O Brasil consolidou-se como o principal produtor e exportador mundial de carne bovina. Estudos microbiológicos, geralmente realizados com amostras de carne coletadas no comércio e não na cadeia produtiva de carne, resultam numa insuficiência de dados a respeito das características fenotípicas e genotípicas das bactérias patogênicas de relevância nos produtos destinados à exportação. Objetivando determinar a prevalência e características de Salmonella spp em carne bovina para exportação, realizou-se a coleta de amostras de superfícies de 200 bovinos adultos, provenientes de 12 fazendas, abatidos em Frigorífico Exportador em São Paulo, Brasil, no ano de 2008. Foram coletadas amostras do couro do animal, logo após a realização da sangria (Co), da carcaça do mesmo animal, após a esfola (Ca I) e da carcaça do mesmo animal, após o toalete e antes da refrigeração (Ca II). O isolamento e a identificação de Salmonella spp foram realizados de acordo com o método - ISO 6579:2002, com algumas modificações. O patógeno foi detectado em 14 amostras de couro (7,0%), 5 de carcaça I (2,5%) e 4 de carcaça II (2,0%). Verificou-se a prevalência do sorovar S. Give (52,0%), seguido de S. Abaetetuba (16,0%), S. Typhimurium (8,0%), S. Agona (4,0%) e S. Dublin (4,0%), e quatro cepas (16,0%) não tipáveis. A tipagem molecular, feita por PFGE, mostrou que as salmonelas expressaram 12 perfis genéticos distintos, sendo 10 formados por apenas uma cepa, cada. As demais cepas (15) pertenceram a dois perfis genéticos apenas, que apresentaram 91,7% de similaridade. De acordo com o teste de infecção de células Caco-2, a maioria das cepas (92,0%) apresentou Eficiência de Invasão inferior a 1,0%, indicando baixo potencial de virulência. Quanto ao perfil de resistência a antibióticos, 68,0% das cepas analisadas foram multiresistentes, apresentando 12 perfis diferentes. Animais diferentes, provenientes de uma mesma fazenda, apresentaram salmonelas de um mesmo sorovar e com o mesmo perfil genético e de resistência a drogas, comprovando a ocorrência de contaminação cruzada durante o processamento da carne bovina. A multiresistência das salmonelas isoladas e a possibilidade de disseminação desses patógenos denotam a necessidade de se adotar medidas de higiene adequadas e maior prudência no emprego de antimicrobianos, na dieta alimentar e na terapêutica veterinária. / Brazil is an important bovine meat producer and exporter. Microbiological surveys are generally run with meat samples collected at retail level and not with meat for export, explaining the lack of data on the phenotypic and genotypic characteristics of pathogens of relevance in exported food products. This study aimed to evaluate the prevalence and characteristics of Salmonella spp in bovine meat destined for export, through surface sampling of hides and carcasses of 200 animals, from 12 farms, slaughtered in 2008 in an export slaughterhouse located in São Paulo, Brazil. Sampling was done from the hides right after bleeding (Co) and from carcasses of the same animal after removal of the hide (Ca I) and after cleaning but before chilling (Ca II). Isolation and identification of Salmonella spp were done according to ISO 6579:2002, with some modifications. The pathogen was detected in 14 samples of hides (7,0%), 5 of carcasses Ca I (2,5%) and 4 of carcasses Ca II (2,0%). The most prevalent serovars were S. Give (52,0%), followed by S. Abaetetuba (16,0%), S. Typhimurium (8,0%), S. Agona (4,0%) and S. Dublin (4,0%). Four isolates (16,0%) were not typable. Molecular typing using PFGE indicated that the isolates presented 12 molecular profiles, ten of them containing one single isolate. Fifteen isolates belonged to only two distinct profiles, with 91.7% similarity. Invasion Efficiency tests, run with Caco-2 cells, indicated that most isolates (92,0%) presented low virulence potential. 68,0% of the isolates were multiresistant to antimicrobial drugs, presenting 12 different resistance profiles. Different animals, coming from the same rearing farm, harbored salmonellae belonging to same serovar and presenting the same genetic and antimicrobial resistance profiles, indicating cross contamination in the slaughterhouse during production of meat. The occurrence of salmonellae that can disseminate in the slaughterhouse and the multiresistance presented by the strains strengthen the need for adoption of proper hygiene control measures and care in the use of antibiotics in human and veterinary therapeutics.

