Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:09:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338959.pdf: 2630801 bytes, checksum: 1fe313f811f3f373047ae5985be6a34f (MD5) Previous issue date: 2015 / As abelhas são conhecidas por suas ferroadas e produção melífera, mas raramente são reconhecidas por uma determinada proteína benevolente em seu veneno chamada melitina. A melitina é um peptídeo hemolítico antimicrobiano amplamente conhecido pelos seus efeitos terapêuticos. O interesse nas propriedades medicinais, especialmente na propriedade anticancerígena da melitina, tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Porém, visto que alguns dos constituintes do veneno de abelha podem apresentar ação deletéria, decorrente do seu potencial alergênico, faz-se necessária a obtenção de melitina com elevado grau de pureza para eficiente aplicação na área farmacêutica. O presente trabalho teve o objetivo principal de desenvolver um processo para obtenção de melitina em escala analítica visando a aplicação deste peptídeo em formulações farmacêuticas, produzindo, desta forma, produtos com elevada tecnologia e valor agregado. A utilização de técnicas robustas, como ultracentrifugação e filtração, permitiu eliminar a maioria dos componentes presentes no veneno, contendo, ao final, somente biomoléculas com propriedades físico-químicas semelhantes à melitina. A utilização destas técnicas, em conjunto com RP-HPLC, permitiu obter melitina com um alto grau de pureza em escala analítica. Dessa forma, foi elaborado um protocolo de purificação da melitina, alcançando-se uma pureza estimada maior que 85 %. A análise econômica do processo de purificação da melitina demonstrou a viabilidade econômica na implantação desta tecnologia. O menor custo específico ocorre com a ampliação da escala a partir de 100 vezes a escala analítica, no qual o custo encontrado, nas condições operacionais propostas, é inferior ao aplicado atualmente. Ainda, é possível otimizar o processo visando melhor rendimento. A elaboração de um sistema de entrega controlada da melitina a partir de nanopartículas lipídicas sólidas foi proposta neste trabalho. Os resultados obtidos até o momento mostram que é possível obter NLSs estáveis de ácido esteárico com potencial aplicabilidade para encapsulação de melitina. Para a comprovação de eficiência farmacológica desse sistema proposto, uma avaliação adequada é necessária.<br> / Abstract : Honeybees are famous for their stings and sugary residues, yet seldom do they gain recognition for a certain benevolent protein in their venom called melittin. Melittin is an antimicrobial hemolytic peptide widely known for its therapeutic remedies. Interest in the medicinal properties, especially the anticancer property of melittin, has increased tremendously in recent years. However, since some of bee venom constituents can have deleterious effects, because of its allergenic potential, it is necessary to obtain melittin with high purity for its effective application in the pharmaceutical field. This study had the main objective to develop a process for obtaining melittin in analytical scale aiming the pharmaceutical application of this peptide, producing thus products with high technology and added value. The use of robust techniques such as ultracentrifugation and filtration allowed to eliminate most of the components present in the venom, remaining in the sample after these steps, only biomolecules with similar features to melittin. The use of these techniques in conjunction with RP-HPLC allowed obtaining melittin with a high degree of purity on an analytical scale. Thus, we designed a purification protocol for melittin, achieving an estimated purity greater than 85 %. The economic analysis of the melittin purification process showed the economic viability of the implementation of this technology. The lower specific costs occur with the scale-up from 100 times the analytical scale, in which the costs found within the operating conditions proposed are lower than those currently marketed. It is still possible to optimize the process to better performance. The development of a delivery vehicle of melittin based on solid lipid nanoparticles was proposed in this paper. The results obtained so far show that it is possible to obtain stable NLSs of stearic acid with potential applicability for encapsulation of melittin. For demonstrating pharmacological effectiveness of this proposed system, more tests are needed.

