Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung der Welt. Sie verläuft meist chronisch-progressiv und kann schließlich zu Gelenkdestruktion und Invalidität führen. Trotz intensiver Forschungen bleibt die Pathogenese der RA weiterhin unklar. Neuere Untersuchungen weisen auf die wichtige Rolle des angeborenen Immunsystems hin, insbesondere der Toll-like-Rezeptoren (TLRs) TLR2 und TLR9. Genetische Polymorphismen in TLR2 und TLR9 könnten daher zur Erkrankung einer RA prädisponieren, davor schützen oder den Verlauf der RA beeinflussen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Assoziation zwischen RA-Erkrankung, dem Rheumafaktor (RF)-Serostatus und der Höhe des RF im Serum und genetischen Polymorphismen im TLR2- und TLR9-Gen zu analysieren. Zur Untersuchung der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C wurde ein real-time-PCR-basiertes Verfahren am LightCycler (LC) etabliert, das den schnellen Nachweis beider Polymorphismen in einer Reaktion mittels fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden ermöglicht. Desweiteren wurde ein neues Puffersystem verwendet, das die LC-PCR unter Verwendung einer konventionellen Taq-Polymerase zu erheblich günstigeren Kosten ermöglicht. Die Genotypisierung der DNA von 118 RA-Patienten (89 weiblich, 29 männlich, Durchschnittsalter 56,2 Jahre) und einer geschlechtsgematchten Kontrollgruppe von 118 Personen (Durchschnittsalter 44,1 Jahre) zeigte, dass die TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C sowie der TLR2-Polymorphismus G2408A nicht für das Auftreten von RA prädisponieren. Träger des seltenen C-Allels sind signifikant häufiger RF-positiv (p=0,049) und ihre RF-Antikörperspiegel sind höher als bei Patienten, die das C-Allel nicht aufweisen (p=0,023). Der TLR9-Polymorphismus T-1486C könnte daher die Krankheitsausprägung beeinflussen. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most common inflammatory joint disease worldwide. It is a chronic progressive disease which can eventually lead to joint destruction and disability. The pathogenesis of RA remains uncertain in spite of the intensive research in this field. Recent data indicate the important role of the innate immune system, especially of the toll like receptors (TLRs) TLR2 and TLR9 in the pathogenesis of RA. Genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene could therefore predispose to RA, protect against it or influence its course. The aim of this work was to analyse the association of RA, the serostatus of rheumatoid factor (RF) and its levels with genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene. A new real time PCR based method was developed on the LightCycler (LC) in order to analyse the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C. This method permits the fast detection of both polymorphisms in a single reaction using fluorescence labelled hybridization probes. Furthermore, a new reaction mix was developed which allows the use of a conventional Taq polymerase for the LC-PCR at much lower costs. The genotyping of 118 RA patients (89 female, 29 male; average age 56.2 years) and a control group of 118 healthy individuals (average age 44.1 years) showed that the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C and the TLR2 polymorphism G2408A do not predispose to RA disease. The TLR9 polymorphism T-1486C might influence the course of the disease as individuals with the rare C-allele are significantly more frequent RF-positive (p=0.049) and their RF-antibody levels are higher than in patients who do not bear the C-allele (p=0.023).

Abstract Oral lichen planus (OLP) is a chronic immune-mediated mucosal disease with unknown etiology. According to the current view, the pathogenesis of OLP involves activation of T-cell mediated immunity against the epithelial keratinocytes. A proportion of OLP patients are affected by painful symptoms, and the risk of oral cancer is increased in OLP. There is no curative treatment for OLP. Topical corticosteroids are used most commonly in the management of OLP. However, the evidence base for the effectiveness of any therapy is weak. The objective of this thesis was to study novel aspects of OLP etiopathogenesis and management. An epidemiologic, retrospective case-control study was conducted to determine whether systemic diseases, in particular thyroid diseases, are associated with OLP. In addition, a randomized controlled trial comparing the effectiveness of topical tacrolimus, triamcinolone acetonide and placebo in symptomatic OLP was carried out. Furthermore, immunohistochemical expression of toll-like receptors 4 and 9, hyaluronan and its principal receptor CD44 antigen, hyaluronan synthases 1-3, hyaluronidases 1-2 and cathepsin