Infecções invasivas por Trichosporon spp. ocorrem com maior frequência em pacientes neutropênicos, principalmente portadores de doenças hematológicas malignas, e estão associadas a elevados índices de mortalidade devido às dificuldades na identificação do patógeno e à resistência aos fármacos mais empregados na terapêutica antifúngica. A identificação das espécies de Trichosporon é importante tanto para estudos epidemiológicos, como para associar aspectos clínicos com as espécies causadoras das infecções. Além disso, auxilia no tratamento da enfermidade, uma vez que a suscetibilidades aos fármacos antifúngicos pode variar de acordo com a espécie. Além disso, as leveduras do gênero Trichosporon sintetizam a glucuronoxilomanana (GXM) em sua parede celular, que pode estar envolvida no mecanismo de virulência do patógeno. Este estudo teve como objetivo determinar, por identificação fenotípica e molecular, espécies isoladas de pacientes internados em unidades hospitalares, comparando os resultados obtidos por ambos os métodos; avaliar diferenças na distribuição dessas espécies em relação às formas invasivas e não invasivas da infecção; determinar o perfil de suscetibilidade dessas leveduras aos antifúngicos, empregando um método de micro-diluição de referência e um método comercial; e avaliar a presença de GXM na parede celular dos isolados. Foram avaliados 74 isolados obtidos de amostras clínicas de pacientes do Hospital das Clinicas da FMUSP e de outras unidades hospitalares do Estado de São Paulo, no período de 2003 a 2011. Dezenove amostras foram isoladas de sítios estéreis do organismo (infecções invasivas) e 55 foram isoladas de urina e cateter (isolados não invasivos). Para a identificação das espécies, os isolados foram submetidos a análises fenotípicas, que incluíram estudo macro e micromorfológico, provas fisiológicas e avaliação do perfil bioquímico por sistema automatizado VITEK 2. A identificação molecular foi realizada pelo sequenciamento das regiões IGS e D1/D2 do DNA ribossomal. O perfil de suscetibilidade dos 74 isolados foi analisado pelo método de micro-diluição EUCAST (referência) com os fármacos fluconazol (FCZ), itraconazol (ITZ), voriconazol (VCZ), cetoconazol (CTZ), anfotericina B (AMB) e 5-fluocitosina (5FC); e pelo método de micro-diluição comercial Sensititre YeastOne, com os mesmos fármacos empregados no EUCAST, acrescidos do posaconazol (POS) e caspofungina (CAS). Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), erros categórico e essencial, bem como outros parâmetros foram comparados entre os dois métodos. A presença de GXM na parede celular dos 74 isolados foi determinada por citometria de fluxo, empregando anticorpo monoclonal anti-GXM. Os resultados dos estudos morfológicos e fisiológicos foram insuficientes para definir as espécies dos 74 isolados. Pela assimilação de carboidratos analisada pelo sistema VITEK 2, verificou-se que 71 isolados foram identificados como T. asahii (17 de infecção invasiva e 54 não invasivos), um isolado como T. mucoides (invasivo), e para dois isolados (um invasivo e um não invasivo), a identificação não foi conclusiva. Para estes últimos foi realizado o auxanograma (método manual), e a identificação permaneceu inconclusiva, pois pelo perfil de assimilação, os isolados poderiam ser identificados como T. asahii ou T. faecale. Pela técnica de sequenciamento, 62 dos 74 isolados foram identificados como T. asahii, demonstrando 82,4% de concordância com o sistema VITEK 2. Onze isolados com identificações discordantes pertenciam às espécies T. inkin (8), T. faecale (2) e T. dermatis (1), como determinado por sequenciamento. Dos dois isolados com identificação inconclusiva pelo VITEK 2, um foi identificado pela técnica molecular como T. asahii, enquanto para o outro isolado não foi possível definir a espécie. Portanto, dos 74 isolados do estudo, 62 foram identificados como T. asahii, 8 como T. inkin, 2 como T. faecale e 1 T. dermatis; dois isolados permaneceram sem identificação conclusiva. Os resultados dos testes de suscetibilidade in vitro mostraram que, em ambos os métodos, VCZ apresentou a melhor atividade antifúngica. Pelo método EUCAST, foram obtidos valores elevados de CIM para AMB, enquanto o mesmo não foi observado no teste comercial. Neste último, foram observados valores elevados de CIM para FCZ, POS e CAS. Em relação à 5FC, os valores de CIM 90% por ambos os testes foram elevados (16mg/L). Diferenças significantes foram observadas entre os valores de CIM obtidas pelos dois métodos, e percentuais relativamente elevados de erros categóricos graves quando o método comercial foi comparado ao de referência. Não houve diferença estatística significante de valores de CIM entre isolados de infecção invasiva e não invasiva, exceto para ITZ e 5FC. Cerca de 30% dos isolados obtidos de casos de infecção invasiva e não invasivos apresentaram resistência cruzada entre os azóis FCZ e VCZ, e uma pequena porcentagem apresentou multirresistência. Para a análise de GXM na parede celular dos 74 isolados do estudo, foi avaliada a intensidade de fluorescência emitida pela citometria de fluxo, não tendo sido observada diferença estatística significante entre isolados invasivos e não invasivos. O estudo permitiu concluir que T. asahii foi