET pourraient travailler ensemble pour réguler la différenciation des cellules ES. Une étude supplémentaire a révélé que les protéines TET peuvent jouer un rôle dans la facilitation du recrutement de RAR aux régions promotrices de ses gènes cibles. En outre, nos résultats montrent un rôle potentiel de l'activité hydroxylase des protéines TET dans la modulation de l'activité transcriptionnelle des RAR. En conclusion, notre travail a identifié les protéines TET comme nouveaux régulateurs des récepteurs nucléaires. Les mécanismes exacts impliqués doivent être étudiés plus avant. / Thyroid hormone (T3) controls both developmental and physiological processes. Its nuclear receptors, thyroid hormone receptors (TRs), are members of the nuclear hormone receptor family which act as ligand-dependent transcription factors. DNA methylation at the fifth position of cytosine is an important epigenetic modification that affects chromatin structure and gene expression. Recent studies have established a critical function of the Ten-eleven translocation (TET) family proteins in regulating DNA methylation dynamics by converting 5-methyl-cytosine (5mC) into 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). Studies demonstrated that TETs proteins (including TET1, TET2 and TET3) possess catalytic activity dependent and independent transcriptional regulatory functions. Our study identified TET3 as a new TR interacting protein. The AF2 domain of TR and the catalytic domain and CXXC domain of TET3 are responsible for their interaction. This interaction allows the stabilization of chromatin bound TR, resulting in a potentiation of its transcriptional activity. The modulation effect of TET3 on TR presented here is independent of its hydroxylase activity. Thus this study evidences a new mode of action for TET3 as a non-classical regulator of TR, modulating its stability and access to chromatin rather that its intrinsic transcriptional activity. Mutations in TR cause the RTH symptom which severity varies with the particular mutation. The differential ability of different TRα mutants, relevant for the human RTHα disease, to interact with TET3 might explain their differential dominant negative activity. The regulatory function of TET3 might be more general towards the nuclear receptor transcriptional factors since different members of the superfamily present the same interaction with TET3, such as AR (androgen receptor), ERR (Estrogen-related receptor) and RAR (retinoic acid receptor). The interaction between TET3 and RAR involves the DNA binding domain of RAR. The functional relevance of TET3/RAR interaction was further studied in ES cells. Combined deficiency of all three TETs led to depletion of 5hmC and deregulation of genes involved in ES differentiation. Among the deregulated genes, a subset of RA response genes was identified, suggesting that RARs (retinoic acid receptors) and TETs might work together to regulate ES cell differentiation. Further dissection revealed that TET proteins may have a role in facilitating RAR recruitment to the promoter regions of these RAR target genes. Moreover, our results indicated a potential role of the hydroxylase activity of TET proteins in modulating RAR transcriptional activity. Altogether, our work identified TET proteins as new regulators of NR (Nuclear Receptors). The exact mechanisms involved need to be further studied.

L’hypothyroïdie congénitale (HC), qui se traduit par une insuffisance d’hormone thyroïdienne (HT) à la naissance, est la maladie endocrinienne congénitale la plus fréquente avec une prévalence d’un cas sur 2,500 naissances vivantes. Non-traitée, cette insuffisance peut entrainer un retard de développement sévère, surtout au niveau cognitif. L’HC est le plus souvent due à un défaut lors du développement de la thyroïde (dysgénésie thyroïdienne (DT)) ou lors de la production des hormones thyroïdiennes (dyshormonogenèse (D)). La majorité des cas d’HC par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) ont une ectopie, soit une glande mal positionnée. Contrairement aux dyshormonogenèses, qui s’expliquent fréquemment par des mutations dans les gènes responsables de la production des HT, selon un modèle autosomique récessif, les causes de l’HCDT demeurent largement inconnues. Certains arguments sont en faveur d’une prédisposition génétique (le risque relatif chez les parents de premier degré est de 40 fois supérieur à celui de la population générale) mais l’HCDT ne suit pas un modèle Mendélien: 98 % des cas sont sporadiques et 92 % des jumeaux monozygotiques sont discordants pour l’HCDT. De ce fait, nous avons suggéré une hypothèse de double-hit pour expliquer les HCDT, hypothèse combinant une prédisposition germinale (héritée ou de novo) à un évènement somatique (génétique ou épigénétique). Par le passé, nous avons étudié l’évènement somatique, mais nous n’avions pas encore étudié la prédisposition germinale. Le séquençage d’exome complet peut permettre d’identifier la cause génétique dans des formes familiales d’HC, mais aussi déterminer si les cas avec une HCDT isolée sont enrichis en variants délétères, tel qu’observé chez des patients avec une malformation cardiaque congénitale, patients qui partagent des caractéristiques similaires avec ceux atteints d’HCDT. De plus, cette technique pourrait permettre d’identifier de nouveaux gènes de prédisposition associés à l’HCDT. D’une part, nous avons séquencé l’exome d’un trio (parent-enfant) afin d’identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants sévèrement atteints d’HC. D’autre part, nous avons comparé les données d’exome d’une cohorte de cas avec une HCDT isolée (HCDT non syndromique, HCDT-NS) à celles d’une