K was studied in OLP tissue samples and in healthy oral mucosa. The effect of topical tacrolimus on the expression of these molecules in OLP was also studied. The results of the present study showed that a history of hypothyroidism was associated with an approximately twofold risk of having OLP. Furthermore, both tacrolimus and triamcinolone acetonide were more efficient than placebo in reducing the signs and symptoms of OLP. No statistically significant differences were noted in the efficacy between tacrolimus and triamcinolone acetonide. In addition, the expression of the studied molecules was altered in the epithelium or stroma in OLP compared to healthy oral mucosa. Tacrolimus treatment decreased the expression of CD44 antigen in the stroma and the expression of cathepsin K in the epithelium in OLP. In conclusion, the present study extends our knowledge about systemic associated factors and management of OLP. In addition, the results improve our understanding of molecular level changes that occur in OLP. / Tiivistelmä Suun punajäkälä on krooninen immuunivälitteinen limakalvotauti, jonka etiologia on tuntematon. Taudin syntymekanismiin liittyy tämän hetkisen näkemyksen mukaan T-soluvälitteisen immuniteetin aktivoituminen epiteelin keratinosyyttejä vastaan. Suun punajäkälä aiheuttaa osalle potilaista kivuliaita oireita ja lisää suusyövän riskiä. Parantavaa hoitoa tautiin ei ole. Yleisimmin suun punajäkälän oireiden hoidossa käytetään paikallisia kortikosteroidivalmisteita. Kuitenkin eri hoitomuotojen tehosta on vain heikkoa näyttöä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia uusia näkökohtia liittyen suun punajäkälän etiopatogeneesiin ja hoitoon. Epidemiologisessa tapaus-verrokkitutkimuksessa selvitettiin, liittyvätkö yleissairaudet, erityisesti kilpirauhassairaudet, suun punajäkälään. Lisäksi satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa verrattiin paikallisen takrolimuusin, triamsinoloniasetonidin ja lumelääkkeen tehoa oireisesta suun punajäkälästä kärsivillä potilailla. Tutkimuksessa selvitettiin myös tollin kaltaisten reseptorien 4 ja 9, hyaluronaanin ja sen pääasiallisen reseptorin CD44-antigeenin, hyaluronaanisyntaasien 1–3, hyaluronidaasien 1–2 sekä katepsiini K:n immunohistokemiallista ilmentymistä suun punajäkälänäytteissä ja terveessä suun limakalvossa. Lisäksi tutkittiin takrolimuusihoidon vaikutusta näiden molekyylien ilmentymiseen suun punajäkälässä. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että kilpirauhasen vajaatoimintaan liittyi noin kaksinkertainen riski sairastaa suun punajäkälää. Lisäksi havaittiin, että suun punajäkälässä sekä takrolimuusi että triamsinoloniasetonidi ovat tehokkaampia kuin lumelääke oireiden ja kliinisen taudinkuvan lievittämisessä. Takrolimuusin ja triamsinoloniasetonidin tehossa ei todettu tilastollisesti merkitseviä eroja. Lisäksi suun punajäkälänäytteissä tutkittujen molekyylien ilmentyminen oli muuttunut joko epiteelissä tai stroomassa verrattuna terveeseen limakalvoon. Takrolimuusihoito vähensi CD44-antigeenin ilmentymistä stroomassa ja katepsiini K:n ilmentymistä epiteelissä suun punajäkälässä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus lisää tietoa suun punajäkälään liittyvistä systeemisistä tekijöistä ja suun punajäkälän hoidosta. Lisäksi löydökset lisäävät ymmärtämystä suun punajäkälässä tapahtuvista molekyylitason muutoksista.

Albert Font Haro ABSTRACT Modulation of plasmacytoid dendritic cell function: role of immunoreceptors TIM-3 and BDCA-2 Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are key players in the antiviral response as well as in linking innate and adaptive immune response. They express endosomal toll-like receptors 7 and 9, which can detect ssRNA and unmethylated CpG DNA, respectively. Due to the constitutive expression of the transcription factor IRF7, pDCs are able to rapidly produce massive quantities of type I (α, β, ω) and type III (1, 2, 3, 4) interferons (IFN-I and IFN-III) as well as pro- inflammatory cytokines such as IL-1, IL-6 and TNF-α. After maturation, they also function as antigen-presenting cells. Despite intense research, the mechanisms of IFN and pro-inflammatory cytokines production and regulation are still poorly understood. Using the pDC cell line GEN2.2 and also primary human pDCs, we shed light on the role of kinases MEK and SYK in IFN-I production and regulation. We found that SYK is not only involved in the regulatory receptor (RR)-mediated BCR-like pathway that represents the negative regulation of IFN-I and IFN-III secretion but also in the positive TLR7/9-mediated signal transduction pathway that leads to IFN-I production, representing the immunogenic function. We also found that MEK plays a...