a espécie mais isolada das amostras clínicas obtidas de sítios estéreis e não estéreis. A metodologia clássica de identificação fenotípica não foi suficiente para definir as espécies do gênero Trichosporon, e o sistema VITEK 2 apresentou discordância quando comparado à técnica molecular para as espécies não T. asahii. Em relação aos testes de suscetibilidade in vitro, VCZ apresentou-se mais adequado para a inibição das leveduras, enquanto os fármacos AMB, FCZ e POS não foram eficazes para a maior parte dos isolados. As discordâncias encontradas entre o método de referência e o comercial sugerem que, para o segundo, são necessárias mais avaliações para seu emprego em rotina laboratorial para o gênero Trichosporon. A detecção de GXM não resultou em diferenças entre os isolados de ambos os grupos; no entanto, para se determinar o efeito protetor do polissacarídeo contra a ação de macrófagos, ensaios de fagocitose devem ser realizados / Invasive Trichosporon spp. infections occur more frequently in neutropenic patients, especially those with hematologic malignancies, and are associated with high mortality rates due to difficulties in identifying the pathogen and treating patients with drugs most currently employed in antifungal therapy. Trichosporon species identification is important for epidemiological studies and to better define eventual species-specific clinical association. Additionally, antifungal susceptibility may vary according to the species. Furthermore, glucuronoxylomannan (GXM) is a cell wall-associated polysaccharide produced by genus Trichosporon, which may be involved in virulence mechanisms of this pathogen. This study aimed (i) to identify Trichosporon species isolated from hospitalized patients by both phenotypic and molecular methods, comparing results; (ii) to verify the distribution of these species in invasive and non-invasive infection episodes; (iii) to determine the in vitro activities of various antifungals agents against the Trichosporon spp. isolates, employing a reference micro-dilution method and a commercial system; (iv) and to analyze the surface expression of GXM. Seventy-four Trichosporon spp. isolates obtained from clinical specimens of patients admitted to the Hospital das Clínicas-FMUSP and to other hospitals in the state of São Paulo, from 2003 to 2011, were included in the study. Nineteen samples were isolated from sterile deep sites (invasive infections) and 55 were isolated from catheter and urine samples (non-invasive isolates). All isolates were submitted to phenotypic analysis, which consisted in morphological features observation, physiological tests and determination of the biochemical profile by VITEK 2 system. Molecular identification was performed by sequencing of IGS1 and D1/D2 regions from the ribosomal DNA. The susceptibility antifungal profiles of the 74 isolates were analyzed by both the EUCAST micro-dilution method (reference) employing fluconazole (FCZ), itraconazole (ITZ), voriconazole (VCZ), ketoconazole (CTZ), amphotericin B (AMB) and 5 - flucytosine (5FC), and the commercial micro-dilution test Sensititre YeastOne, with the same drugs employed in EUCAST plus posaconazole (POS) and caspofungin (CAS). The minimum inhibitory concentration values (MIC), categorical and essential errors as well as other susceptibility parameters were compared between both methods. The cell wall expression of GXM of all isolates was measured by flow cytometry employing an anti-GXM monoclonal antibody. The morphological and physiological features of the Trichosporon spp. isolates were insufficientto define species. The carbohydrate assimilation analysis, performed by VITEK 2 system, has resulted in 71 isolates identified as T. asahii (17 from invasive infections and 54 non-invasive isolates) and one isolate as T. mucoides (invasive). The species identification for the two remaining isolates (one invasive and one non-invasive) was inconclusive. For this reason, a manual auxanogram was performed with these isolates, resulting again in non-conclusive species identification. By the automated sequencing method, 62 of the 74 isolates were identified as T. asahii, showing 82.4% of agreement with the VITEK 2 identification. Eleven isolates were identified by sequencing as T. inkin (8), T. faecale (2) and T. dermatis (1), showing disagreement identification with the VITEK 2 system. Regarding the two isolates with inconclusive results by the carbohydrate assimilation, the molecular technique identified one as T. asahii, whereas for the other isolate the sequencing was also unable to define species. Therefore, among the 74 studied isolates, 62 were identified as T. asahii, eight as T. inkin, two as T. faecale and one as T. dermatis; and two isolates remained with unconclusive identification. Almost all Trichosporon spp. isolates displayed susceptibility to VCZ with both methods. By the EUCAST method, high values of MIC were observed for AMB, while by the commercial test especially the invasive isolates showed susceptibility to this drug. Additionally, the Sensititre kit provided elevated MIC values for FCZ, POS and CAS. In regards to 5FC, the MIC 90% values were consistently high (16 mg/L) in both methodologies. The MIC values obtained by both EUCAST and commercial