Orientador : Profª. Drª. Andréa Emilia Marques Stinghen / Coorientador : Profª. Drª. Wesley Maurício de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 16/02/2016 / Inclui referências : f. 54-61 / Resumo: p-Cresil Sulfato (PCS) e Indoxil Sulfato (IS) são toxinas urêmicas ligadas à proteínas, responsáveis por muitas das consequências clínicas da uremia, tais como a disfunção endotelial na doença renal crônica (DRC). Os transportadores de ânions orgânicos (OATs), representam uma família de transportadores que medeiam a absorção de uma vasta gama de moléculas e também de toxinas urêmicas por células tubulares proximais. No presente estudo investigamos a captação de PCS e IS por OAT1 e OAT3 em células endoteliais vasculares humanas. O PCS foi sintetizado a partir de seu precursor p-cresol através de sulfatação utilizando ácido clorossulfônico/KOH a fim de obter um sal de potássio. A caracterização do PCS foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), espectrometria de massa (EM) e Ressonância Magnética Nuclear de H1 e C13. As células endoteliais humanas foram tratadas com as concentrações normal, urêmica e urêmica máxima de PCS (0,08, 1,75 e 2,6 mg/L) e IS (0,6, 53 e 236 mg/L) respectivamente, com e sem Probenicid (Pb), comumente utilizado como agente uricosúrico, e descrito como um inibidor de OATs. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). A captação de PCS e IS foi avaliado em extratos de células endoteliais à 4 e 37ºC por CLAE. OAT1 e OAT3 foram avaliados por western blot e imunocitoquímica. A expressão da quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) foi avaliada por ELISA em sobrenadante de células endoteliais tratadas com PCS e IS com e sem Pb após cinética de 0, 3 e 6 h. A viabilidade celular diminuiu significativamente após 24 h de tratamento com PCS (P<0,05) e IS (P<0,001) de uma forma dose dependente para IS, e foi restabelecida após o tratamento com Pb. A captação de PCS e IS analisados por CLAE mostrou que a 37ºC ocorre a internalização celular de PCS e IS, e quando o Pb foi adicionado, houve a inibição da captação para ambas as toxinas, o que sugere que os OATs estão envolvidos na captação e transporte celular de PCS e IS. Além disso, à 4ºC foi observada uma internalização diminuída. A análise por western blot e imunocitoquímica mostraram que tanto OAT1 quanto OAT3 estão envolvidos na captação de PCS e IS em células endoteliais, com maior expressão de OAT1. A expressão de MCP-1 foi aumentada após 3 e 6 h de tratamento com PCS e IS, mas diminuiu após o tratamento com Pb. Em conclusão, PCS e IS servem como substratos para OATs em células endoteliais humanas e sua captação é mediada por estes transportadores. O bloqueio seletivo dos OATs pode servir como uma estratégia terapêutica para inibir a expressão de biomarcadores inflamatórios vasculares, tais como a quimiocina MCP-1, uma das principais moléculas no processo de aterosclerose urêmica. Nossos resultados podem ser úteis para melhor compreender os mecanismos celulares e moleculares da toxicidade urêmica em pacientes com DRC e reverter em novas estratégias terapêuticas nestes pacientes. Palavras-chave: toxicidade urêmica, p-cresil sulfato, indoxil sulfato, OATs, captação. / Abstract: Protein bound uremic toxins such as p-cresyl sulfate (PCS) and indoxyl sulfate (IS) are responsible for many of the uremia clinical consequences, such as endothelial dysfunction in chronic kidney disease (CKD) patients. Organic anion transporters (OATs), are a family of transporters that mediate the uptake of a wide range of molecules, and have being enrolled in the uptake of uremic toxins on e.g. proximal tubular cells. In this study we investigated whether OAT 1 and OAT 3 are enrolled in the uptake of PCS and IS in human vascular endothelial cells. PCS was synthesized by p-cresol sulfatation using chlorosulfonic acid/KOH in order to obtain a potassium salt, and characterized by high performance liquid chromatography (HPLC), mass spectrometry (MS) and 13C and 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra. Indoxyl sulfate was purchased commercially. Human endothelial cells (E.A.hy 926 - ATCC CRL 2922) were treated with normal, uremic and maximum uremic concentrations