cohorte contrôle, à l’aide d’une approche biaisée (gene-based burden) et non biaisée (gènes candidats). Finalement, nous avons développé le modèle de poisson-zèbre afin de pouvoir valider, in vivo, l’implication de potentiels gènes candidats, dans le développement thyroïdien. L’analyse de l’exome du trio a révélé un variant dans le gène TSHR qui co-ségrégait parfaitement avec le phénotype, et les études de minigène ont permis de montrer que ce variant intronique loin des sites d’épissage traditionnels introduisait un pseudo-exon dans la séquence du TSHR, créant ainsi un récepteur tronqué et inactif. L’analyse par comparaison de cohorte (cas-contrôle) a montré que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants rares délétères comparé aux contrôles. De plus, après correction, le gene-based burden n’a pas identifié de gène candidat. Par contre, des variants rares pathogéniques ou probablement pathogéniques dans des gènes liés à l’hypothyroïdie congénitale ont été identifiés chez 42% des cas. Les études réalisées chez le poisson-zèbre sur un gène candidat, IKBKE, identifié par une analyse préliminaire de l’exome dans la cohorte de cas, confirme que les vaisseaux sanguins sont importants pour le bon positionnement de la glande thyroïde chez le poisson-zèbre, mais ne permet pas d’établir le rôle d’IKBKE dans la migration thyroïdienne. Nous avons d’abord montré que l’exome est une bonne technique pour identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants atteints. Toutefois, une connaissance approfondie de la maladie et des isoformes du gène d’intérêt s’est avérée essentielle afin de bien analyser les données d’exome. Ensuite, nos résultats suggèrent que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants délétères que les contrôles et que l’exome complet n’est pas suffisant pour identifier des gènes de prédisposition. Le séquençage du génome est peut-être nécessaire pour trouver une prédisposition génétique à l’HCDT-NS. Par contre, il est aussi possible que la génétique ne joue pas un rôle majeur dans les dysgénésies thyroïdiennes. Finalement, nous avons validé que le poisson-zèbre est un bon modèle pour étudier le développement de la thyroïde. / Congenital hypothyroidism (CH) is a disorder with a prevalence of one in 2,500 live births. CH can lead to severe intellectual disability if left untreated. It is most commonly caused by a defect during thyroid development (thyroid dysgenesis), which results in an ectopic gland in the majority of cases. A defect in thyroid hormone production (dyshormonogenesis) is the second most common cause of CH. In contrast to dyshormonogenesis, which generally has an identified cause and follows a Mendelian mode of inheritance, the cause of CHTD remains mostly unknown. CHTD is generally sporadic (98%) and has a high discordance rate (92%) between monozygotic twins. However, first-degree relatives are affected more often than by chance alone (40x) and there is an ethnic and female predominance. We thus hypothesized that CHTD is a disorder caused by two events, one germinal (a necessary but not sufficient predisposing factor) becoming pathogenic only if a second genetic or epigenetic event occurs at the somatic level. Whole exome sequencing (WES) can allow for identification of the genetic cause of CHTD in familial forms, but may also reveal if non-syndromic CHTD (NS-CHTD) cases are enriched in rare protein-altering variant, as seen in congenital heart malformations, a developmental defect that shares several characteristics with CHTD. Moreover, it might also identify new predisposing genes. First, we performed WES on a trio (parent-child) in a family with several siblings affected with severe CH. Second, we compared WES data of a NS-CHTD cohort with data from a control cohort, using a gene-based burden (unbiased) approach and a candidate gene (biased) approach to evaluate whether WES analysis allows to identify new predisposing genes in a well-characterized cohort. Finally, we developed the zebrafish model to test the roles of candidate genes, that will be identified by WES, in thyroid development. We first identified a variant in TSHR that segregated perfectly with the phenotype in the family with CHTD and a mini gene assay showed that this deep intronic variant induced a pseudo-exon, leading to a truncated protein missing the transmembrane domain, thus an inactive TSH receptor. Next, we found that NS-CHTD cases are not enriched in rare protein-altering variants and gene-base burden analysis did not identify novel candidate genes. However, WES data revealed pathogenic or likely pathogenic variants in CH-related genes in 42% of the NS-CHTD cases. Finally, zebrafish is a good model to study thyroid development and our results on IKBKE confirm the importance of vessels in thyroid positioning, but not its role in thyroid migration. First, we showed that WES analysis is a good tool to identify the causative variant in a family with several siblings affected by CH. However, the interpretation of the exome analysis required knowledge of the expression of the relevant isoforms and of the biology of the disease. Second, while a gene-based burden test, using WES data from a well-characterised NS-CHTD cohort, did not identified new predisposing genes, it identified pathogenic or likely pathogenic variants in 42% of the NS-CHTD cases. Whole genome sequencing might be required to identify the genetic causes in NS-CHTD. However, our result may indicate that genetics does not play a major role in thyroid dysgenesis. Finally, we have established that zebrafish is a good model to study thyroid development and may help, in the future, identify pathways implicated in this process.