methods were compared, resulting in significant differences of MIC values for all tested antifungal drugs; major categorical errors occurred at relatively high percentage with the commercial method. No statistically significant differences in MIC values were verified when invasive and non-invasive isolates were compared. Around 30% of both invasive and non-invasive isolates showed cross-resistance to FCZ and VCZ, while a small number of isolates was multiresistant. The GXM analysis by cytometry demonstrated no significant differences between invasive and non- invasive isolates. This study demonstrated that T. asahii was the most frequently isolated species from both deep and non-sterile sites of the patients. The classical phenotypic methodology was not able to define Trichosporon species, and the VITEK 2 system identification showed disagreement with the sequencing technique for the non-T. asahii species. Regarding the in vitro susceptibility tests, VCZ was the most effective drug against the isolates, whereas most of them appear to be less susceptible to AMB, FCZ and POS. The discrepancies in the Trichosporon spp. susceptibility results between the reference and commercial methods suggest that the latter requires further evaluation tests before it can be used in routine laboratory. Although the GXM expression seemed to be equal in both invasive and non-invasive Trichosporon spp. isolates, phagocytic assays should be performed in order to determine the protective effect of the polysaccharide against phagocytosis

MRSA é um importante agente de colonização e infecção em pacientes hepatopatas e transplantados de fígado. Este estudo tem como objetivo avaliar a clonalidade e a virulência de isolados MRSA de pacientes hepatopatas atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. De agosto de 2010 a janeiro de 2012, foram coletados swabs nasais e inguinais de 190 pacientes (126 pré-transplante e 64 de pós-transplante). Isolados de MRSA foram identificados fenotipicamente e foi realizada detecção de genes de virulência, caracterização do tipo de SCCmec, análise de polimorfismo genômico por PFGE e técnica de microarranjo. Além disso, determinou-se a CIM para dez antimicrobianos pelo método de microdiluição em caldo. MRSA foi detectado em 20% dos pacientes pelo método de cultura e em 82% por PCRs. Apenas três pacientes colonizados desenvolveram infecção após o transplante. Entre os 69 isolados de MRSA, 42,0% (29/69) apresentaram SCCmec tipo II, 20,3% (14/69) SCCmec tipo I, 20,3% (14/69) SCCmec tipo III, 13,0% (9/69) SCCmec tipo IVa, 2,9% (2/69) SCCmec tipo IV e 1,5% (1/69) SCCmec tipo V. O gene tst foi detectado em 5,8% (4/69) dos isolados MRSA e todos eles foram definidos como SCCmec tipo I. Outros genes identificados por PCR foram: lukD (89,9%; 62/69), lukE (89,9%; 62/69), clf (91,3%; 63/69) e fnbA (89,9%; 62/69). A análise por PFGE dos 69 isolados mostrou a presença de um clone predominante chamado cluster A em 36,2% (25/69) e este cluster apresentou 84,6% de similaridade com o clone NewYork/Japan (BK2464). O dendrograma demonstrou também a presença de um cluster relacionado com BEC (Clone Endêmico Brasileiro) HSJ216. Atualmente o tipo de SCCmec mais prevalente em nosso hospital é o tipo II. Neste estudo, observou-se a presença de isolados virulentos tanto em pacientes hepatopatas como em pacientes transplantados. Nossos resultados mostraram que o clone predominante (cluster A) apresentou diferentes genes de virulência (genes fnbA, clf e lukD-lukE) e foi resistente a pelo menos seis diferentes drogas, além de ser caracterizado como HA-MRSA SCCmec tipo II. Em conclusão, a técnica de microarranjo permite a genotipagem e detecção de genes estafilocócicos clinicamente relevantes, e pode, na maioria dos casos, ser utilizada como uma importante ferramenta para a triagem da virulência e resistência a antimicrobianos em isolados de MRSA / MRSA is an important agent of colonization and infection in patients with liver disease and liver transplant. This study aims to evaluate clonality and virulence of MRSA isolates from liver diseases patients treated at Hospital of Clinics Faculty of Medicine from University of Sao Paulo. From August 2010 to January 2012, we collected nasal and groin swabs from 190 patients (126 pre-liver and 64 post-liver). MRSA isolates were identified phenotypically and the detection of virulence genes, characterization of SCCmec type, microarray and genomic polymorphism analysis by PFGE were done. In addition, it was determined the MIC for ten antibiotics by broth microdillution method. MRSA was detected in 20% patients by culture method and 82% by PCR. Only three patients colonized developed infection post-transplantation. Among the 69 MRSA isolates, 42.0% (29/69) had type II SCCmec, 20.3% (14/69) SCCmec type I, 20.3% (14/69) SCCmec type III, 13.0% (9/69) SCCmec type IVa, 2.9% (2/69) SCCmec type IV and 1.5% (1/69) SCCmec type V. The tst gene was detected in 5.8% (4/69) of MRSA isolates and all of them were defined as SCCmec type I. Other genes were identified by PCR: lukD (89.9%; 62/69), lukE (89.9%; 62/69), clf (91.3%; 63/69) and fnbA (89.9%; 62/69). The PFGE analysis of 69 isolates showed the presence of a predominant cluster named cluster A in 36.2% (25/69) and