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une pathologie complexe multifactorielle dont les mécanismes de dégénérescence des motoneurones et de propagation rapide au sein du système nerveux sont encore incertains. Par l’utilisation du nématode Caenorhabditis elegans, nous avons pu investiguer génétiquement et pharmacologiquement certains facteurs entrant en jeu dans la toxicité de TDP-43 et FUS. Des mutations dominantes dans ces protéines liant l’ADN et l’ARN, structurellement et fonctionnellement proches, sont des causes de SLA familiales. Nous avons, par le passé, construit un modèle de ver transgénique possédant le gène TARDBP ou FUS codant respectivement pour les protéines humaines TDP-43 ou FUS, sous le contrôle d’un promoteur exprimé seulement dans les neurones GABAergiques. Uniquement lorsque les gènes TARDBP ou FUS sont mutés, des symptômes relatifs à la SLA apparaissent au cours du temps, à savoir une paralysie progressive et une neurodégénérescence des motoneurones GABAergiques. Nous avons voulu connaître le rôle que pouvait jouer le système immunitaire, dont des évidences croissantes montrent une implication dans la SLA, dans la protéotoxicité liée à ces protéines dans nos modèles de ver. Dans un premier temps, nous avons évalué la motricité des vers en milieu solide et en milieu liquide, et grâce à des vers transgéniques exprimant la GFP dans les neurones GABAergiques, nous avons pu quantifier la neurodégénérescence. Nos résultats soulignent un rôle prévalent de l’orthologue de la protéine du système immunitaire innée Sarm1 chez le ver, TIR-1, ainsi que les kinases en aval dans la pathologie. Nous avons pu, de surcroît, utiliser le marqueur NLP-29 dont le promoteur lié à la GFP nous indique l’activation de la voie Sarm1 dans l’ensemble du ver et non seulement dans les neurones. De manière intéressante, l’activation de ces protéines se produit entre autres dans des cellules non-neuronales de manière paracrine suggérant qu’un signal de danger opère extracellulairement et vraisemblablement à travers un récepteur membranaire. Ces dernières années, un nombre important d’études met en lumière le rôle proéminent des microARNs dans des maladies telle que la SLA. Classiquement vus comme des régulateurs de l’expression post-transcriptionnelle, ce qui en font notamment des outils antiviraux puissants, ils peuvent agir à d’autres niveaux et notamment comme ligands de récepteurs Toll-like (TLRs), eux aussi impliqués dans la SLA. iv Outre le potentiel biomarqueur de ces petites molécules, nous avons investigué leur rôle dans la neurodégénérescence observée dans la SLA. Ainsi, dans une deuxième partie d’étude, nous avons utilisé des mutants pour différentes protéines impliquées dans la biogénèse des microARNs et trouvé qu’elles étaient partie intégrante du processus de paralysie et de dégénérescence des vers TDP-43A315T. Plus encore, le microARN let-7 pourrait être une molécule signal transitant entre les neurones et les cellules avoisinantes. Enfin, des analyses bio-statistiques prédisent la possibilité que let-7 se lie au récepteur TOL-1, l’unique orthologue des TLRs chez C. elegans. Les propriétés des microARNs en font en effet des cibles de choix dans la recherche de nouveaux acteurs dans la SLA et de potentielles cibles thérapeutiques. / Amyotrophic lateral sclerosis is a complex multifactorial pathology characterized by the progressive spread of motor neuron degeneration. Unfortunalety, the underlying disease mechanisms remain unclear. By using the nematode Caenorhabditis elegans, we were able to investigate genetically and pharmacologically some factors involved in TDP-43 or FUS proteotoxicity. Dominant mutations in these structurally and functionally similar DNA/RNA binding proteins, are causative for familial ALS. We have constructed transgenic C. elegans models expressing human TARDBP or FUS genes - encoding respectively TDP-43 and FUS - only in GABAergic motor neurons. In these transgenics animals, the expression of mutant TARDBP or FUS alleles results in early the motor deficits leading to age-dependent paralysis accompanied by neuronal protein aggregation. Using transgenic strain expressing GFP in GABAeric neurons, we found an increased rate of neurodegeneration in TDP-43 and FUS mutants. With these models we investigated the potential role of the innate immune system as a modifier of these phenotypes. Our results highlight a prevalent role for the worm’s innate immune system, and specifically the TIR-1/Sarm1 pathway and associated downstream kinases in neurodegeneration. We used GFP fluorescence linked to NLP-29 promoter to indicate Sarm1 pathway activation in the entire worm. Interestingly, activation of the TIR-1/Sarm1 pathway occurs in a paracrine manner in non-neuronal cells, suggesting that a danger signal operates extracellularly likely through a membrane receptor. In a past few years, a number of studies have highlighted the prominent role of microRNAs in diseases such as ALS. Traditionally seen as post-transcriptional regulators, what makes them powerful antiviral tools is that they can act at other levels and in particular as Toll-like receptors (TLRs) ligands, also involved in ALS. In addition to the biomarker potential of these small molecules, we investigated their role in the neurodegeneration observed in ALS. As a result, in the a second section of this study, we used worms mutant for several proteins involved in the biogenesis of microRNAs and found that they were involved in the process of TDP-43A315T-independent paralysis and neurodegeneration. Moreover, the microRNA let-7 seems to be a signal molecule involved in the non-cell autonomous trans-neuronal and trans-cellular spread of motor neuron degeneration. Finally, bio-statistical analyzes predict the possibility that let-7 binds to the vi TOL-1 receptor, the single ortholog of TLRs in C. elegans. Thus microRNAs may be prime targets for ALS therapeutic intervention.

