Informe de Seminario para optar al grado de Licenciado en Lengua y Literatura Hispánica mención Literatura

[pt] A presente pesquisa busca analisar transformações na televisão, a partir da inserção de telenovelas inéditas em plataformas de streaming. Para isso, exploramos mudanças, permanências e adaptações que os serviços de vídeo por demanda estão realizando para a projeção do principal formato narrativo brasileiro em outros modelos de exibição e consumo. O estudo também discute as narrativas contemporâneas serializadas, as características clássicas da telenovela no Brasil e sua influência cultural, as transformações na espectatorialidade e no modelo de negócios do audiovisual dentro do contexto hipermidiático. A investigação está ancorada metodologicamente na teoria das mediações proposta por Martín-Barbero e em uma pesquisa de recepção com telespectadores de Todas as flores – segunda novela brasileira do streaming e primeira totalmente produzida para o Globoplay. Esta análise qualitativa de novas práticas de consumo da teledramaturgia nacional busca uma maior compreensão dos caminhos dos conteúdos ficcionais e das experiências participativas diante das transformações tecnológicas que transcendem as fronteiras tanto do formato quanto do dispositivo original. / [en] This research aims to analyze the transformations in television, through the insertion of new telenovelas on streaming platforms. To do so, we explored changes, continuations and adaptations that video on demand services is doing to project the main Brazilian narrative format into other exhibition and consumption models. The study also discusses contemporary serialized narratives, the classic characteristics of telenovelas in Brazil and their cultural influence, the transformations in spectatorship and the audiovisual business model within the hypermedia context. The investigation is methodologically anchored by the map of mediations proposed by Martin-Barbero and in a reception survey with viewers of Todas as Flores – the second Brazilian telenovela on streaming and the first original produced for Globoplay. This analysis of new consumption practices of national television drama seeks a greater understanding of the paths of fictional content and participatory experiences in the face of technological transformations that transcend the boundaries of both the format and the original device.

[ES] La esquizofrenia (SC) es un trastorno del neurodesarrollo que afecta los procesos cognitivos y el comportamiento social. A diferencia de otras neuropatologías, los cerebros de los pacientes con SC no muestran características histológicas evidentes y los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad siguen siendo desconocidos, lo que dificulta mucho su prevención y tratamiento eficaz. Los endofenotipos más consistentes en la SC incluyen la reducción del neuropilo, la conectividad funcional deteriorada entre las áreas corticales y cambios específicos en las conexiones sinápticas. El cuerpo calloso (CC) es el haz más grande de fibras nerviosas cortico-corticales, conectando ambos hemisferios cerebrales, y su desarrollo es un proceso complejo crucial para la formación adecuada de los circuitos corticales. Numerosa evidencia convergente apoya la hipótesis de que el CC se encuentra hipoconectado en pacientes con SC. Está bien establecido que la SC tiene un fuerte componente genético. Un gen clave implicado en el riesgo de SC es neuregulina 1 (NRG1), controlando varios aspectos del desarrollo neuronal. Estudios previos se han centrado principalmente en la señalización de Nrg1 en las interneuronas inhibitorias, descuidando su papel en las neuronas excitatorias. Para comprender el papel de Nrg1 en los circuitos corticales, en este trabajo estudiamos el papel de Nrg1 en el desarrollo de los axones del cuerpo calloso y específicamente, su función celular autónoma en las neuronas excitatorias. Para este objetivo quisimos, 1) evaluar la participación de la Nrg1 en el desarrollo de las neuronas de proyección callosa; 2) investigar el efecto autónomo de Nrg1 en el desarrollo de las neuritas; 3) estudiar los mecanismos moleculares subyacentes al papel de Nrg1 en el desarrollo neuronal; 4) explorar el potencial de Nrg1 en la reprogramación de astrocitos a neuronas, como un nuevo posible enfoque terapéutico después de una lesión cerebral. Para ello, primero desarrollamos un modelo in vivo de pérdida de función para determinar el papel de Nrg1 en el desarrollo de las proyecciones callosas.Descubrimos que la eliminación de Nrg1 en el modelo de ratón condicional impedía el desarrollo de axones callosos in vivo. A nivel mecanístico, encontramos que la señalización intracelular de Nrg1 es tanto necesaria como suficiente para promover el desarrollo axonal en las neuronas corticales in vivo. En segundo lugar, para determinar específicamente el papel de Nrg1 en el desarrollo axonal de las neuronas excitatorias, empleamos un modelo in vitro con un enfoque más reduccionista. Realizamos cultivos primarios de neuronas corticales. En este modelo, llevamos a cabo experimentos de ganancia y pérdida de función para investigar específicamente el efecto autónomo celular de Nrg1 sobre el desarrollo de dendritas y axones. Nuestros experimentos con cultivos primarios de neuronas confirmaron que la señalización intracelular de Nrg1 es necesaria y suficiente para promover el crecimiento axonal in vitro. En tercer lugar, estudiamos los mecanismos moleculares subyacentes al papel de Nrg1 en el desarrollo neuronal. Descubrimos mediante Western blot e inmunofluorescencia que la expresión de la proteína GAP43 está altamente disminuida en neuronas knockout para Nrg1. Además, observamos que disminución del desarrollo axonal en neuronas knockout para Nrg1 es parcialmente rescatado al sobreexpresar la proteína GAP43. Estos resultados sugieren que la señalización a través de GAP43 podría ser uno de los mecanismos involucrados en el papel de Nrg1 en el crecimiento axonal. En conjunto, nuestro estudio indica un papel crucial para la señalización intracelular de Nrg1 en el desarrollo de las conexiones cortico-corticales que conectan ambos hemisferios cerebrales. Nuestros resultados sugieren que la disfunción de Nrg1 en las neuronas excitatorias puede contribuir a la hipoconectividad asociada a la SC y las alteraciones del desarrollo neurológico. / [CA] L'esquizofrènia (SC) és un trastorn del neurodesenvolupament que afecta els processos cognitius i el comportament social. A diferència d'altres neuropatologies, els cervells dels pacients amb SC no mostren característiques histològiques evidents i els mecanismes moleculars subjacents a la malaltia continuen sent desconeguts, la qual cosa dificulta molt la seua prevenció i tractament eficaç. Els endofenotipus més consistents en la SC inclouen la reducció del neuropil, la connectivitat funcional deteriorada entre les àrees corticals i els canvis específics en les connexions sinàptiques. El cos callós (CC) és el feix més gran de fibres nervioses cortico-corticals, connecta tots dos hemisferis cerebrals, i el seu desenvolupament és un procés complex crucial per a la formació adequada dels circuits corticals. Nombrosa evidència convergent dona suport a la hipòtesi que el CC es troba hipoconnectat en pacients amb SC. Està ben establit que la SC té un fort component genètic. Un gen clau implicat en el risc de SC és neuregulina 1 (NRG1) que controla diversos aspectes del desenvolupament neuronal. Estudis previs s'han centrat principalment en la senyalització de Nrg1 en les interneurones inhibitòries, descurant el seu paper en les neurones excitatòries. Per a comprendre el paper de Nrg1 en els circuits corticals, en este treball estudiem el paper de Nrg1 en el desenvolupament dels axons del cos callós i específicament, la seua funció cel·lular autònoma en les neurones excitatòries. Per a este objectiu, 1) avaluem la participació de Nrg1 en el desenvolupament de les neurones de projecció callosa; 2) investiguem l'efecte autònom de Nrg1 en el desenvolupament de les neurites; 3) estudiem els mecanismes moleculars subjacents al paper de Nrg1 en el desenvolupament neuronal; 4) explorem el potencial de Nrg1 en la reprogramació d'astròcits a neurones, com un nou possible enfocament terapèutic després d'una lesió cerebral. Per això, emprem ratolins knockout nounats per a Nrg1 i realitzem un rastreig neuronal de les projeccions calloses, així com també rastregem estes projeccions en ratolins wild-type mitjançant la tècnica d'electroporació in utero. Descobrim que l'eliminació de Nrg1 en el model de ratolí condicional impedia el desenvolupament d'axons callosos in vivo. A nivell mecanístic, trobem que la senyalització intracel·lular de Nrg1 era suficient per a promoure el desenvolupament axonal en les neurones corticals in vivo. En segon lloc, per a determinar específicament el paper de Nrg1 en el desenvolupament axonal de les neurones excitatòries, emprem cultius primaris de neurones corticals. En este model, duem a terme experiments de guany i pèrdua de funció per a investigar específicament l'efecte autònom cel·lular de Nrg1 sobre el desenvolupament de dendrites i axons. Els nostres experiments amb cultius primaris de neurones van mostrar que la senyalització intracel·lular de Nrg1 és necessària i suficient per a promoure el creixement axonal in vitro. En tercer lloc, estudiem els mecanismes moleculars subjacents al paper de Nrg1 en el desenvolupament neuronal. Descobrim que l'expressió de la proteïna GAP43 està altament disminuïda en neurones knockout per a Nrg1. A més, observem que la disminució del desenvolupament axonal en neurones knockout per a Nrg1 és parcialment rescatat al sobreexpresar la proteïna GAP43. Estos resultats suggerixen que la senyalització a través de GAP43 podria ser un dels mecanismes involucrats en el paper de Nrg1 en el creixement axonal. En conjunt, el nostre estudi indica un paper crucial per a la senyalització intracellular de Nrg1 en el desenvolupament de les connexions cortico-corticals que connecten tots dos hemisferis cerebrals. Els nostres resultats assenyalen que la disfunció de Nrg1 en les neurones excitatòries pot contribuir a la hipoconnectivitat associada a la SC i a les alteracions del desenvolupament neurològic. / [EN] Schizophrenia (SZ) is a neurodevelopmental disorder that affects cognitive processes and social behavior, impacts approximately 1% of the population but presents a major socio-economic impact. Unlike other neuropathologies, the brains of SZ patients do not display obvious histological hallmarks and their molecular mechanisms remain unknown, making it very difficult to prevent and treat effectively. The most consistent endophenotypes in SZ include reduced neuropil, impaired functional connectivity between cortical areas and specific changes in synaptic connections. Therefore, SZ is a pathology based on abnormal cortical neuronal connectivity. The corpus