of PCS (0.08 mg/L, 1.75 mg/L and 2.6 mg/L) and IS (0.6 mg/L, 53 mg/L and 236 mg/L) respectively, with and without Probenicid (Pb), commonly used as a uricosuric agent and described as an OAT inhibitor. Cell viability was assessed by MTT. The PCS and IS up take was analyzed in endothelial cells extracts at 4°C and 37°C by High-performance liquid chromatography (HPLC). OAT 1 and OAT 3 were assessment by western blot and immunocytochemistry. Cell viability decreases after 24h of PCS (P<0,05) and IS (P<0,001) treatment in a dose dependent manner. The uptake of PCS and IS in cells extracts analyzed by HPLC, showed that at 37 ºC the cell internalization occurs for PCS and IS and when Pb was added, there was no evidence of both toxins, suggesting that OATs are involved in the active cellular transport of PCS and IS. In addition no uptake activity was noted at 4°C. Western blot and immunocytochemistry analysis showed that both OAT1 and OAT3 are involved in the uptake of PCS and IS in endothelial cells, with larger contribution by OAT1. MCP-1 expression increased after 3 and 6h of PCS and IS treatment, but decreased after Pb treatment. In conclusion, PCS and IS serve as OATs substrates in human endothelial cells and their uptake is mediated by OATs. The selective blockage of OATs could serve as a therapeutic strategy to inhibit he expression of vascular inflammatory biomarkers, such as Protein MCP-1, one of the main molecules in the uremic atherosclerosis process. Our findings could be useful to better understand the cellular and molecular mechanisms of uremic toxicity in CKD patients. Key-words: uremic toxicity, p-cresyl sulfate, indoxyl sulfate, OATs, uptake.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-02Bitstream added on 2014-06-13T20:06:47Z : No. of bitstreams: 1 salerno_t_dr_botfmvz.pdf: 1479294 bytes, checksum: 37333e3500ad6a6f49d6aabf4f562cf3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente estudo avaliou a qualidade microbiológica, as características físicoquímicas e a presença de resíduos de antimicrobianos em leite de mulheres, vacas e cabras, bem como investigou a multirresistência bacteriana à antimicrobianos e a detecção de genes e produção de toxinas em linhagens de Staphylococcus spp. Foram colhidas 240 amostras de leite de mulheres encaminhadas ao Banco de Leite Humano (BLH) de Botucatu, SP, 200 amostras de leite de vacas com mastite e 200 de vacas sem mastite. Iguais quantidades de amostras de leite foram colhidas de cabras com e sem mastite. Dentre os tetos amostrados de vacas e cabras com mastite, 85,50% e 97,50% respectivamente acusaram mastite subclínica no CMT. A mastite clínica foi observada em 14,50% dos tetos de vacas e 2,50% dos tetos de cabras amostrados. A presença de micro-organismos em leite de vacas e cabras sem mastite foi verificada em cerca de 25,00% das amostras de leite testadas, alertando para a presença de animais portadores de patógenos no rebanho. A acidez dornic do leite de mulheres revelou que 95,42% encontraram-se dentro dos limites aceitáveis pela Rede Nacional de BLH. O aporte calórico do leite humano (LH) apresentou ampla variação nos teores de creme, gordura e valor energético. A acidez dornic do leite de vacas e cabras com e sem mastite apresentaram ampla variação indicando que outros fatores, além da contaminação microbiana do leite, podem interferir nos índices de acidez titulável. Staphylococcus spp. e Enterobacter spp. foram os isolados mais frequentes em amostras de LH. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. e Corynebacterium bovis foram os micro-organismos mais comumente... / The present study evaluated the microbiological quality, the characteristics physicist-chemistries and the presence of antimicrobials residues in milk of women, cows and goats, as well as investigated the bacterial multidrug resistance and the detection of genes and/or toxin production in Staphylococcus spp. strains. Was collected 240 milk samples from women referred to the Human Milk Bank (HMB) in Botucatu, 200 milk samples from cows with mastitis and 200 cows without mastitis. Equal amounts of milk samples were collected from goats with and without mastitis. Among the sampled cows and goats teats with mastitis, 85.50% and 97.50% respectively accused subclinical mastitis on CMT. Clinical mastitis was observed in 14.50% of cows teats