Contexte. Les carcinomes des voies aérodigestives supérieures (VADS) arrivent en 6ème position parmi les cancers les plus fréquents au niveau mondial. La fonction du récepteur TLR3 dans les cellules de carcinomes des VADS est encore très mal comprise. Objectifs et méthodes. 1) Déterminer le niveau d’expression du récepteur TLR3 dans les lignées et les biopsies de carcinomes des VADS par western blot et par immunohistochimie. 2) Etudier le rôle de TLR3 dans la croissance tumorale de ces tumeurs, en utilisant notamment des lignées invalidées de façon conditionnelle pour TLR3. 3) Evaluer in vitro les effets cytotoxiques de ligands artificiels de TLR3 soit seuls, soit utilisés en combinaisons avec un inhibiteur d’IAP (inhibitor of apoptosis protein).Résultats. La protéine TLR3 est détectée à un niveau élevé en western blot dans les lignées de carcinomes des VADS étudiées, comparativement à un panel d’autres tumeurs épithéliales humaines. TLR3 est également constamment détecté en immunohistochimie dans les biopsies. TLR3 semble jouer un rôle dans la croissance tumorale des carcinomes des VADS : dans certaines conditions de culture (culture en hypoxie ou en milieu pauvre en SVF et en nutriments), la stimulation de TLR3 par un ligand exogène, le poly(A:U), favorise la croissance des cellules tumorales. Nous avons étudié l’effet de la stimulation de TLR3 sur le métabolisme glucidique dans ces mêmes cellules en utilisant un appareil de type Seahorse® qui mesure la consommation d’oxygène et la production de protons à partir de cellules cultivées en microplaques. Ces expériences montrent que la stimulation de TLR3 fait augmenter l’activité des voies du métabolisme cellulaire anaérobie (glycolyse extra-mitochondriale). Une étude métabolomique a mis en évidence des différences significatives dans le profil métabolique des cellules tumorales stimulées par le poly(A:U) comparativement aux cellules non traitées. Par ailleurs, nous avons montré que la stimulation de TLR3 permettait de détecter le facteur de transcription HIF1 en Western blot, même en conditions normoxiques. Sachant que des ARN libérés par des cellules en état de nécrose peuvent stimuler TLR3, il est tentant de penser que ce récepteur pourrait favoriser la survie des cellules malignes en zone hypoxique au voisinage de cellules nécrotiques. Néanmoins, l’expression de TLR3 représente aussi un facteur de vulnérabilité pour les cellules de carcinome des VADS : en effet les ligands artificiels de TLR3 utilisés en combinaison avec un inhibiteur d’IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) produisent des effets cytotoxiques sur les lignées de carcinomes des VADS étudiées. / Background. Head and Neck (HN) carcinomas are the 6th most frequent type of cancer worldwide. The role of the TLR3 receptor in HN carcinomas remains poorly understood.Objectives and Methods. 1) To assess the expression level of TLR3 in HN carcinoma cell lines and biopsies by Western blot and immunohistochemistry, respectively. 2) To study the role of TLR3 in tumour growth using specific cell lines with conditional knock-down of TLR3. 3). To assess in vitro the cytotoxic effects of artificial ligands of TLR3 used either alone or in combination with an IAP (inhibitor of apoptosis protein) inhibitor.Results. TLR3 protein was detected at a high level by Western blot analysis in HN carcinoma cell lines, by comparison with a panel of other human epithelial cancer cell lines. TLR3 was also consistently detected by immunohistochemistry in tumour biopsies. TLR3 seem to play a role in HN carcinoma cell growth: under certain culture conditions (hypoxic or low fetal calf serum/low nutrient culture conditions), TLR3 stimulation by a synthetic ligand, the poly(A:U), favours tumour cell growth. We investigated the effects of TLR3 stimulation on glucose metabolism using a Seahorse® analyzer, which measures the oxygen consumption and the proton production in living cells. Our results indicate that TLR3 stimulation induces an increase in anaerobic metabolism (extra-mitochondrial glycolysis). A metabolomic study revealed significant changes in the metabolic profile of cancer cells treated by poly(A:U) by comparison with untreated cells. We also showed that under TLR3 stimulation, HIF1 became detectable by Western blot analysis, even in normoxia. Given the fact that RNA fragments released by dying cells are able to trigger TLR3, one can assume that TLR3 might favour cancer cell survival in hypoxic areas located near the necrotic core of the tumour. However, TLR3 expression is also a factor of vulnerability for HN carcinoma cells: indeed, the combination of TLR3 artificial ligands with an IAP inhibitor has a strong cytotoxic effect on HN carcinoma cells in vitro.