callosum (CC), connecting the brain's hemispheres, is the largest bundle of cortico-cortical nerve fibers and its development is a complex process crucial for proper cortical circuitry formation. Converging evidence supports the hypothesis that the CC is hypoconnected in SZ patients. While the developmental etiology of SZ remains largely unresolved, it is well established that SZ has a strong genetic component. A key gene implicated in SZ risk is neuregulin 1 (NRG1), which controls several aspects of neuronal development. Prior research has primarily focused on Nrg1 signaling in inhibitory interneurons, neglecting its role in excitatory neurons. To understand the function of Nrg1 signaling in the development of cortical circuits, we studied the Nrg1's role in the development of callosal axons and specifically, the cell autonomous function in the excitatory neurons. To this aim, we sought to 1) evaluate the Nrg1's involvement in the development of callosal projecting neurons; 2) investigate the Nrg1's cell autonomous effect on neurites outgrowth; 3) study the molecular mechanisms underlying Nrg1's role in neuron development; 4) explore the Nrg1's potential in reprogramming astrocytes to neurons, as a novel therapeutic approach following brain injury. First, we developed an in vivo loss-of-function model to determine the role of Nrg1 in the development of callosal projections. We employed newborn Nrg1 knockout mice and performed neuronal tracing of the callosal projections, as well as we traced those projections in wild type mice by in utero electroporation. We found that the deletion of Nrg1 in a conditional mouse model impaired the development of callosal axons in vivo. On a mechanistic level, we found that the intracellular signaling of Nrg1 was sufficient to promote axonal development in cortical neurons in vivo. Second, to specifically determine the role of Nrg1 in axonal development of excitatory neurons, we employed a suitable in vitro model with a more reductionist approach. We performed primary cultures of cortical neurons. Using transfection by electroporation, we achieved sparse labeling and obtained internal controls. In this model, we carried out gain- and loss-of-function approaches to investigate specifically the Nrg1's cell autonomous effect on dendrites and axonal development. Our single-cell experiments in primary cultures showed that Nrg1 is cell-autonomously required and sufficient to promote axonal outgrowth in vitro. Third, we studied the molecular mechanisms underlying Nrg1's role in neuron development. We found by Western blot and immunofluorescence that the GAP43 protein expression is impaired in Nrg1 knockout neurons. Additionally, we observed that decreased axonal development in Nrg1 knockout neurons was rescued by overexpressing GAP43 protein. These results suggest that signaling through GAP43 may be one of the mechanisms involved in the role of Nrg1 in axonal growth. In conclusion, our study indicates a crucial role for Nrg1 intracellular signaling in the development of long-range cortico-cortical connections between brain hemispheres. It indicates that Nrg1 dysfunction in excitatory neurons may contribute to SZ-associated hypoconnectivity and neurodevelopmental alterations, providing new insights into the role of Nrg1 in the etiology of SZ. / Rodríguez Prieto, Á. (2024). Nrg1 Signaling in the Development of Cortical Circuits: Molecular Basis of Schizophrenia [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/212464

Tesis por compendio / [ES] La detección y diagnóstico de resistencias en Mycobacterium tuberculosis (MTB) supone un reto para el control de la tuberculosis (TB). La técnica diagnóstica implica el cultivo de muestras diagnósticas, pero este proceso es lento y retrasa los resultados hasta meses demorando la prescripción del tratamiento óptimo. El cultivo también se utiliza para enriquecer muestras diagnósticas con fines de investigación, como la secuenciación del genoma de MTB. Sin embargo, se desconoce si cultivar reduce la diversidad genética de la muestra diagnóstica, sesgando los resultados. Actualmente, las técnicas moleculares permiten evitar el cultivo en el diagnóstico, detectando resistencia a antibióticos más rápidamente, pero se limitan a identificar las mutaciones comunes asociadas a la resistencia a la rifampicina (RIF) e isoniazida (INH), los fármacos de primera línea. No obstante, la composición compleja de las muestras diagnósticas como el esputo sigue siendo un desafío para la secuenciación. Esta tesis presenta técnicas y estrategias de secuenciación para recuperar MTB a partir de esputos, centrándose en la diversidad genética en esputos y cultivos y explorando el potencial de la secuenciación para determinar resistencias. En el Capítulo 1 comparamos la diversidad genética entre pares de esputos y cultivos en dos entornos diferentes. Desarrollamos una técnica de secuenciación de esputos, realizando una secuenciación directa o enriquecida según la cantidad de MTB presente. Además, implementamos un flujo de análisis para descartar artefactos del procesamiento de muestras. Los resultados muestran una alta concordancia en la diversidad entre esputos y cultivos, cuestionando la hipótesis inicial del cuello de botella en el cultivo. En el Capítulo 2 exploramos las limitaciones del Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) para identificar mutaciones de resistencia a RIF, examinando las mutaciones de resistencia más prevalentes en el sur de Mozambique. Utilizamos la secuenciación del genoma completo para identificar variantes de resistencia en cepas recolectadas en Manhiça, Mozambique. Detectamos dos cepas con mutaciones de resistencia a RIF no identificadas por el XpertUltra y una alta prevalencia de cepas resistentes a INH sin resistencia a RIF (no multirresistentes, MDR). Los resultados sugieren que el XpertUltra podría no detectar algunos casos de resistencia a RIF y/o INH, destacando la necesidad de incluir nuevas mutaciones en las pruebas moleculares. En el Capítulo 3 evaluamos el potencial de la secuenciación de amplicones para predecir la resistencia a antibióticos e identificar el linaje de las cepas. Diseñamos un panel de nueve genes asociados a la resistencia a siete antibióticos y dos regiones filogenéticas, poniendo a punto una PCR multiplex para amplificar todas las regiones en una sola reacción. A diferencia de otros paneles, los cebadores diseñados cubren los genes completos para detectar todas las mutaciones presentes. La secuenciación se realiza con MinION (Nanopore), una plataforma portátil con análisis en tiempo real. Comparamos las variantes obtenidas con las de Illumina para calibrar los parámetros del llamado de variantes y evitar falsos positivos. Los resultados muestran una alta correlación entre MinION e Illumina en la detección de resistencia e identificación de linajes, independientemente del tipo de muestra. Estos resultados, junto con el análisis en tiempo real de MinION, son prometedores para su implementación en atención primaria. En conclusión, esta tesis contribuye a los avances en la genómica de muestras diagnósticas. Por un lado, demostrando que el cultivo refleja la diversidad genética del esputo, y por otro, revelando el potencial de la secuenciación del genoma y de amplicones para predecir resistencia a antibióticos. Las técnicas y resultados que se presentan contribuirán a promover la secuenciación directa de esputo como técnica de diagnóstico rápida y precisa, pero también su uso para la investigación. / [CA] La detecció i diagnòstic de resistències en Mycobacterium tuberculosis (MTB) suposa un repte per al control de la tuberculosi (TB). La tècnica de referència ha estat el cultiu de mostres diagnòstiques, però aquest procés és lent, retardant els resultats durant setmanes o mesos i dificultant la prescripció d'un tractament òptim. El cultiu també s'ha utilitzat per enriquir mostres diagnòstiques amb finalitats de recerca, com la seqüenciació del genoma de MTB. No obstant això, encara es desconeix si el cultiu redueix la diversitat genètica de la mostra diagnòstica, cosa que podria generar un biaix en els resultats. Actualment, les tècniques moleculars han permès evitar el cultiu en el diagnòstic, detectant resistència a antibiòtics més ràpidament, però es limiten a identificar les mutacions comunes associades a resistència a la rifampicina (RIF) i isoniazida (INH), els fàrmacs de primera línia. Tanmateix, la composició complexa de les mostres diagnòstiques com l'esput segueix sent un repte per a la seqüenciació. Aquesta tesi presenta tècniques i estratègies de seqüenciació per recuperar MTB a partir d'esputs, centrant-se en la diversitat genètica en esputs i cultius i explorant el potencial de la seqüenciació per determinar resistències. Al Capítol 1 comparem la diversitat genètica entre parelles d'esputs i cultius en dos entorns diferents. Desenvolupem una tècnica de seqüenciació d'esputs, realitzant una seqüenciació directa o enriquida segons la quantitat de MTB present. A més, implementem un flux d'anàlisi per descartar artefactes del processament de mostres. Els resultats mostren una alta concordança en la diversitat entre esputs i cultius, qüestionant la hipòtesi inicial d'un coll de botella al cultiu. Al Capítol 2 explorem les limitacions de la prova molecular Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) per identificar mutacions de resistència a RIF, examinant les mutacions de resistència més prevalents al sud de Moçambic. Utilitzem la seqüenciació del genoma complet per identificar variants de resistència a antibiòtics en soques recol·lectades a Manhiça, Moçambic. Detectem dues soques amb mutacions de resistència a rifampicina no identificades per l'XpertUltra i una alta prevalença de soques resistents a INH sense resistència a RIF (no multiressistents, MDR). Els resultats sugereixen que l'XpertUltra pot no detectar alguns casos de resistència a RIF i/o INH, destacant la necessitat d'incloure noves mutacions en proves moleculars. Al Capítol 3 avaluem el potencial de la seqüenciació d'amplicons per predir resistència a antibiòtics i identificar el llinatge de les soques. Dissenyem un panell de nou gens associats a resistència a set antibiòtics i dues regions filogenètiques, posant a punt una PCR multiplex per amplificar totes les regions en una sola reacció. A diferència d'altres panells, els encebadors dissenyats cobreixen els gens complets, per detectar totes les mutacions presents. La seqüenciació es realitza amb MinION (Nanopore), una plataforma portàtil amb anàlisi en temps real. Comparem les variants obtingudes amb les d'Illumina per calibrar paràmetres per cridar de variants i evitar falsos positius. Els resultats mostren una alta correlació entre MinION i Illumina en la detecció de resistència i identificació de llinatges, independentment del tipus de mostra. Aquests resultats, juntament amb l'anàlisi en temps real de