this cluster had 84.6% similarity with New York/Japan clone (BK2464). Dendrogram also demonstrated presence of one cluster related with BEC (Brazilian Endemic Clone) HSJ216. Currently the most prevalent SCCmec type in our hospital is type II. In this study, we observed virulent isolates in pre and post-transplantation patients. Our results showed that the predominant clone (cluster A) had different virulence genes (genes fnbA, clf and lukD-lukE) and was resistant to at least six different drugs, in addition to being characterized as HA-MRSA SCCmec type II. In conclusion, microarray profiling allows genotyping and detection of clinically relevant staphylococcal genes, and can, in most cases, be used as an important tool to screening virulence and antibiotic resistance genes in MRSA isolates

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudia peixoto bueno.pdf: 2154558 bytes, checksum: e3212e2f2e948a89b381b38c7ab473b7 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / The deterioration of vacuum packed refrigerated meat accompanied by large gas production - a phenomenon called blown pack - is considered a major cause of economic losses of the meat industry in several regions of Brazil and the world. Several psychrophilic and psychrotrophic microorganisms may be involved, especially species of Clostridium. The objective of the present study was to perform the molecular characterization, through the use of the PCR technique, and the molecular isolation by conventional bacteriology, of the main microorganisms that cause blown pack in refrigerated meat from Brazil, New Zealand and the United Kingdom. Thus, typing techniques were used to differentiate the species and subspecies involved in this type of deterioration. Tirty-six samples of Brazilian blown pack meat, 6 samples from the UK and 12 experimental blown pack samples of venison from the North Island of New Zealand were analyzed. Three pairs of primers, the RFP / RRP, the 16SEF/16SER and the pair EISRF / EISRR were used for C. estertheticum estertheticum and Clostridium estertheticum like, and one for C. gasigenes (16DBF/16DBR). The samples with the PCR results were sent to a microbiology laboratory for conventional isolation of Clostridium estertheticum. It was concluded that Clostridium estertheticum estertheticum is responsible for the deterioration of meat and hence the blown pack in the UK. Samples of blown pack Brazilian meat have Clostridium estertheticum like as primary causal agent. The typing was carried out in isolates and strains - donated by Mirinz Center / Ruakura Agresearch / Hamilton / New Zealand - together with two isolates from Brazil, involved in this type of deterioration. The selected techniques AFLP and RFLP - PCR were able to distinguish species and subspecies of psychrophilic and psychrotrophic clostridia. However, the AFLP showed the highest discriminatory power, being able to distinguish 100% of the species - C. estertheticum, C. frigoris, C. bowmani, C. lacusfryxellense and C. psychrophylum - and also the subspecies C. estertheticum estertheticum, C. estertheticum laramiense, C. estertheticum like k21 and k24. Through the technique of RFLP, it was possible to differentiate the species of clostridia psychrotrophic, psichrophilic and also the subspecies C. estertheticum estertheticum and Clostridium estertheticum like, along with the use of four restriction endonucleases - AluI, CfoI, TaqI and HaeIII. The HaeIII provided greater variety of fragments and the ability to differentiate the species of clostridia psychrophilic and psychrotrophic, whereas TaqI was the only enzyme capable of differentiating the subspecies of C. estertheticum estertheticum and C. estertheticum laramiense of C. estertheticum like. The Brazilian samples isolated fit into the group of Clostridium estertheticum like, although there is no confirmation of the absence of Clostridium estertheticum estertheticum in the country. / A deterioração de carnes refrigeradas embaladas a vácuo acompanhada de grande produção de gás - fenômeno denominado tufamento de embalagens - é considerada uma das principais causas de perdas econômicas da indústria cárnea, em várias regiões do Brasil e do mundo. Diversos microrganismos psicrofílicos e psicrotróficos podem estar envolvidos, destacando-se espécies do gênero Clostridium. Objetivou-se com o presente estudo a caracterização molecular, por meio do emprego da técnica de PCR e o isolamento pela bacteriologia convencional, dos principais microrganismos causadores do tufamento de embalagens de carnes refrigeradas procedentes do Brasil, Nova Zelândia e Reino Unido. Para tanto, foram empregadas técnicas de tipagem visando a diferenciação das espécies e subespécies envolvidas neste tipo de deterioração. Foram analisadas 36 amostras tufadas de carnes brasileiras, 6 amostras tufadas oriundas do Reino Unido e 12 amostras experimentais tufadas de carne de cervo provenientes da Ilha Norte da Nova Zelândia. Foram utilizados três pares de primers, o RFP/RRP, o 16SEF/16SER e o par EISRF/EISRR para C. estertheticum estertheticum e Clostridium estertheticum like e um para C. gasigenes (16DBF/16DBR). As amostras com os resultados positivos ao PCR foram enviadas para a microbiologia convencional para isolamento do