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Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Doutor em Genética e Bioquímica / CHAPTER II: Purpose: We performed a meta-analysis of randomized trials to assess the effect of metformin on inflammatory markers and metabolic parameters in subjects with diabetes. Methods: We performed comprehensive searches on NCBI, Cochrane, Science Direct databases from 1966 to Jun of 2015. We included randomized trials of at least 4 weeks duration that compared groups with diabetes before and after the treatment with metformin or metformin plus other drugs, and evaluated body mass index, blood glucose, HbA1c and inflammatory parameters such as C-reactive protein, tumor necrosis factor and adiponectin. Results: Pooled results of the 26 trials, with 1760 participants at the end of treatment reduce BMI in 0.9% p=0,0043, as well as, decrease of blood glucose level [SMD -0,411 mg/dL, 95%CI -0,463 to -0,369, I2= 56.62%], HbA1c [SMD -0.479%, 95%CI -0,568 to -0,390, I2= 55.02%], CRP levels [SMD -0,274mg/dL, 95%CI -0,419 to -0,129, I2= 72.78%], TNFα concentration [SMD -0,103pg/ml, 95%CI -0,514 to 0,309, I2= 87.67%] and increase of adiponectin [SMD 0,171μg/ml, 95%CI 0,098 to 0,440, I2= 81.09%] compared with pretreatment. Conclusion: The long-treatment with metformin monotherapy or metformin plus other drugs improves metabolic parameters and induced changes in inflammatory markers in diabetic subject. CHAPTER III: Background: Metformin increases insulin sensitivity by decreasing hepatic glucose production and increasing glucose disposal in skeletal muscle. However, modulation of inflammatory response and CaMKKβ/AMPK/Myosin V activation in gastrocnemius muscle by metformin treatment has not been demonstrated in hypoinsulinemic diabetic rats. Objective: The present study investigated how the metformin improve insulin sensitivity in skeletal muscle of hypoinsulinemic diabetic rats. Methods: Diabetes was induced by streptozotocin (45 mg/kg, intraperitoneally) 10 days prior treatments. On 11th day, diabetic rats were treated with metformin (500 mg/kg, oral gavage), insulin (2U at 08:00 h and 4U at 17:00 h, subcutaneously) or untreated. After 20 days, glycemia was measured and insulin sensitivity was determined by KITT. Serum Insulin, GLUT4, IRSthr, inflammatory markers (NF-κB, IκB, TNF-α and p-JNK) and CAMKK, AMPK and Myosin V in gastrocnemius muscle were determined by ELISA. Results: As expected, insulin and metformin improved the insulin sensitivity. Besides, metformin treatment promoted reduction in inflammatory response mediated by NF-κB, IκB, TNF-α and p-JNK, and that was accompanied by increased CaMKKβ/AMPK/Myosin V/GLUT4 pathway activity in gastrocnemius muscle of diabetic rats. Conclusion: Our findings suggest that metformin induces significant reductions in several inflammatory markers in skeletal muscle of diabetic rats. Metformin-induced increase in CaMKKβ/AMPK/Myosin V/GLUT4 pathway activity was associated with higher insulin sensitivity. CHAPTER IV: Diabetes is characterized by a proinflammatory state which can activate TLR2 and TLR4, and these receptors could induce NF-κB and JNK activation in skeletal muscle. In this study, we investigated the inflammatory and apoptotic signaling pathways triggered by TLRs/NF-κB and JNK activation in skeletal muscle of diabetic rats treated with metformin before and after an insulin tolerance test. Metformin treatment decreased p-JNK and NF-κB, and increased IκB concentrations. This attenuation leads to a decrease of TNFα and CXCL1/KC, and an increase of p-AMPK, BAX and Bcl2 concentration. Furthermore, KITT revealed an improvement of the insulin sensitivity in the diabetic rats treated with metformin. In addition, metformin was not capable of attenuating the changes in the inflammatory pathway triggered by insulin injection as the increase of TNFα and TLR4 in metformin treated rats, and IκB, CXCL1/KC, TNFα and p-AMPK increase in the untreated group. Taken together, these results point out that metformin may attenuate the activation of the inflammatory pathway TLRs/NF-κB/TNFα/CXCL1/KC and the apoptotic signaling BAX/Bcl2/p-JNK, which could be accompanied by a reduction of the inflammatory damage caused by hyperglycemia and an improvement of insulin sensitivity in diabetic rats.