MinION, són prometedors per a la seva implementació en atenció primària. En conclusió, aquesta tesi contribueix als avanços en la genòmica directa de mostra diagnòstica. D'una banda, demostrant que el cultiu reflecteix la diversitat genètica de l'esput i, d'altra banda, revelant el potencial de la seqüenciació del genoma i d'amplicons per predir resistència a antibiòtics. Els resultats obtinguts superen les limitacions de les proves moleculars actuals, i les tècniques presentades podrien promoure la seqüenciació directa d'esput com a eina de diagnòstic ràpida i precisa, així com per a la investigació. / [EN] Mycobacterium tuberculosis (MTB) detection and diagnosis of drug resistance(DR) have been a challenge for tuberculosis(TB) control. Culturing mycobacteria from diagnostic samples has been the most commonly used diagnostic technique. However, culturing depends on MTB's slow growth, delaying results and the prescription of optimal treatment for weeks to months. Culture is also essential for research purposes such as MTB genomics. However, it remains unclear whether it causes a bottleneck in the sample's original genetic diversity, potentially biasing results. Skipping the culturing step has been possible with the introduction of molecular techniques in surveillance systems. These reduce turnaround time and allow MTB and DR detection through a single assay. However, such tests are limited to detecting common mutations associated with rifampicin(RIF) and isoniazid(INH) resistance. Moreover, the complex composition of diagnostic samples, like sputum, continues to challenge sequencing workflows in research. In this thesis, we explore different sequencing approaches to recover and sequence MTB from sputum samples, focusing on overcoming the hypothesized culture bottleneck and evaluating the potential of sequencing for DR prediction. In Chapter 1, we compare genetic diversity within sputum-culture paired samples in two settings. We implement a culture-free sequencing (cfWGS) approach for sputum, using both direct and enriched sequencing, depending on the initial amount of MTB DNA. We also develop an analysis pipeline to filter artifactual variants from cfWGS approaches. To generalize results, three additional datasets are reanalyzed. The results show high concordance in genetic diversity between sputum-culture pairs, both in terms of presence and frequency of variants. These results contradict the initial culture bottleneck assumption, emphasizing the importance of tailored filtering steps depending on sample complexity. In Chapter 2, we explore the limitations of the Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) for detecting non-common mutations and screen for prevalent DR mutations in southern Mozambique. We use WGS to identify DR variants in strains collected in Manhiça (Mozambique) during two time periods. Two strains were found to harbor RIF resistance mutations beyond XpertUltra's detection scope. We also detect a high prevalence of INH-resistant strains without RIF resistance (non-MDR TB). This suggests that XpertUltra, the primary diagnostic tool in the region, sometimes misclassifies RIF-resistant cases, highlighting the need for expanded drug and mutation coverage in molecular diagnostic tests. In Chapter 3, we assess the potential of targeted sequencing for DR prediction and lineage identification by designing a gene panel of 9 genes associated with resistance to 7 drugs and two phylogenetic regions. We develop a multiplex PCR to amplify all target regions in one reaction. Unlike other commercial panels, our primers cover entire genes allowing the identification of all mutations, not just those in hotspot regions. We employ the portable MinION (Nanopore) platform, which provides real-time analysis. A key aim is to calibrate parameters for MinION variant calling by comparing its results to Illumina sequencing, establishing a frequency cut-off to avoid false positives due to MinION's error rate. Our results show high concordance between MinION and Illumina in detecting DR and genotyping, regardless of the sample type. These findings present a significant advantage for future implementation in point-of-care systems. This thesis advances the field of cfWGS by confirming that culture mirrors sputum's genetic diversity and demonstrating the potential of whole genome and targeted sequencing to overcome the limitations of current molecular diagnostic tests in predicting DR. The techniques and findings presented could help promote cfWGS as a front-line approach for faster, more accurate diagnosis, and contribute to further research. / This work has been supported by the following: European Research Council (ERC): H2020-ERC-COG/0800; Ministerio Español de Ciencia e Innovación: PID2022-137607OB-I00; Fundació La Caixa: HR21-00415, International Science and Technology Center (ISTC): Project #G-2143 and National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH). This work was also supported by STOP TB partnership [STBP/TBREACH/GSA/W5-30: CA-3-D000920001], the TB Portals programme of the National Institutes of Health, the European Research Council [101001038-TB-RECONNECT: H2020-ERC-COG/0800 and 638553-TB-ACCELERATE], Generalitat Valenciana [AICO/2018/113], the Spanish Ministry of Science and Innovation [PID2019-104477RB-I00] and the Ministerio de Economía, Indústria y Competividad (SAF2016-77346-R) / Mariner Llicer, C. (2024). Culture-Free Sequencing of Mycobacterium Tuberculosis for Diagnosis and Genetic Diversity Identification [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/213332 / Compendio

[ES] La tesis doctoral titulada "NMR-based metabolomics for the identification of biomarkers of disease" explora el potencial de la metabolómica mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) para la identificación de biomarcadores de enfermedades, permitiendo un diagnóstico temprano y no invasivo, así como el seguimiento de pacientes. El estudio se centra en cuatro enfermedades: Alzheimer, glaucoma, aterosclerosis y vulnerabilidad de placa, y fibrosis pulmonar tras neumonía por COVID-19. En la introducción, se describe el proceso de análisis metabolómico para la identificación de biomarcadores y las principales plataformas y herramientas estadísticas utilizadas en el análisis mediante RMN. Se destacan las características fisiopatológicas de las enfermedades estudiadas, las formas actuales de diagnóstico y la necesidad de nuevos marcadores. El primer capítulo aborda la identificación de biomarcadores para el Alzheimer y la progresión de deterioro cognitivo leve (MCI) a Alzheimer mediante análisis de suero. Se desarrollaron modelos de clasificación que discriminaron entre Alzheimer, MCI y controles sanos. La investigación encontró que ciertos metabolitos, como lisina, piruvato y colina, presentan concentraciones distintas según la evolución del MCI. El segundo capítulo estudia las diferencias metabolómicas entre MCI y controles mediante análisis de plasma, combinando RMN y marcadores de peroxidación lipídica detectados con UPLC-MS/MS. La combinación de ambas técnicas mejoró la identificación de biomarcadores, destacando metabolitos como isoleucina, valina y glutamato. El tercer capítulo analiza lágrimas de pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto (POAG) para identificar biomarcadores en un medio mínimamente invasivo. Se identificaron metabolitos como taurina, glicina y glucosa como potenciales biomarcadores. En el cuarto capítulo se estudian placas de ateroma y suero de pacientes con estenosis de carótida para identificar biomarcadores de vulnerabilidad de placa. En placa, se identificaron mio-inositol y glutamato como potenciales biomarcadores. En suero, se destacaron treonina, histamina y ácidos grasos insaturados. El quinto capítulo se enfoca en pacientes que desarrollaron fibrosis pulmonar tras neumonía por COVID-19, identificando biomarcadores en suero que permiten predecir la fibrosis, destacando glucosa, valina y ácidos grasos. Finalmente, se presenta la discusión y las conclusiones generales, subrayando la relevancia de la metabolómica mediante RMN para identificar biomarcadores tempranos y no invasivos, lo que podría cubrir una necesidad crítica en la medicina actual. / [CA] La tesi doctoral titulada "Metabolòmica basada en RMN per a la identificació de biomarcadors de malaltia" explora el potencial de la metabolòmica mitjançant espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) per a la identificació de biomarcadors de malalties, permetent un diagnòstic precoç i no invasiu, així com el seguiment de pacients. L'estudi se centra en quatre malalties: Alzheimer, glaucoma, aterosclerosi i vulnerabilitat de placa, i fibrosi pulmonar després de pneumònia per COVID-19. A la introducció, es descriu el procés d'anàlisi metabolòmic per a la identificació de biomarcadors i les principals plataformes i eines estadístiques utilitzades en l'anàlisi mitjançant RMN. Es destaquen les característiques fisiopatològiques de les malalties estudiades, les formes actuals de diagnòstic i la necessitat de nous marcadors. El primer capítol tracta sobre la identificació de biomarcadors per a l'Alzheimer i la progressió de deteriorament cognitiu lleu (MCI) a Alzheimer mitjançant anàlisi de sèrum. Es van desenvolupar models de classificació que van discriminar entre Alzheimer, MCI i controls sans. La investigació va trobar que certs metabòlits, com lisina, piruvat i colina, presenten concentracions diferents segons l'evolució del MCI. El segon capítol estudia les diferències metabolòmiques entre MCI i controls mitjançant anàlisi de plasma, combinant RMN i marcadors de peroxidació lipídica detectats amb UPLC-MS/MS. La combinació d'ambdues tècniques va millorar la identificació de biomarcadors, destacant metabòlits com isoleucina, valina i glutamat. El tercer capítol analitza llàgrimes de pacients amb glaucoma primari d'angle obert (POAG) per a identificar biomarcadors en un medi mínimament invasiu. Es van identificar metabòlits com taurina, glicina i glucosa com a potencials biomarcadors. En el quart capítol s'estudien plaques d'ateroma i sèrum de pacients amb estenosi de caròtida per a identificar biomarcadors de vulnerabilitat de placa. En placa, es van identificar mio-inositol i glutamat com a potencials biomarcadors. En sèrum, es van destacar treonina, histamina i àcids grassos insaturats. El cinqué capítol se centra en pacients que van desenvolupar fibrosi pulmonar després de pneumònia per COVID-19, identificant biomarcadors en sèrum que permeten predir la fibrosi, destacant glucosa, valina i àcids grassos. Finalment, es presenten les conclusions generals, subratllant la rellevància de la metabolòmica mitjançant RMN per a identificar biomarcadors precoços i no invasius, la qual cosa podria cobrir una necessitat crítica en la medicina actual. / [EN] The doctoral thesis titled "NMR-based metabolomics for the identification of