Clostridium estertheticum. Concluiu-se que o Clostridium estertheticum estertheticum é responsável pela deterioração das carnes e, consequentemente, pelo tufamento das embalagens no Reino Unido. As amostras tufadas de embalagens de carnes brasileiras têm como principal agente causador o Clostridium estertheticum like. A tipagem foi relizada em cepas e isolados doados pelo Mirinz Centre/ Ruakura AgResearch/ Hamilton/NZ - juntamente a dois isolados brasileiros, envolvidos nesse tipo de deterioração . As técnicas eleitas AFLP e RFLP PCR foram capazes de distinguir as espécies e subespécies de clostrídios psicrofílicos e psicrotróficos, porém, o AFLP apresentou maior poder discriminatório, sendo capaz de diferenciar 100% das espécies C. estertheticum, C. frigoris, C. bowmani, C. lacusfryxellense e C psychrophylum - e também as subespécies - Clostridium estertheticum estertheticum, Clostridium estertheticum laramiense, o Clostridium estertheticum like K21 e Clostridium estertheticum like K24. Por meio da técnica de RFLP foi possível diferenciar as espécies do clostrídio psicrofílicos e psicrotróficos e também as subespécies C. estertheticum estertheticum e Clostridium estertheticum like, utilizando em conjunto as quatro endonucleases de restrição AluI, CfoI, TaqI e HaeIII. A HaeIII proporciona maior variedade de fragmentos e capacidade de diferenciar as espécies de clostrídios psicrofílicos e psicrotróficos. Já a TaqI foi a única enzima capaz de diferenciar as subespécies C. estertheticum estertheticum e C. estertheticum laramiense do C. estertheticum like. As amostras brasileiras isoladas se enquadraram no grupo do Clostridium estertheticum like.

The present study aimed to evaluate bacterial isolates and the microbiome of dairies. The specific aims were: to characterize Staphylococcus spp. isolated from mastitic milk, to evaluate the presence of Lactococcus in mastitic milk as a potential causative agent of mastitis, to evaluate the association between microbiome and milk quality parameters, and to characterize Staphylococcus spp. isolated from production lines of Minas Frescal cheese. The detection of genes encoding virulence factors (enterotoxins (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, and selx), hemolysins (hla, hlb, hld, hlg, and hlgv), exfoliative toxins (eta, etb, and etd), Panton-Valentine leukocidin (pvl), and toxic shock syndrome toxin (tst)), genes encoding antibiotic resistance (resistance to tetracycline (tetK, tetL, and tetM), erythromycin (ermA, ermB, and ermC), methicillin (mecA and mecC), and tobramycin (ant(4\')-Ia)), molecular typing (spa, SCCmec, and agr types), and phenotyping regarding antibiotic resistance were performed in staphylococci isolates from mastitic milk, and from cheese processing plant samples. Staphylococcus aureus was identified in the majority of isolates from both origins. Several virulence factor genes were detected. The distribution of genes encoding staphylococcal enterotoxins (85.0% - 85.7% of isolates were positive for one or more enterotoxin gene) was highlighted and the gene related to H toxin was the most prevalent. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus were identified in isolates from mastitic milk (4.1%) and cheese processing (6.0%); the genotyping and phenotyping of these isolates were described. t605 had the highest frequency in the S. aureus population studied. In mastitic milk, Lactococcus was suggested as the causative agent of an outbreak of mastitis in a dairy farm. Using next generation sequencing, the abundance of Lactococcus was observed in microbiome samples. Bacterial isolation and DNA sequencing confirmed the presence of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae. The microbiome of environmental samples and bulk tank milk from the dairy farm showed the Lactococcus genus among the most common bacterial taxa, suggesting other sources of this genus. Regarding milk quality parameters, the microbiome of bulk tank milk from several dairy farms was associated with somatic cell count and bacterial count. The core microbiome was described and many genera of importance were identified. Among the associations performed between microbiome and milk quality parameters, the identification of Streptococcus in samples classified with high somatic cell count and high bacterial count was highlighted. Several bacterial taxa with relative abundance significantly higher in samples classified as high and low cell count and bacterial count were shown. Real-time polymerase chain reaction was also performed associated with bacterial diversity, bacterial taxa, and bacterial count. These findings highlight the need to control and prevent bacterial contamination in the dairy industry, from herd to consumers. / O presente estudo apresentou como objetivo avaliar isolados bacterianos e microbioma de lácteos. Os objetivos específicos foram: caracterizar Staphylococcus spp. isolados de leite de vacas com mastite, avaliar a presença de Lactococcus em leite de vacas com mastite como um potencial agente causador de mastite, avaliar a associação entre microbioma de leite de tanque e parâmetros da qualidade de leite, e caracterizar Staphylococcus spp. isolados de linhas de processamento de queijo Minas frescal. A detecção