SUMMARY:<p>The bacterial lipopolysaccharide (LPS)-sensing machinery with the innate immune system receptor Toll-like receptor 4 (TLR4) at its centre has been the subject of extensive research but while TLR4 and myeloid differentiation factor 2 (MD2) were both shown to be essential, the role of other, so-called "accessory", molecules is much less clear. The co-receptor cluster of differentiation 14 (CD14) has been widely perceived as being a mere facilitator for the capture and transfer of LPS to TLR4, until recent studies suggested it might have a determining influence on which TLR4-dependent signaling cascades are triggered in response to LPS. The TLR4 receptor complex was shown to be specifically activated by diC14 amidine, a cationic lipid originally synthesized for its carrier properties. The lipid's immunostimulatory activity extends to both TLR4-dependent signaling cascades, the MyD88 and TRIF pathways.<p>The aim of this work was to gain more insight into how diC14 amidine is able to trigger these cascades and to contribute to the general understanding of the TLR4 machinery and its activation by non-LPS ligands. More precisely we were interested in the role of CD14 in the activation of both MyD88 and TRIF pathways by diC14-amidine and in potential consequences of possible divergent requirements of diC14 amidine and LPS for this co receptor.<p>Our study of the role of the membrane-associated and the soluble form of CD14 in the activation of the TLR4-dependent pathways by diC14 amidine revealed that – unlike LPS – the cationic lipid does not require CD14 to exercise its immunostimulatory activity, although the presence of the co receptor modulates the TLR4 activation and infrared spectroscopy experiments suggest a direct interaction.<p>In the case of sensing LPS, CD14 is required for the endocytosis of TLR4 and the subsequent activation of the TRIF pathway. By blocking the endocytosis mechanism at different stages we found that diC14-amidine generally enters the cell via endocytosis and that it activates – unlike LPS – both signaling cascades from inside endosomal vesicles, albeit at different stages of the endocytosis process.<p>Although the eventual immunological responses caused by diC14 amidine and LPS resemble each other or are even identical, our research revealed differences in the actual mechanism of activating TLR4, the receptor responsible for the corresponding innate immune response. These findings illustrate the uniqueness of diC14 amidine and the potential of further exploring its intriguing properties and mechanisms as a tool to decipher the TLR4 signaling machinery and with the perspective of designing new immunomodulators for vaccination and therapy.<p><p><p>RÉSUMÉ:<p>Le mécanisme de reconnaissance des lipopolysaccharides bactériens (LPS) par le récepteur de l'immunité innée Toll-like receptor 4 (TLR4) a fait l'objet d'une recherche intensive ces dernières années. Alors que TLR4 et son co-récepteur myeloid differentiation factor 2 (MD2) ont été démontrés comme étant essentiels pour la détection du LPS, le rôle des molécules dites "accessoires" est beaucoup moins évident. Le co-récepteur cluster of differentiation 14 (CD14) a largement été considéré comme un simple facilitateur pour la capture et le transfert des LPS à TLR4, mais des études récentes suggèrent qu'il pourrait avoir une influence déterminante sur les cascades de signalisation dépendantes de TLR4 induites en réponse au LPS. La diC14-amidine, un lipide cationique synthétisé initialement pour ses qualités en tant que vecteur de transfection, a révélé récemment une activité immunostimulatrice dépendante du récepteur TLR4, impliquant les deux cascades de signalisation dépendantes de TLR4, les voies MyD88 et TRIF.