biomarkers of disease" explores the potential of metabolomics through nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy for the identification of disease biomarkers, enabling early and non-invasive diagnosis, as well as patient monitoring. The study focuses on four diseases: Alzheimer's, glaucoma, atherosclerosis and plaque vulnerability, and pulmonary fibrosis after COVID-19 pneumonia. The introduction describes the metabolomic analysis process for biomarker identification and the main platforms and statistical tools used in NMR-based analysis. The study highlights the pathophysiological characteristics of the diseases studied, current diagnostic methods, and the need for new biomarkers. The first chapter addresses the identification of biomarkers for Alzheimer's disease and the progression of mild cognitive impairment (MCI) to Alzheimer's using serum analysis. Classification models were developed to distinguish between Alzheimer's, MCI, and healthy controls. The research found that certain metabolites, such as lysine, pyruvate, and choline, show different concentrations depending on the evolution of MCI. The second chapter studies metabolomic differences between MCI and controls using plasma analysis, combining NMR and lipid peroxidation markers detected by UPLC-MS/MS. The combination of both techniques improved biomarker identification, highlighting metabolites such as isoleucine, valine, and glutamate. The third chapter analyzes tears from patients with primary open-angle glaucoma (POAG) to identify biomarkers in a minimally invasive medium. Metabolites such as taurine, glycine, and glucose were identified as potential biomarkers. In the fourth chapter, atheroma plaques and serum from patients with carotid stenosis were studied to identify biomarkers of plaque vulnerability. In plaques, myo-inositol and glutamate were identified as potential biomarkers. In serum, threonine, histamine, and unsaturated fatty acids were highlighted. The fifth chapter focuses on patients who developed pulmonary fibrosis after COVID-19 pneumonia, identifying serum biomarkers that can predict fibrosis, with glucose, valine, and fatty acids being prominent. Finally, the general discussion and conclusions are presented, emphasizing the relevance of NMR-based metabolomics in identifying early and non-invasive biomarkers, potentially addressing a critical need in modern medicine. / Botello Marabotto, MD. (2024). NMR-Based Metabolomics for the Identification of Biomarkers of Disease [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/211472

[ES] Los sistemas CRISPR-Cas se basan en un mecanismo del sistema inmune adaptativo que se encuentra en bacterias y arqueas. Funcionan utilizando endonucleasas guiadas por ARN (proteínas Cas) para localizar y reconocer secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los sistemas CRISPR-Cas son revolucionarios en el campo de la ingeniería genética, permitiendo la edición específica del genoma, ensayos de regulación genética y, desarrolladas en los últimos años, aplicaciones de diagnóstico. Los métodos de detección de ácidos nucleicos son la técnica de diagnóstico de referencia en la clínica debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, de cara al futuro, debemos desarrollar métodos versátiles de detección de virus que permitan diagnósticos rápidos y fiables, que superen las limitaciones de las técnicas actuales y puedan usarse fácilmente fuera del laboratorio para aplicaciones en puntos de atención (POC). Los sistemas CRISPR-Cas se han reconvertido en herramientas de diagnóstico de ácidos nucleicos gracias a la capacidad de algunas proteínas Cas de realizar cortes colaterales no específicos al reconocer su diana. Nuestro objetivo es ampliar el conjunto de herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas mediante el desarrollo de una nueva estrategia de detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas9, cuyo modo de acción se basa en el desplazamiento de hebra en lugar de en la catálisis colateral. Demostramos que los amplicones de ADN del SARS-CoV-2 generados a partir de muestras de pacientes pueden detectarse con CRISPR-Cas9. También demostramos la capacidad de realizar la detección simultánea de diferentes amplicones de ADN con la misma nucleasa, ya sea para identificar diferentes regiones de SARS-CoV-2 o diferentes virus respiratorios. Para avanzar hacia aplicaciones POC, acoplamos el paso de preamplificación isotérmica con oligos biotinilados para producir amplicones marcados. Cuando se combina con CRISPR-Cas9 y sondas marcadas con FAM, esto permite la visualización colorimétrica de la detección mediante ensayos de flujo lateral (LFA) en tiras disponibles en el mercado. La lectura colorimétrica permite la interpretación de los resultados a simple vista, superando la necesidad de un fluorímetro. Detectamos con éxito SARS-CoV-2 a partir de muestras de pacientes en la configuración LFA, y cuando se combinó con RT-RPA multiplexado, se logró la detección de dos regiones distintas del virus en una sola prueba. Además, la ausencia de actividad colateral en nuestra metodología permite el procesamiento de secuencias posteriores adicionales. Por lo tanto, también pretendemos explorar la capacidad de integración de señales de nuestro método de detección basado en CRISPR-Cas9. Demostramos que diseños de circuitos lógicos de ADN pueden procesar diferentes señales de SARS-CoV-2 detectadas por los complejos CRISPR. También nos propusimos mejorar nuestro sistema CRISPR-Cas9 para detectar tanto proteínas como ácidos nucleicos. Nos propusimos diseñar un ARN guía condicional que respondiera a la presencia de la proteína spike del SARS-CoV-2. Para ello, insertamos un aptámero en el ARN guía para bloquear la actividad de Cas9 en ausencia de la proteína. En presencia de la proteína spike, la interacción aptámero-proteína hace que el motivo de bloqueo sufra un cambio conformacional, liberando el ARN guía y activando Cas9. Aunque logramos con éxito el escenario de bloqueo utilizando las secuencias reguladoras, es necesario seguir trabajando para identificar una secuencia que pueda inducir el cambio conformacional específico necesario para restaurar la actividad de Cas9 en presencia de la proteína spike. En conjunto, esta plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas9 permite una detección multiplexada en un solo tubo, complementando los métodos existentes basados en CRISPR, y ofreciendo un sistema extensible para aplicaciones en diagnóstico en el punto de atención y biocomputación. / [CA] Els sistemes CRISPR-Cas es basen en un mecanisme del sistema immunitari adaptatiu que es troba en bacteris i arqueus. Funcionen utilitzant endonucleases guiades per ARN (proteïnes Cas) per tal de dirigir-se i reconéixer seqüències específiques d'àcids nucleics. Els sistemes CRISPR-Cas siguen revolucionaris en el camp de l'enginyeria genètica, permetent l'edició específica del genoma, assajos de regulació gènica i, desenvolupades en els darrers anys, aplicacions de diagnòstic. Els mètodes de detecció d'àcids nucleics són la tècnica de diagnòstic de referència a la clínica degut a la seua alta sensibilitat i especificitat. No obstant, de cara al futur, hem de desenvolupar mètodes versàtils de detecció de virus que permeten diagnòstics ràpids i fiables, que superen les limitacions de les tècniques actuals i puguen utilitzar-se fàcilment fora del laboratori per a aplicacions en punts d'atenció (POC). Els sistemes CRISPR-Cas han estat reorientats com a eines de diagnòstic d'àcids nucleics, fet possible per la capacitat d'algunes proteïnes Cas de realitzar un tall col·lateral no específic en reconèixer un objectiu. El nostre objectiu és ampliar el conjunt d'eines de diagnòstic CRISPR-Cas desenvolupant una nova estratègia de detecció d'àcids nucleics basada en CRISPR-Cas9, el mode d'acció del qual es basa en el desplaçament de cadena en lloc de la catàlisi col·lateral. Mostrem que es poden detectar amplicons de DNA de SARS-CoV-2 generats a partir de mostres de pacients amb CRISPR-Cas9. També demostrem la capacitat de realitzar la detecció simultània de diferents amplicons de DNA amb la mateixa nucleasa, ja siga per identificar diferents regions de SARS-CoV-2 o diferents virus respiratoris. Per avançar cap a aplicacions de punt d'atenció (POC), vam combinar el pas de preamplificació isotèrmica amb oligos biotinilats per produir amplicons etiquetats. Quan es combinen amb l'orientació CRISPR-Cas9 i sondes etiquetades amb FAM, això permet la visualització colorimètrica de la detecció mitjançant assajos de flux lateral (LFA) en tires comercials disponibles. La lectura colorimètrica permet la interpretació dels resultats a simple vista, superant la necessitat d'un fluorímetre. Vam detectar amb èxit el SARS-CoV-2 a partir de mostres de pacients en el sistema LFA, i quan es va combinar amb RT-RPA multiplexada, es va aconseguir la detecció de dues regions diferents del virus en una sola prova. A més, l'absència d'activitat col·lateral en la nostra metodologia permet el processament de seqüències addicionals. Per tant, també ens proposem explorar la capacitat d'integració de senyals del nostre mètode de detecció basat en CRISPR-Cas9. Demostrem que els circuits lògics d'ADN dissenyats poden processar diferents senyals de SARS-CoV-2 detectats pels complexos CRISPR. També vam intentar millorar el nostre sistema CRISPR-Cas9 per detectar tant proteïnes com àcids nucleics. Ens vam proposar dissenyar un ARN guia condicional que respon a la presència de la proteïna spike del SARS-CoV-2. Per aconseguir-ho, vam inserir una seqüència d'aptàmer dins de l'ARN guia per bloquejar l'activitat de Cas9 en absència de la proteïna. En presència de la proteïna spike, la interacció aptàmer-proteïna fa que el motiu de bloqueig experimente un canvi conformacional, alliberant l'ARN guia i activant Cas9. Tot i que vam aconseguir amb èxit el bloqueig utilitzant les seqüències reguladores, es necessita més treball per identificar una seqüència que puga induir el canvi conformacional específic necessari per restaurar l'activitat de Cas9 en presència de la proteïna spike. Col·lectivament, aquesta plataforma de diagnòstic CRISPR-Cas9 permet una detecció multiplexada en un sol tub, complementant els mètodes existents basats en CRISPR i oferint un sistema extensible per a aplicacions en diagnòstics de punt d'atenció i biocomputació. / [EN] CRISPR-Cas systems are based on an adaptive immune system mechanism found in bacteria and archaea. They function using RNA-guided endonucleases (Cas proteins), to target and recognize specific nucleic acid sequences. CRISPR-Cas systems are revolutionary in the field of genetic engineering, enabling specific genome editing, gene regulation assays and, developed in recent years, diagnostic applications. Nucleic acid detection methods are the gold-standard diagnostic technique in the clinic due to their high sensitivity and