de genes codificadores de fatores de virulência (enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, e selx), hemolisinas (hla, hlb, hld, hlg, e hlgv), toxinas exfoliativas (eta, etb e etd), leucocidina de Panton-Valentine (pvl), toxina da síndrome do choque tóxico (tst)), genes codificadores de resistência a antibióticos (resistência a tetraciclina (tetK, tetL e tetM), eritromicina (ermA, ermB e ermC), meticilina (mecA e mecC) e tobramicina (ant(4\')-Ia)), tipagem molecular (spa, SCCmec e agr types), e fenotipagem quanto à resistência a antibióticos foram realizadas em estafilococos isolados de leite de vacas com mastite e de amostras de planta de processamento de queijo. Staphylococcus aureus foi identificado na maioria dos isolados de ambas as origens. Diversos genes de fatores de virulência foram detectados, com destaque para a distribuição de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas (85,0%-85,7% dos isolados foram positivos para um ou mais genes codificadores de enterotoxinas), sendo o gene relacionado com a toxina H o mais frequente. Staphylococcus aureus meticilina resistente foram identificados em isolados de leite de vacas com mastite (4.1%) e em processamento de queijo (6.0%); o perfil genotípico e fenotípico destes isolados foram descritos. t605 foi o mais freqüente na população de S. aureus estudada. Em leite de vacas com mastite, Lactococcus foi sugerido como o agente causador de um surto de mastite numa fazenda leiteira. Usando sequenciamento de nova geração, a abundância de Lactococcus foi observada no microbioma das amostras. O isolamento e sequenciamento de DNA confirmaram a presença de Lactococcus lactis e Lactococcus garvieae. O microbioma de amostras ambientais e de leite de tanque da fazenda mostrou o gênero Lactococcus entre os mais comuns, sugerindo outras fontes deste gênero. Contemplando parâmetros da qualidade de leite, o microbioma de leite de tanque de várias fazendas leiteiras foi relacionado com contagem de células somáticas e contagem bacteriana. O core microbiome foi descrito e muitos gêneros bacterianos de importância foram identificados. Dentre as análises realizadas associando microbioma com parâmetros da qualidade de leite, foi destacada a identificação de Streptococcus em amostras classificadas com alta contagem de células somáticas e alta contagem bacteriana. Diversos táxons bacterianos com abundância relativa significativamente maior em amostras classificadas com alta e baixa contagem de células somáticas e contagem bacteriana foram mostrados. Reação em cadeia da polimerase em tempo real também foi realizada e associada com diversidade bacteriana, táxons bacterianos e contagem bacteriana. Estes levantamentos confirmam a necessidade de controlar e prevenir a contaminação bacteriana na indústria de lácteos, do rebanho leiteiro até os consumidores.

O Brasil consolidou-se como o principal produtor e exportador mundial de carne bovina. Estudos microbiológicos, geralmente realizados com amostras de carne coletadas no comércio e não na cadeia produtiva de carne, resultam numa insuficiência de dados a respeito das características fenotípicas e genotípicas das bactérias patogênicas de relevância nos produtos destinados à exportação. Objetivando determinar a prevalência e características de Salmonella spp em carne bovina para exportação, realizou-se a coleta de amostras de superfícies de 200 bovinos adultos, provenientes de 12 fazendas, abatidos em Frigorífico Exportador em São Paulo, Brasil, no ano de 2008. Foram coletadas amostras do couro do animal, logo após a realização da sangria (Co), da carcaça do mesmo animal, após a esfola (Ca I) e da carcaça do mesmo animal, após o toalete e antes da refrigeração (Ca II). O isolamento e a identificação de Salmonella spp foram realizados de acordo com o método - ISO 6579:2002, com algumas modificações. O patógeno foi detectado em 14 amostras de couro (7,0%), 5 de carcaça I (2,5%) e 4 de carcaça II (2,0%). Verificou-se a prevalência do sorovar S. Give (52,0%), seguido de S. Abaetetuba (16,0%), S. Typhimurium (8,0%), S. Agona (4,0%) e S. Dublin (4,0%), e quatro cepas (16,0%) não tipáveis. A tipagem molecular, feita por PFGE, mostrou que as salmonelas expressaram 12 perfis genéticos distintos, sendo 10 formados por apenas uma cepa, cada. As demais cepas (15) pertenceram a dois perfis genéticos apenas, que apresentaram 91,7% de similaridade. De acordo com o teste de infecção de células Caco-2, a maioria das cepas (92,0%) apresentou Eficiência de Invasão inferior a 1,0%, indicando baixo potencial de virulência. Quanto ao perfil de resistência a antibióticos, 68,0% das cepas analisadas foram multiresistentes, apresentando 12 perfis diferentes. Animais diferentes, provenientes de uma mesma fazenda, apresentaram salmonelas de um mesmo sorovar e com o mesmo perfil genético e de resistência a drogas, comprovando a ocorrência de contaminação cruzada durante o processamento da carne bovina. A multiresistência das salmonelas isoladas e a possibilidade de disseminação desses patógenos denotam a necessidade de se adotar medidas de higiene adequadas e maior prudência no emprego de antimicrobianos, na dieta alimentar e na terapêutica veterinária. / Brazil is an important bovine meat producer and exporter. Microbiological