La métabolomique par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier laréponse métabolique globale d’un système biologique à un stimulus ou un événementphysiopathologique (maladie, manipulation génétique, etc.). Cette discipline connaît un essorimportant dans la recherche clinique et biologique, et constitue ainsi un outil à fort potentielpour la découverte de biomarqueurs de maladies, et l’étude de la fonction des gènes.Cette thèse est dédiée à l’application de la métabolomique par RMN à hauts champspour l’étude des pathologies associées à la signalisation thyroïdienne chez la souris. L’objectifglobal est d’identifier des biomarqueurs spécifiques liés aux différentes maladies hormonales :l’hypothyroïdie et la maladie génétique émergente résistance à l’hormone thyroïdienne due àune mutation au niveau du récepteur TRα1 (RTHα). Cette dernière est particulièrementdifficile à diagnostiquer à cause du manque de marqueurs biochimiques et de symptômesspécifiques à cette maladie. De plus, elle présente des similitudes avec l’hypothyroïdie auniveau symptomatique. Des modèles murins de RTHα et de l’hypothyroïdie ont été analysés,et l’investigation a été menée sur l’urine et le plasma sanguin dans le but de différenciermétaboliquement ces maladies et d’identifier des biomarqueurs spécifiques à RTHα. Dessignatures métaboliques liées à chaque maladie ont été identifiées dans l’urine et le plasmasanguin. Cinq métabolites qui varient de façon significative ont été identifiés dans l’urinecomme étant liés à la maladie RTHα : trimethylamine, dimethylamine, isovalerylglycine, Nacetylglucosamineet la choline. Dans le sang, ce sont les lipides insaturés qui varient de façonsignificative chez les souris mimant la maladie RTHα. / Metabolomics by nuclear magnetic resonance (NMR) allows studying the metabolicresponse of a global biological system to a stimuli or a physiopathological even (diseases,genetic modifications, etc.). This discipline is growing especially in the clinical and biologicalfields, and represents a strong potential tool to identify biomarkers related to diseases, andstudy the function of genes.This thesis is dedicated to the application of metabolomics by high field NMR to studythyroid signalisation pathologies in mice. The main goal is to identify biomarkers related tothe emerging genetic disease called resistance to thyroid hormone due to a mutation in thyroidhormone receptor TRα1 (RTHα). This disease is particularly difficult to diagnose because ofthe lack of biochemical markers and specific symptoms. In addition, it presents commonfeatures with hypothyroidism in term of symptoms. Mice models of RTHα andhypothyroidism were analysed, and the investigation were driven on urine and blood plasmain order to differentiate metabolically theses diseases and identify biomarkers related toRTHα. Metabolic fingerprints related to each disease were identified in both urine and bloodplasma. Five metabolites vary significantly in the urine of RTHα mice: trimethylamine,dimethylamine, isovalerylglycine, N-acetylglucosamine and choline. Unsaturated lipids varysignificantly in the blood plasma of RTHα mice.The impact of thyroid hormones (TH) and the thyroid hormone receptor TRβ on theliver metabolism were also studied in the present manuscript through NMR-basedmetabolomics. A mouse model, with a specific knock-out of TRβ gene in hepatocytes (LTRβ-KO), were used to study this question. To understand the function of TH mediated by TRβ,the liver metabolic response to TH, obtained from liver aqueous extracts and intact livertissues, TRβKO and wild-type mice were compared. The results suggest the presence ofdirect and indirect effects of thyroid hormones on the liver metabolism.