specificity. However, going forward, we must develop versatile virus detection methods that enable fast and reliable diagnostics and that can overcome the limitations of the current techniques and can be easily used outside the laboratory for point-of-care (POC) applications. CRISPR-Cas systems have been repurposed as nucleic acid diagnostic tools made possible by the ability of some Cas proteins to perform non-specific collateral cleavage upon target recognition. We aim to expand the CRISPR-Cas diagnostic toolkit by developing a novel nucleic acid detection strategy based on CRISPR-Cas9, whose mode of action relies on strand displacement rather than on collateral catalysis. We show that SARS-CoV-2 DNA amplicons generated from patient samples can be detected with CRISPR-Cas9. We also demonstrate the ability to perform simultaneous detection of different DNA amplicons with the same nuclease, either to identify different SARS-CoV-2 regions or different respiratory viruses. To advance toward POC applications, we coupled the isothermal preamplification step with biotinylated oligos to produce labelled amplicons. When combined with CRISPR-Cas9 targeting and FAM-labelled probes, this allows for colorimetric visualization of detection using lateral flow assays (LFA) on commercially available strips. The colorimetric readout enables interpretation of the results with the naked eye, surpassing the need for a fluorimeter. We successfully detected SARS-CoV-2 from patient samples in the LFA setup, and when combined with multiplexed RT-RPA, the detection of two distinct regions of the virus was achieved in a single test. Furthermore, the absence of collateral activity in our methodology allows for the processing of additional downstream sequences. Therefore, we also aim to explore the signal integration capability of our CRISPR-Cas9-based detection method. We demonstrate that engineered DNA logic circuits can process different SARS-CoV-2 signals detected by the CRISPR complexes. We also aimed to enhance our CRISPR-Cas9 system to sense both proteins and nucleic acids. We aimed to engineer a conditional guide RNA that responds to the presence of the SARS-CoV-2 spike protein. To achieve this, we inserted an aptamer sequence within the guide RNA to block Cas9 activity in the absence of the protein. Upon the presence of the spike protein, aptamer-protein interaction makes the blocking motif undergo a conformational change, releasing the guide RNA and activating Cas9. While we successfully achieved the blocking scenario using the regulatory sequences, further work is needed to identify a sequence that can induce the specific conformational change required to restore Cas9 activity upon spike protein presence. Collectively, this CRISPR-Cas9 diagnostic platform allows a multiplexed detection in a single tube, complementing the existing CRISPR-based methods, and offering an extensible system for applications in point-of-care diagnostics and biocomputing. / This work was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation (PRE2019-088531). / Márquez Costa, R. (2024). Engineering of CRISPR-Cas9-Based Systems for Diagnostics and Biocomputing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210634

[ES] El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa un 80% de los casos de cáncer de pulmón, siendo uno de los tipos de cáncer más frecuentes y mortales. El tratamiento con inmunoterapia ha mejorado significativamente el pronóstico de los pacientes en las últimas décadas. No obstante, no todos los pacientes responden al tratamiento, por lo que se necesitan nuevos biomarcadores para predecir qué pacientes se podrían beneficiar de la inmunoterapia. El principal objetivo de esta tesis es obtener nuevos biomarcadores no invasivos para pacientes de CPNM avanzado tratados con inmunoterapia. Se incluyeron 52 pacientes de CPNM en estadios avanzados tratados con anti-PD1 o anti-PD1 en combinación con quimioterapia (anti-PD1+CT) en primera línea. Se analizaron biomarcadores no invasivos en muestras de sangre periférica, obtenidas antes del tratamiento y en la primera evaluación de respuesta. Los biomarcadores analizados en este estudio fueron: i) parámetros hematológicos e inmunológicos, ii) expresión de genes inmunoreguladores en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), iii) repertorio de TCR-ß y iv) genotipo de HLA. También se analizaron 13 controles sanos, y se observó que los pacientes con CPNM presentaron menores niveles de expresión de genes relacionados con las células T. Además, los pacientes con CPNM tenían menor número de clones de TCR-ß. Se analizó el valor predictivo y pronóstico de los potenciales biomarcadores independientemente en pacientes tratados con anti-PD1 o anti-PD+CT. Se encontraron biomarcadores con valor pronóstico, bien en las muestras basales o en las muestras tomadas en la primera evaluación de respuesta. Al utilizar muestras no invasivas, también se pudo estudiar la dinámica de los biomarcadores a lo largo del tratamiento, observando que algunos cambios ocurrían de manera diferencial en pacientes respondedores o dependiendo del tratamiento. La integración de los datos de las variables analizadas ha resultado en una propuesta de un modelo multivariante capaz de predecir qué pacientes tendrán mejor pronóstico, en el subgrupo de pacientes tratados con anti-PD1. Además, se crearon dos inmunogramas no invasivos incluyendo los ratios de los biomarcadores entre muestras tomadas antes y durante el tratamiento. Estos modelos se realizaron específicamente para cada tipo de tratamiento, y podrían ser útiles para monitorizar la respuesta durante el tratamiento. Este estudio resalta el papel de la biopsia líquida como una herramienta no invasiva para analizar biomarcadores de forma integral que permiten caracterizar y monitorizar el estatus inmune en pacientes con CPNM tratados con inmunoterapia o quimioinmunoterapia. / [CA] El càncer de pulmó no microcític (CPNM) representa un 80% dels casos de càncer de pulmó, i és un dels tipus de càncer més freqüents i mortals. El tractament amb immunoteràpia ha millorat significativament el pronòstic dels pacients en les últimes dècades. Malgrat això, no tots el pacients responen, per la qual cosa es necessiten nous biomarcadors per predir què pacients es beneficiaran del tractament amb immunoteràpia. El principal objectiu d'aquesta tesi és obtindre nous biomarcadors no invasius per a pacients de CPNM avançat tractats amb immunoteràpia. Es van incloure 52 pacients de CPNM en estadis avançats tractats amb anti-PD1 o anti-PD1 en combinació amb quimioteràpia (anti-PD1+CT) en primera línia. Es van analitzar biomarcadors no invasius a partir de mostres de sang perifèrica, que es van obtindre abans del tractament i en la primera avaluació de resposta. Els potencials biomarcadors analitzats en aquest estudi van ser: i) paràmetres hematològics i immunològics, ii) expressió de gens immunoreguladors en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMCs), iii) repertori de TCR-ß i iv) genotip d'HLA. També es van analitzar 13 controls sans, i es va observar que els pacients amb CPNM presentaven menors nivells d'expressió de gens relacionats amb les cèl·lules T. A més, els pacients amb CPNM tenien menor riquesa de repertori de TCR-ß. S'han analitzat el valor predictiu i pronòstic dels potencials biomarcadors independentment en pacients tractats amb anti-PD1 o anti-PD1+CT. S'han trobat biomarcadors amb valor pronòstic, bé en les mostres basals o en les mostres preses en la primera avaluació de resposta. Com s'han utilitzat mostres no invasives, també s'ha pogut analitzar la dinàmica dels biomarcadores al llarg del tractament, i s'han observat canvis específics de pacients responedors o del tipus de tractament. La integració de les variables analitzades ha resultat en una proposta d'un model multivariant capaç de predir quins pacients amb CPNM tindran millor pronòstic, en el subgrup de pacients tractats amb anti-PD1. També s'han fet dos immunograms no invasius incloent els ràtios dels biomarcadors entre mostres preses abans i durant el tractament. Aquests models son específics per a cada tipus de tractament, i podrien ser útils per a monitorar la resposta durant el tractament. Aquest estudi ressalta el paper de la biòpsia líquida com una eina no invasiva per a analitzar biomarcadors de forma integral que permeten caracteritzar i monitorar l'estatus immune en pacients amb CPNM tractats amb immunoteràpia o quimioimmunoteràpia. / [EN] Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) represents 80% of lung cancer cases, being one of the most frequent and death causing cancers. Recently developed treatments with immunotherapy have improved patient prognosis. However, a significant number of patients do not respond to treatment, thus there is an urgent need for biomarkers to predict which patients will benefit from immunotherapy. The main objective of this thesis was to obtain novel non-invasive biomarkers for advanced-stage NSCLC patients treated with immunotherapy. This study included 52 advanced-stage NSCLC patients treated with Anti-PD1 or Anti-PD1 in combination with chemotherapy (Anti-PD1+CT) in the first line setting. Non-invasive biomarkers were analysed using peripheral blood samples, which were obtained before first cycle and at first response assessment. The potential biomarkers analysed in this study were: i) haematological and immunological parameters, ii) immune-related gene expression analysed on Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs), iii) TCR-ß repertoire, and iv) HLA genotype. 13 healthy subjects were also included in this study. NSCLC patients presented lower T cell related gene expression levels than controls. Furthermore, cancer patients had a lower number of unique TCR-ß clones. We have assessed the predictive and prognostic value of the analysed variables independently on patients treated with anti-PD1 or anti-PD1+CT. We found prognostic biomarkers that could be useful to identify patients who benefit from treatment. Since we used non-invasive samples, we also observed differences in immune-related biomarkers at first response assessment in patients responding to treatment. In addition, biomarker dynamics were useful to identify changes occurring throughout treatment. The integration of data from the analysed variables has resulted in a proposal of a multivariate model capable of predicting patients with improved outcomes to treatment with anti PD1 therapy. Moreover, we have developed two non-invasive inmunograms including the ratios of on- and pre-treatment samples, which could be useful to monitor patients throughout treatment. Altogether, this study highlights the role of non-invasive biomarkers to characterize and monitor immune status in NSCLC patients treated with immunotherapy or chemoimmunotherapy. / This Thesis was supported by the following grants: Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer. PRDVA18015MORE; Centro de Investigación Biomédica en Red Cáncer. Project B16/12/00350 e Instituto de Salud Carlos III: PI18/00266 / Moreno Manuel, A. (2024). Non-Invasive Immunogram. A Multidimensional Approach to Characterize and Monitor Immune Status in Non-Small Cell Lung Cancer [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204490