surveys are generally run with meat samples collected at retail level and not with meat for export, explaining the lack of data on the phenotypic and genotypic characteristics of pathogens of relevance in exported food products. This study aimed to evaluate the prevalence and characteristics of Salmonella spp in bovine meat destined for export, through surface sampling of hides and carcasses of 200 animals, from 12 farms, slaughtered in 2008 in an export slaughterhouse located in São Paulo, Brazil. Sampling was done from the hides right after bleeding (Co) and from carcasses of the same animal after removal of the hide (Ca I) and after cleaning but before chilling (Ca II). Isolation and identification of Salmonella spp were done according to ISO 6579:2002, with some modifications. The pathogen was detected in 14 samples of hides (7,0%), 5 of carcasses Ca I (2,5%) and 4 of carcasses Ca II (2,0%). The most prevalent serovars were S. Give (52,0%), followed by S. Abaetetuba (16,0%), S. Typhimurium (8,0%), S. Agona (4,0%) and S. Dublin (4,0%). Four isolates (16,0%) were not typable. Molecular typing using PFGE indicated that the isolates presented 12 molecular profiles, ten of them containing one single isolate. Fifteen isolates belonged to only two distinct profiles, with 91.7% similarity. Invasion Efficiency tests, run with Caco-2 cells, indicated that most isolates (92,0%) presented low virulence potential. 68,0% of the isolates were multiresistant to antimicrobial drugs, presenting 12 different resistance profiles. Different animals, coming from the same rearing farm, harbored salmonellae belonging to same serovar and presenting the same genetic and antimicrobial resistance profiles, indicating cross contamination in the slaughterhouse during production of meat. The occurrence of salmonellae that can disseminate in the slaughterhouse and the multiresistance presented by the strains strengthen the need for adoption of proper hygiene control measures and care in the use of antibiotics in human and veterinary therapeutics.

A presente pesquisa teve por objetivo avaliar as fontes de contaminação por Listeria monocytogenes em uma linha de processamento de \"nuggets\" congelados de frango. Linhagens de L. monocytogenes isoladas de diferentes pontos de uma usina de processamento industrial nas diversas etapas do processamento foram avaliadas quanto à sua diversidade genética. A técnica empregada foi o RAPO com metodologia modificada da Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO). Os perfis RAPO gerados com os \"primers\" M13 e UBC155 foram agrupados, combinados e analisados quanto à sua similaridade. As cepas foram também sorotipadas e 189 pertenciam ao sorogrupo 1 e 63 ao sorogrupo 4. A correlação entre a diversidade genética e a distribuição do microrganismo na linha de processamento foi estabelecida. As 252 L. monocytogenes estudadas puderam ser divididas em dois grandes \"clusters\" cada qual dividido em dois grupos. Os resultados da análise de \"clusters\" foram relacionados aos da sorologia, determinando sete subtipos. Verificou-se que três subtipos são introduzidos no ambiente de processamento juntamente com a matériaprima. Um deles foi encontrado somente na matéria-prima e os outros dois também foram detectados em superfícies de equipamentos e no ambiente de processamento. Outros subtipos encontrados em superfícies de equipamentos e no ambiente foram encontrados no produto em etapas subseqüentes. A contaminação da matéria-prima por cepas diferentes daquelas encontradas no ambiente de processamento mostra a sua importância como fonte de contaminação. Formas de controle da presença de L. monocytogenes na matéria-prima devem ser buscadas assim como o controle da contaminação ambiente. / This research was carried out in order to evaluate the sources of Listeria monocytogenes contamination in a frozen chicken nugget processing line. Strains of L. monocytogenes from different origins and isolated from different steps of the processing line were analysed for their genetic diversity. RAPO methodology modified from a WHO protocol was used. The RAPO profiles generated by primers UBC155 and M13 were grouped, combined and the similarities analysed. The strains were also serotyped and 189 belonged to serogroup 1 and 63 to serogroup 4. The correlation between genetic diversity and the strain distribution along the processing line was established. The 252 L. monocytogenes strains analysed were divided in two clusters, each of them containing 2 groups. Seven subtypes could be determined when the results of RAPO and serotyping were combined. It could be established that from the three sub-types of L. monocytogenes that belonged to the raw material, two could establish themselves in the processing line. These sub-types were detected latter in the environmental samples (food contact and non-food contact surfaces). On the other hand, other sub-types found initially in environmental samples were detected in the product in subsequent steps. The introduction of L. monocytogenes into the plant by raw material highlights its importance as a contamination source. Measures must be taken to control the presence of L. monocytogenes in the raw material as well as in the processing environment.