<p>Le but de ce travail était de mieux comprendre le mécanisme par lequel la diC14¬ amidine induit ces cascades et de contribuer à la compréhension générale du fonctionnement du complexe récepteur TLR4 et son activation par des ligands non-LPS. Plus précisément nous nous sommes intéressés au rôle de CD14 dans l'activation des voies MyD88 et TRIF par la diC14-amidine et des conséquences potentielles d’éventuelles divergences en termes d’exigence pour ce co-récepteur entre la diC14-amidine et le LPS. <p>Notre étude sur le rôle de la forme membranaire ou soluble de CD14 dans l'activation des voies dépendantes de TLR4 par la diC14-amidine a révélé que - contrairement au LPS - le lipide cationique ne nécessite pas de CD14 pour exercer son activité immunostimulatrice. Cependant, la présence du co-récepteur module l'activation de TLR4 et des expériences de spectroscopie infrarouge suggèrent une interaction directe entre le lipide et le CD14. <p>Dans le cas de la détection de LPS, le CD14 est nécessaire pour l'endocytose de TLR4 et l'activation subséquente de la voie TRIF. En bloquant le mécanisme d'endocytose à différents stades, nous avons montré que la diC14-amidine active - contrairement au LPS - les deux cascades de signalisation depuis l'intérieur des vésicules endosomiales, mais à des stades différents du processus d'endocytose.<p>En conclusion, bien que les réponses immunologiques causées par la diC14-amidine et le LPS se ressemblent, notre recherche a mis en évidence des différences substantielles dans leurs modes d'action. Ces différences illustrent le caractère unique de la diC14-amidine et son potentiel comme outil pour explorer la complexité du système de signalisation du TLR4 et en tirer des enseignements qui permettront de contribuer à la conception de nouveaux immunomodulateurs pour la vaccination et la thérapie. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Abstract Mediators of epithelial permeability, angiogenesis and invasion may serve as prognostic indicators and targets for therapies in esophageal cancer (EC). The expressions of claudins, hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), nitric oxide synthases (iNOS, eNOS, nNOS) and toll-like receptor 9 (TLR9) were evaluated by immunohistochemistry in EC. The results were compared with clinicopathological variables, tumor proliferation and apoptosis. All of the claudins were expressed in most of the cancers. Esophageal adenocarcinomas (EAC) displayed more often increased claudin 3 and 5 expression than esophageal squamous cell carcinomas (ESCC). Loss of claudin 3 expression associated with distant metastases in EC and a tendency in this direction was also observed for claudin 4. Cancers with stronger claudin 4 expression showed increased apoptosis in both EAC and ESCC. HIF-1α was present in most of the ECs and like iNOS more often in ESCC than in EAC. Strong HIF-1α expression tended to associate with positive VEGF immunostaining. In ESCC, both strong HIF-1α expression and VEGF positivity tended to associate with increased microvessel density (MVD). In EAC, tumors showing VEGF positivity associated with increased MVD outside the tumor. Patients with strong HIF-1α expression had more often distant metastases than other patients in EC. There was no VEGF expression in normal esophageal mucosa and T3-4 tumors tended to be more often VEGF positive than T1-2 tumors. The expression of TLR9 was more intensive in dysplasia than in normal epithelium and ESCC and abundant TLR9 expression could serve as a marker of squamous cell high grade dysplasia. Intensive TLR9 expression was associated with higher grade tumors and the presence of nodal and distant metastases in ESCC. EC and its progression may be related to increased angiogenesis regulated by VEGF and HIF-1α. In EC, claudin expression varies along with the histology of the tumor. Claudin expression may be associated with apoptosis or proliferation and contribute to tumor behavior. An association was detected between moderate to strong expression of claudin 3 and a high TLR9 histoscore in ESCC. Altered expression of claudin 3 may result to upregulation of endosomal TLR9. TLR9 may serve as a marker for squamous cell dysplasia and ESCC progression. / Tiivistelmä Solukerrosten läpäisevyyttä, verisuonten uudismuodostusta ja kasvainsolujen liikkuvuutta säätelevät tekijät voivat toimia ruokatorvisyövän ennustetekijöinä ja hoidon kohteina. Tässä tutkimuksessa selvitettiin klaudiinien, hypoksia-indusoituvan tekijän 1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijän A (VEGF), kolmen typpioksidisyntaasin (iNOS, eNOS ja nNOS) sekä tollin kaltaisen reseptorin 9 (TLR9) ilmentymistä ja merkitystä ruokatorvisyövässä immunohistokemiallisin menetelmin. Tuloksia arvioitiin suhteessa proliferaatioon ja apoptoosiin. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät jokaista tutkittua klaudiinia. Ruokatorven rauhassyövässä ilmeni levyepiteelisyöpää useammin klaudiineja 3 ja 5. Klaudiinin 3 vähäinen ilmentyminen oli yhteydessä etäpesäkkeiseen tautiin. Sama suuntaus näkyi klaudiinin 4 kohdalla. Apoptoosia todettiin enemmän kasvaimissa, jotka ilmensivät muita enemmän klaudiini 4:ä. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät HIF-1α:a. Sekä iNOS että HIF-1α ilmentyivät runsaammin levyepiteeli- kuin rauhassyövässä. Tutkimus viittasi yhteyteen voimakkaan HIF-1α:n ilmentymisen ja VEGF:n ilmentymisen välillä. Voimakas HIF-1α:n ilmentyminen ja VEGF:n ilmentyminen vaikuttivat liittyvän ruokatorven levyepiteelisyövän uudissuonituksen lisääntymiseen. Rauhassyövän lisääntynyt uudissuonitus kasvaimen ulkopuolella saattaa liittyä VEGF:n ilmentymiseen. Potilailla, joiden kasvaimissa HIF-1α:n ilmentyminen oli voimakasta, todettiin etäpesäkkeitä muita useammin. VEGF:a ei todettu normaalissa limakalvossa, ja sen ilmentyminen vaikutti olevan yleisempää syvälle kasvavissa kuin pinnallisissa syövissä. TLR9 ilmentyi voimakkaammin levyepiteelin dysplasiassa kuin normaalissa tai kasvainepiteelissä. Huonosti erilaistuvissa ja levinneissä kasvaimissa TLR9 ilmentyi voimakkaammin kuin muissa kasvaimissa. Ruokatorvisyövän synty ja eteneminen voivat liittyä HIF:n ja VEGF:n säätelemään verisuonten uudismuodostukseen. Klaudiinit saattavat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen myös apoptoosin ja proliferaation kautta. Tutkimuksessa todettiin yhteys lisääntyneen klaudiinin 3 ilmentymisen ja voimakkaasti ilmentyvän TLR9:n välillä. Muutos klaudiinin 3 ilmentymisessä saattaa lisätä levyepiteelin läpäisevyyttä johtaen TLR9:n aktivoitumiseen. TLR9 voi vaikuttaa ruokatorven levyepiteelin dysplasian ja syövän syntyyn sekä toimia vaikean dysplasian ja aggressiivisen levyepiteelisyövän merkkiaineena.

Tyrphostine stellen eine Klasse synthetischer Protein-Tyrosin-Kinase (PTK)-Hemmer, die sich strukturell vom Tyrosin ableiten und dazu dienen, spezifisch Substratphosphorylierungen zu verhindern. Tyrphostin AG126 zeigte entzündungshemmende Eigenschaften in zahlreichen Tiermodellen von Erkrankungen. Dies schließt den septischen Schock ein, der durch Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien induziert werden kann, sowie die durch Zellwandstrukturen Gram-positiver Bakterien ausgelöste bakterielle Meningitis. Wir zeigen nun positive AG126-Effekte in einer weiteren ZNS-Komplikation, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) als einem Modell der Multiplen Sklerose, wo AG126-Behandlung die klinischen Symptome und Myelinschäden mildert. Auf zellulärer Ebene beeinflusst AG126 eine Vielzahl von Funktionen der Mikroglia, der ZNS-Makrophagen, die durch Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLR s) ausgelöst werden. Diese Rezeptoren der angeborenen Immunität erkennen mikrobielle Strukturen sowie Faktoren, die durch Gewebeverletzungen generiert werden. Mit dem Fokus auf Mikroglia untersuchte die vorliegende Arbeit erstmals molekulare Zielstrukturen und Mechanismen des AG126. AG126 beeinflusst besonders Geninduktionen, die vom Adaptorprotein MyD88, einem der zwei TLR-Signalwege, abhängen. Bruton s Tyrosin-Kinase (BTK), eine MyD88-assoziierte PTK, kann von AG126 in molekularen und zellbasierten Assays gehemmt werden. Diese Hemmung kann allerdings nicht das gesamte Spektrum der AG126-Effekte erklären. Daher müssen alternative, sogar PTK-unabhängige Mechanismen, in Betracht gezogen werden, basierend auf strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zu Tyrosin-abgeleiteten und/oder mikrogliaaktiven Molekülen. Diese alternativen Mechanismen umfassen Prinzipien, die für Antioxidantien, adrenerge Agonisten, Glukokortikoide oder Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung bekannt sind. Tatsächlich zeigen Analysen auf der Grundlage von Kernspinresonanzspektroskopie, dass AG126 in die Hauptprodukte 3-Hydroxy-4-Nitroben zaldehyd (BZ) und Malononitril (MN) zerfallen kann, von denen MN, aber nicht BZ, die AG126-Effekte in Mikroglia imitiert. Ein ähnliches Verhalten zeigen weitere Tyrphostine, die ebenfalls das kritische MN-Strukturmotiv aufweisen. Tierexperimente zeigen schließlich, dass nur AG126 als Ausgangstruktur, nicht aber MN oder BZ, das Gesamtspektrum protektiver Effekte in der EAE vermittelt. Die Identifizierung des eigentlichen von AG126 bzw. von MN beeinflussten Targets könnte somit einen wesentlichen Mechanismus für die Entwicklung von entzündungshemmenden Verbindungen offenlegen.