[ES] La tesis doctoral titulada «Nanomotores Janus platino-sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas» se centra en el desarrollo de una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor se basa en una nanopartícula Janus integrada por una nanopartícula de platino (Pt) y una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) y es capaz de propulsarse y liberar fármacos de forma controlada. La cara de Pt es responsable del movimiento mediante la catálisis de H2O2 en O2, mientras que, la cara de MSN es responsable de la entrega de la carga ante el reconocimiento de estímulos específicos. El objetivo del trabajo es emplear la fuerza motriz de los nanomotores para difundir a través de barreras biológicas (BB), favoreciendo la entrega de fármacos en localizaciones diana de difícil acceso. En concreto, la zona interna de las biopelículas bacterianas y los tumores sólidos, que en ambos casos está protegida por una matriz extracelular (ECM) prácticamente impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetiza de forma toposelectiva mediante la técnica de emulsión de Pickering. En primer lugar, se carga con una molécula modelo y se funcionaliza con una puerta molecular sensible a estímulos redox, unida a la superficie de la cara de MSN mediante enlaces disulfuro. Los resultados confirman la estructura del nanomotor (tipo «muñeco de nieve») y su doble funcionalidad: difusión incrementada en respuesta a H2O2 y salida selectiva de la carga en respuesta a una especie redox (glutatión). En segundo lugar, el nanomotor se carga con el antiséptico clorhexidina y sus poros se bloquean con una nanoválvula sensible al pH, formada por un complejo de inclusión establecido entre grupos benzimidazol y ¿-ciclodextrinas unidas a la proteasa ficina. La puerta molecular es capaz de hidrolizar los componentes de la ECM e inducir la liberación de la carga a pH ácido, rasgo característico de la zona interna de las biopelículas. Los experimentos realizados prueban que la triple funcionalidad sinérgica del nanomotor resulta en la eliminación de los microorganismos de las biopelículas endodónticas. A continuación, se propone un nanomotor propulsado por glucosa, ya que existe una urgente necesidad de emplear combustibles biocompatibles y biodisponibles para evitar efectos nocivos en los pacientes. Para ello, se une la enzima glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mediante enlaces amida. La enzima desempeña una doble función. Por una parte, constituye el primer elemento de la cascada que induce el movimiento, al catalizar la transformación enzimática de glucosa en H2O2. Finalmente, el H2O2 es descompuesto por la cara de Pt propulsando al nanomotor. Por otra parte, actúa como puerta molecular sensible a proteasas, induciendo la liberación del fármaco doxorrubicina en los lisosomas. Los resultados obtenidos evidencian la habilidad del nanomotor para eliminar las células cancerosas de los tumores sólidos. Las conclusiones de esta tesis doctoral se resumen en que se ha logrado materializar un nanomotor muy versátil con 2 ventajas prominentes: (i) amplia área catalítica capaz de inducir una difusión incrementada y (ii) amplia área susceptible de ser funcionalizada con puertas moleculares. Además, se ha demostrado la capacidad de los nanomotores para atravesar BB, logrando un efecto terapéutico en infecciones endodónticas y cáncer. También se ha probado que el efecto es mayor que el causado por los componentes de los nanomotores independientemente y por nanopartículas control privadas de alguno de sus elementos. Esperamos que estos datos contribuyan al desarrollo de nuevas estrategias o a la mejora de las ya existentes para solventar el reto de la entrega de agentes terapéuticos en áreas enfermas inaccesibles, un problema clínico sin solución en la actualidad. / [CA] La tesi doctoral titulada «Nanomotors Janus platí-sílice mesoporosa com a plataforma per a l'alliberament de fàrmacs en aplicacions biomèdiques» se centra en el desenvolupament d'una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor es basa en una nanopartícula Janus integrada per una nanopartícula de platí (Pt) i una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) i és capaç de propulsar-se i alliberar fàrmacs de manera controlada. La cara de Pt és responsable del moviment mitjançant la catàlisi de H2O2 a O2, mentre que la cara de MSN és responsable de l'alliberament de la càrrega davant el reconeixement d'estímuls específics. L'objectiu del treball és fer servir la força motriu dels nanomotors per difondre a través de barreres biològiques (BB), afavorint l'alliberament de fàrmacs en localitzacions diana de difícil accés. En concret, la zona interna de les biopel·lícules bacterianes i els tumors sòlids, que en tots dos casos està protegida per una matriu extracel·lular (ECM) pràcticament impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetitza de forma toposelectiva mitjançant la tècnica d'emulsió de Pickering. En primer lloc, es carrega amb una molècula model i es funcionalitza amb una porta molecular sensible a estímuls redox, unida a la superfície de la cara de MSN mitjançant enllaços disulfurs. Els resultats confirmen l'estructura del nanomotor (tipus ninot de neu) i la seva doble funcionalitat: difusió incrementada en resposta a H2O2 i sortida selectiva de la càrrega en resposta a una espècie redox (glutatió). En segon lloc, el nanomotor es carrega amb clorhexidina i els seus porus es bloquegen amb una nanovàlvula sensible al pH, formada per un complex d'inclusió establert entre grups benzimidazol i beta ciclodextrines unides a la proteasa ficina. La porta molecular és capaç d'hidrolitzar els components de l'ECM i induir l'alliberament de la càrrega a pH àcid, un tret característic de la zona interna de les biopel·lícules. Els experiments realitzats proven que la triple funcionalitat sinèrgica del nanomotor resulta en l'eliminació dels microorganismes de les biopel·lícules endodòntiques. A continuació, es proposa un nanomotor propulsat per glucosa, ja que hi ha una necessitat urgent d'emprar combustibles biocompatibles i biodisponibles, per a evitar efectes nocius als pacients. Per fer-ho, s'uneix l'enzim glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mitjançant enllaços amida. L'enzim exerceix una doble funció. D'una banda, constitueix el primer element de la cascada que indueix el moviment, en catalitzar la transformació enzimàtica de glucosa a H2O2. Finalment, l'H2O2 és descompost per la cara de Pt propulsant el nanomotor. D'altra banda, actua com a porta molecular sensible a proteases, induint l'alliberament del fàrmac doxorrubicina als lisosomes. Els resultats obtinguts evidencien l'habilitat del nanomotor per eliminar les cèl·lules canceroses dels tumors sòlids. Les conclusions d"aquesta tesi doctoral es resumen en que s"ha aconseguit materialitzar un nanomotor molt versàtil amb 2 avantatges prominents: (i) àmplia àrea catalítica capaç d"induir una difusió incrementada i (ii) àmplia àrea susceptible de ser funcionalitzada amb portes moleculars. A més, s'ha demostrat la capacitat dels nanomotors per travessar BB, aconseguint un efecte terapèutic en infeccions endodòntiques i càncer. També s'ha provat que l'efecte és més gran que el causat pels components dels nanomotors independentment i per nanopartícules control privades d'algun dels elements. Esperem que aquestes dades contribueixin al desenvolupament de noves estratègies o a la millora de les ja existents per resoldre el repte de l'alliberament d'agents terapèutics en àrees malaltes inaccessibles, un problema clínic sense solució actualment. / [EN] The PhD thesis entitled "Platinum-mesoporous silica Janus nanomotors as a platform for drug delivery in biomedical applications" focuses on the development of a multifunctional self-propelled nanoparticle (nanomotor). The nanomotor is based on a Janus nanoparticle composed of a platinum nanoparticle (Pt) and a mesoporous silica nanoparticle (MSN) and can propel itself and release drugs in a controlled manner. The Pt face is responsible for the movement by catalyzing H2O2 into O2, whereas the MSN face is responsible for the delivery of cargo upon recognition of specific stimuli. The objective is to employ the driving force of nanomotors to diffuse through biological barriers (BB), favoring drug delivery to hard-to-reach target sites, such as the inner zone of bacterial biofilms and solid tumors, which in both cases is protected by an extracellular matrix (ECM). The Janus Pt-MSN nanomotor is synthesized toposelectively using the Pickering emulsion technique. It is first loaded with a model molecule and functionalized with a redox-stimuli-sensitive molecular gate, attached to the MSN face surface via disulfide bonds. The results confirm the structure of the nanomotor ("snowman" type) and its dual functionality: increased diffusion in response to H2O2 and selective cargo delivery in response to glutathione. Second, the nanomotor is loaded with chlorhexidine and its pores are blocked by a pH-sensitive nanovalve formed by an inclusion complex established between benzimidazole and ¿-cyclodextrins bound to ficin protease. The molecular gate is able to hydrolyze ECM components and induce cargo release at acidic pH, a characteristic feature of the inner zone of biofilms. The experiments performed prove that the triple synergistic functionality of the nanomotor results in the elimination of microorganisms from endodontic biofilms. Next, a glucose-powered nanomotor is proposed, as there is an urgent need to employ biocompatible and bioavailable fuels. For this purpose, the enzyme glucose oxidase is attached to the mesoporous face of the nanomotor via amide bonds. The enzyme plays a dual role. On the one hand, it constitutes the first element of the movement-inducing cascade by catalyzing the enzymatic transformation of glucose into H2O2. Finally, H2O2 is decomposed by the Pt face propelling the nanomotor. Moreover, it acts as a protease-sensitive molecular gate, inducing the release of the drug doxorubicin into lysosomes. The results obtained evidence the ability of the nanomotor to kill cancer cells in solid tumors. The conclusions of this doctoral thesis are that a very versatile nanomotor has been materialized with 2 prominent advantages: (i) large catalytic area capable of inducing increased diffusion and (ii) large area susceptible to be functionalized with molecular gates. In addition, the ability of nanomotors to pass through BB has been demonstrated, achieving a therapeutic effect on endodontic infections and cancer. It has also been proven that the effect is greater than that caused by the components of the nanomotors independently and by control nanoparticles deprived of some of their elements. We hope that these data will contribute to the development of new strategies or the improvement of existing ones to solve the challenge of delivering therapeutic agents to inaccessible diseased areas, a clinical problem with no solution at present. / Escudero Noguera, A. (2024). Nanomotores Janus de platino y sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205396

[ES] El envejecimiento poblacional y su progresión, es un hecho que debe ser abordado para el bienestar sanitario y social futuro, especialmente de las personas mayores, y por extensión, de toda la sociedad. En este sentido, la fragilidad, entendida como el declive progresivo en los sistemas fisiológicos relacionados con la edad, juega un papel clave. El estudio de la fragilidad mediante el Índice Frágil-VIG, permite abordar a los pacientes en la práctica clínica de una manera multidimensional, estableciendo un diagnóstico situacional. La presente tesis se compone de dos partes diferenciadas. Se realiza un análisis no paramétrico mediante el método Kaplan-Meier de las variables sociodemográficas y clínicas, para determinar los factores pronósticos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG, de fragilidad según el Short Physical Performance Battery, de dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, y de mortalidad. Posteriormente se procede a realizar análisis multivariantes mediante el modelo de regresión de Cox. Para el desarrollo de los modelos, se sigue la estrategia sugerida por Collett. Previamente, se realiza la validación del Índice Frágil-VIG respecto al Short Physical Performance Battery. Respecto al análisis no paramétrico, fueron factores pronósticos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG el estado civil, el nivel de cronicidad y el número de convivientes; factores pronósticos de fragilidad según el Short Physical Performance Battery el nivel de cronicidad y el Índice Frágil-VIG; factores pronósticos de dependencia para las actividades básicas de la vida diaria el estado civil, la fragilidad según el Índice Frágil-VIG y el nivel de cronicidad; y factores pronósticos de mortalidad fueron la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, la fragilidad según el Índice Frágil-VIG, el nivel de estudios, el estado civil, el nivel de cronicidad y el sexo. En el análisis multivariante, las variables incluidas en los modelos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG y la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, fueron el estado civil, el nivel de cronicidad y el sexo. En el modelo multivariante de fragilidad según el Short Physical Performance Battery fueron significativas las variables nivel de cronicidad y el número de convivientes. Y finalmente, en el modelo multivariante de mortalidad, resultaron significativas las variables nivel de estudios, el sexo y la fragilidad según el Índice Frágil-VIG. El Índice Frágil-VIG presentó una adecuada validez convergente y discriminativa respecto al Short Physical Performance Battery. Un 20% de las personas difirieron en el diagnóstico de fragilidad entre ambas herramientas, presentando perfiles diferentes. La validación del Índice Frágil-VIG ha fortalecido el uso del mismo para el desarrollo de los modelos. Los grupos de riesgo desarrollados pueden ayudar a establecer estrategias de salud diferenciadas, tanto a nivel individual en la consulta como a nivel poblacional. Con el objetivo de facilitar su implementación en la práctica clínica diaria, se han desarrollado nomogramas que permiten visualizar fácilmente con el objetivo de poder disponer de manera gráfica una herramienta aplicable en la consulta. / [CA] L'envelliment poblacional i la seua progressió, és un fet que ha de ser abordat per al benestar sanitari i social futur, especialment de les persones majors, i per extensió, de tota la societat. En este sentit, la fragilitat, entesa com el declivi progressiu en els sistemes fisiològics relacionats amb l'edat, juga un paper clau. L'estudi de la fragilitat mitjançant l'Índex Fràgil-VIG, permet abordar als pacients en la pràctica clínica d'una manera multidimensional, establint un diagnòstic situacional. La present tesi es compon de dues parts diferenciades. Es realitza una anàlisi no paramètric mitjançant el mètode Kaplan-Meier de les variables sociodemogràfiques i clíniques, per a determinar els factors pronòstics de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG, de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery, de dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, i de mortalitat. Posteriorment es procedix a realitzar anàlisi multivariants mitjançant el model de regressió de Cox. Per al desenvolupament dels models, se seguix l'estratègia suggerida per Collett. Prèviament, es realitza la validació de l'Índex Fràgil-VIG respecte al Short Physical Performance Battery. Respecte a l'anàlisi no paramètric, van ser factors pronòstics de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG l'estat civil, el nivell de cronicitat i el nombre de convivents; factors pronòstics de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery el nivell de cronicitat i la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG; factors pronòstics de dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària l'estat civil, la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG i el nivell de cronicitat; i factors pronòstics de mortalitat van ser la dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG, el nivell d'estudis, l'estat civil, el nivell de cronicitat i el sexe. En l'anàlisi multivariant, les variables incloses en els models de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG i la dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, van ser l'estat civil, el nivell de cronicitat i el sexe. En el model multivariant de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery van ser significatives les variables nivell de cronicitat i el nombre de convivents. I finalment, en el model multivariant de mortalitat, van resultar significatives les variables nivell d'estudis, el sexe i la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG. L'Índex Fràgil-VIG va presentar una adequada validesa convergent i discriminativa respecte al Short Physical Performance Battery. Un 20% de les persones van diferir en el diagnòstic de fragilitat entre totes dues eines, presentant perfils diferents. La validació de l'Índex Fràgil-VIG ha enfortit l'ús del mateix per al desenvolupament dels models. Els grups de risc desenvolupats poden ajudar a establir estratègies de salut diferenciades, tant a nivell individual en la consulta com a nivell poblacional. Amb l'objectiu de facilitar la seua implementació en la pràctica clínica diària, s'han desenvolupat nomogrames que permeten visualitzar fàcilment amb l'objectiu de poder disposar de manera gràfica una eina aplicable en la consulta. / [EN] Population aging and its progression is a fact that must be addressed for the future health and social well-being, especially of the elder people, and by extension, of society as a whole. In this sense, frailty, understood as the progressive decline in physiological systems related to age, plays a remarkable role. The study of frailty using the Frail Index-VIG allows patients to be approached in clinical practice with a multidimensional view, thus establishing a situational diagnosis. This thesis is composed of two different parts. A non-parametric analysis is carried out using the Kaplan-Meier method of the sociodemographic and clinical variables to determine the prognostic factors of frailty according to the Frail-VIG Index, frailty according to the Short Physical Performance Battery, dependency for basic activities of the daily life, and mortality. Subsequently, multivariate analysis were performed using the Cox regression model. For the development of the models, we follow the strategy suggested by Collett. Previously, validation of the Frail-VIG Index is carried out regarding the Short Physical Performance Battery. Regarding the non-parametric analysis, marital status, chronicity level and number of cohabitants, were prognostic factors for frailty according to the Frail-VIG Index; chronicity level and frailty according to the Frail-VIG Index were prognostic factors for frailty according to the Short Physical Performance Battery; prognostic factors for dependency in basic activities of daily living were marital status, frailty according to the Frail-VIG Index and chronicity level; and mortality prognostic factors were dependency for basic activities of daily living, frailty according to the Frail-VIG Index, educational level, marital status, chronicity level and sex. In the multivariate analysis, the variables included in the frailty models using the Frail-VIG Index and dependency for basic activities of daily living were marital status, chronicity level and sex. In the multivariate model of frailty according to the Short Physical Performance Battery, the variables chronicity level and number of cohabitants were significant. And finally, in the multivariate mortality model, the variables level of education, sex and frailty according to the Frail-VIG Index were significant. The Frail Index-VIG presented adequate convergent and discriminative validity compared to the Short Physical Performance Battery. 20% of participants differed in the diagnosis of frailty between both tools, by presenting different profiles. The validation of the Frail-VIG Index has firmed up its use for the development of models. The risk groups might help to establish differentiated health strategies, both at the individual level in the clinical practice and at the population level. In order to facilitate the clinical practice, we developed nomograms that allow an easy visualization of the different risks. / Camacho Torregrosa, S. (2024). Modelización matemática de la fragilidad valorada mediante el Índice Frágil-VIG y el SPPB, de la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria y de la mortalidad en población general de 70 años o más. Validación del Índice Frágil-VIG respecto al SPPB [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205710

[ES] Los ultrasonidos se han empleado desde los años 90 para el tratamiento de múltiples patologías gracias a su carácter no invasivo y no ionizante, desde el tratamiento localizado del cáncer hasta terapias neurológicas. La focalización de estas ondas de presión y la conformación del haz ha sido un problema que desde varias perspectivas se ha intentado abordar, con el uso de lentes focalizadoras, transductores focalizados y los más sofisticados sistemas phased-array compuestos por múltiples transductores con control electrónico de amplitud y fase. Estos sistemas presentan varios inconvenientes, como el escaso control del haz que ofrecen los transductores focalizados, con un foco fijo y sin control de las posibles distorsiones del campo que puede introducir el medio, o el elevado coste derivado de la compleja electrónica de los sistemas phased-arrays, aunque proporcionan un mejor control del foco y compensación de aberraciones. La revolucionaria idea de los hologramas acústicos como elementos pasivos impresos con tecnología 3D llegó como una alternativa de bajo coste a los previos sistemas. En primer lugar se describió su uso en medios homogéneos para generar las más diversas imágenes acústicas, pero pronto se empezó a estudiar su viabilidad para focalizar haces de ultrasonidos en el interior del cerebro, resultando ser muy útiles en la corrección de las aberraciones que el cráneo introduce en el frente de ondas. Las lentes holográficas son capaces de codificar tanto el campo que se desea generar como las distorsiones de fase que puede introducir el medio en el que se propagan los ultrasonidos. En esta tesis se estudia el diseño de hologramas acústicos y su aplicación en el ámbito biomédico. La tesis puede ser dividida en tres grandes partes: una primera en la cual se describen nuevos métodos para el diseño de lentes holográficas, una segunda en la que se emplean los hologramas ultrasónicos para generación de hipertermia, y una tercera en la que se estudia su uso para terapias transcraneales. En la primera parte de la tesis se investiga el diseño de lentes holográficas para transductores con geometría esférica como alternativa a las lentes planas ya descritas previamente. Además, se estudia un nuevo método para codificar el campo acústico en las lentes de forma que se mejore la imagen producida por ellas, ajustándose más a la deseada. En la segunda parte se estudia cómo es el patrón térmico que genera el campo acústico producido por una lente holográfica cuando se aplica sobre un material con absorción acústica y cómo afecta la difusión térmica a éste. Esta difusión tiene como efecto que el patrón térmico con el tiempo no se parezca al acústico, y que las lentes deban tener en cuenta este proceso en su diseño para aplicaciones térmicas, especialmente si se desean regiones uniformes de calentamiento. Se demuestra cómo la hipertermia generada por ultrasonidos es más dañina en esferoides de células tumorales que la hipertermia tradicional. En la tercera parte se demuestra la viabilidad de los hologramas ultrasónicos para tratamientos neurológicos, aplicados desde la ventana temporal para reducir el eventual calentamiento del hueso que se produce. Además, se estudia en experimentos ex-vivo el campo acústico producido por lentes holográficas a través de un cráneo de macaco, aplicando técnicas de proyección holográfica para obtener aún más información de estas medidas y se diseña un sistema para aplicar estos hologramas en experimentos in-vivo con macacos y comprobar la viabilidad de la apertura de la barrera hematoencefálica de forma localizada. Esta tesis se enfoca a un mejor diseño y entendimiento de las emergentes lentes holográficas, así como a estudiar su validez en aplicaciones biomédicas de gran interés como son la hipertermia, la neuromodulación y la apertura de la barrera hematoencefálica para la administración de fármacos en el cerebro. / [CA] Els ultrasons s'han emprat des dels anys 90 per al tractament de múltiples patologies gràcies al seu caràcter no invasiu i no ionitzant, des del tractament localitzat del càncer fins a teràpies neurològiques. La focalització d'estes ones de pressió i la conformació del feix acústic ha sigut un problema que des de diverses perspectives s'ha intentat abordar, amb l'ús de lents focalizadores, transductors focalitzats i els més sofisticats sistemes phased-array compostos per múltiples transductors amb control individual d'amplitud i fase. Estos sistemes presenten diversos inconvenients, com l'escàs control del feix que ofereixen els transductors focalitzats, amb un focus fix i sense control de les possibles distorsions del camp que pot introduir el medi, o l'elevat cost derivat de la complexa electrònica dels sistemes phased-array, encara que proporcionen un millor control del focus i compensació d'aberracions. La revolucionària idea dels hologrames acústics com a elements passius impresos amb tecnologia 3D va arribar com una alternativa de baix cost als previs sistemes. En primer lloc es va descriure el seu ús en medis homogenis per a generar les més diverses imatges acústiques, però prompte es va començar a estudiar la seua viabilitat per a focalitzar feixos d'ultrasons a l'interior del cervell, resultant ser molt útils en la correcció de les aberracions que el crani introduïx en el front d'ones. Les lents hologràfiques són capaces de codificar tant el camp que es desitja generar com les distorsions de fase que pot introduir el medi en el qual es propaguen els ultrasons. En esta tesi s'estudia el disseny d'hologrames acústics i la seua aplicació en l'àmbit biomèdic. La tesi pot ser dividida en tres grans parts: una primera en la qual se descriuen nous mètodes per al disseny de lents hologràfiques, una segona en la qual s'empren els hologrames ultrasònics per a generació d'hipertèrmia i una tercera en la qual s'estudia el seu ús per a teràpies transcranials. En la primera part de la tesi s'investiga el disseny de lents hologràfiques per a transductors amb geometria esfèrica com a alternativa a les lents planes ja descrites prèviament. A més, s'estudia un nou mètode per a codificar el camp acústic en les lents de manera que es millore la imatge produïda per elles, ajustant-se més a la desitjada. En la segona part s'estudia com és el patró tèrmic que genera el camp acústic produït per una lent hologràfica quan s'aplica sobre un material absorbent i com afecta la difusió tèrmica a aquest. Esta difusió té com a efecte que el patró tèrmic amb el temps no se semble a l'acústic, i les lents hagen de tindre en compte aquest procés en el seu disseny per a aplicacions tèrmiques, especialment si es desitgen regions uniformes de calfament. Es demostra com la hipertèrmia generada per ultrasons és més nociva en esferoides tumorals que la hipertèrmia tradicional. En la tercera part es demostra la viabilitat dels hologrames ultrasònics per a tractaments neurològics, aplicats des de la finestra temporal per a reduir el calfament de l'os que es produïx. A més, s'estudia en experiments ex-vivo el camp acústic produït per lents hologràfiques a través d'un crani de macaco, aplicant tècniques de projecció hologràfica per a obtindre encara més informació d'estes mesures i es dissenya un sistema per a aplicar estos hologrames en experiments in-vivo amb macacos i comprovar la viabilitat de l'obertura de la barrera hematoencefàlica de forma localitzada. Esta tesi s'enfoca a un millor disseny i enteniment de les emergents lents hologràfiques, així com en l'estudi de la seua validesa en aplicacions biomèdiques de gran interès com són la hipertèrmia, la neuromodulació i l'obertura de la barrera hematoencefàlica per a l'administració de fàrmacs en el cervell. / [EN] Ultrasound has been used since the 1990s for the treatment of multiple pathologies thanks to its non-invasive and non-ionising nature, from localised cancer treatment to neurological therapies. The focusing of these pressure waves and beam shaping has been a problem that has been tackled from various perspectives, with the use of focusing lenses, focused transducers and the more sophisticated phased-array systems composed of multiple transducers with electronic amplitude and phase control. These systems have several drawbacks, such as the poor beam control offered by focused transducers, with a fixed focus and no control of possible field distortions introduced by the medium, or the high cost due to the complex electronics of phased-array systems, although they provide better focus control and aberration compensation. The revolutionary idea of acoustic holograms as passive 3D printed elements came as a low-cost alternative to these previous systems. They were first described to be used in homogeneous media to generate a wide range of acoustic images, but their feasibility for focusing ultrasound beams inside the brain was soon studied and proved to be very useful in correcting the aberrations that the skull introduces into the wavefront. Holographic lenses are capable of encoding both the field to be generated and the phase distortions that may be introduced by the medium in which the ultrasound propagates. This thesis studies the design of acoustic holograms and their application in the biomedical field. The thesis can be divided into three main parts: a first one in which new methods for the design of holographic lenses are described, a second one in which ultrasonic holograms are used for hyperthermia generation, and a third one in which their use for transcranial therapies is studied. The first part of the thesis investigates the design of holographic lenses for transducers with spherical geometry as an alternative to the previously described flat lenses. In addition, a new method is studied to encode the acoustic field in the lenses in order to improve the image produced by them, adjusting it more closely to the desired image. The second part studies the thermal pattern generated by the acoustic field produced by a holographic lens when it is applied to an absorbing material and how thermal diffusion affects it. This diffusion has the effect that the thermal pattern over time does not resemble the acoustic pattern, and lenses must take this process into account in their design for thermal applications, especially if uniform regions of heating are desired. The method is tested on multiple tumour spheroids, and results show that ultrasound-mediated hyperthermia is shown to be more damaging to tumour cell spheroids than traditional hyperthermia. The third part demonstrates the feasibility of ultrasonic holograms for neural treatments, applied from the temporal window to reduce the bone heating that occurs. In addition, the acoustic field produced by holographic lenses through a macaque skull is studied in ex-vivo experiments, applying holographic projection techniques to obtain even more information from these experiments. A system is designed to apply these holograms in in-vivo experiments with macaques to test the feasibility of opening the blood-brain barrier in a localized manner. This thesis focuses on a better design and understanding of the emerging holographic lenses, as well as on studying their validity in biomedical applications of great interest such as hyperthermia, neuromodulation and the opening of the blood-brain barrier for drug delivery to the brain. / Andrés Bautista, D. (2024). Acoustic Holograms for Hyperthermia and Transcranial Ultrasound [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205788