and 2.50% of the sampled goats teats. The presence of microorganisms in milk from cows and goats without mastitis was found in about 25.00% of the milk samples tested, warning of the presence of pathogens from animals in the herd. Dornic acidity of woman’s milk revealed that 95.42% were within acceptable limits by the National Network of HMB. Calorie intake of human milk (HM) showed wide variation in the amounts of cream, fat and energy value. Dornic acidity of cows and goats milk with and without mastitis showed wide variation indicating that other factors in addition to microbial contamination of milk can interfere with acidity indices. Staphylococcus spp. and Enterobacter spp. were the most frequently isolated in samples of human milk. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. and Corynebacterium bovis were the microorganisms most commonly isolated in milk cows with and without mastitis. In milk samples from goats with and without... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:49Z : No. of bitstreams: 1 000820049_20160815.pdf: 588270 bytes, checksum: afe0d576cdb35b1831800d1f558c88d0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-15T13:42:02Z: 000820049_20160815.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-15T13:42:37Z : No. of bitstreams: 1 000820049.pdf: 2105902 bytes, checksum: 4babbf05a831bb8f239b3365414bc5f7 (MD5) / O sistema ParE-ParD, identificado no plasmídeo RK2 de uma ampla gama de hospedeiros, é um sistema toxina-antitoxina (TA), sendo ParE (103 aminoácidos) a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE pela formação de um complexo estável, que também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. ParE possui atividade citotóxica na replicação do DNA por interferir no mecanismo de ação da DNA girase. Diversos estudos demonstraram que ParD consiste de duas regiões estruturalmente distintas: uma N-terminal, bem ordenada que consiste no sitio de ligação do DNA e outra C-terminal, não estruturada, onde sugere-se ocorrer a ligação da toxina. Em relação à ligação com a toxina, um modelo atual de reconhecimento e ligação em sistemas TA invoca uma transição de fases desordenada-ordenada, na parte C-terminal da antitoxina, porém faltam dados que confirmem se este modelo de transição de fases desordenada-ordenada também pode ser aplicado para o sistema ParE-ParD. Neste sentido, este trabalho objetivou o design, a síntese e o estudo de interação de peptídeos derivados da toxina ParE, com peptídeos derivados da antitoxina ParD. Com base nas informações estruturais destas proteínas, sequências peptídicas derivadas de ParE e ParD foram projetadas, com o propósito de encontrar a estrutura mínima de ParD capaz de neutralizar a ação tóxica de ParE. As sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por HPLC e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação dos peptídeos foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca dos peptídeos denominados ParEAC2 e ParEAC3 foi suprimida pelos derivados de ParD, evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados... / The ParE-ParD system represents a toxin-antitoxin module of the broad host range plasmid RK2. ParE (103 amino acids) is the toxin, whereas ParD (83 amino acids) constitutes the antidote able to neutralize ParE by forming a stable complex that is also effective in the autorepression of the parDE operon. The ParE toxin inhibits DNA gyrase activity and thereby blocks DNA replication. Several studies have shown that ParD consists of two structurally distinct regions: an N-terminal, orderly, consisting of the DNA binding site and another C-terminus, unstructured, where it is suggested to occur toxin binding. For binding with toxin, a current model of recognition and binding in TA systems invokes a disorder-to-order transition in the antitoxin. Specifically, a disordered region of the free antitoxin is organized into a well-defined secondary structure upon binding to its cognate toxin. But, no available data that proves the application of disorder-to-order transition model for ParE-ParD system. Therefore, this work aims to study the interaction of the ParE protein and its analogues with peptides from ParD antitoxin. Based on the structural information's of these proteins, peptide sequences derived from ParE and ParD were designed in order to find the minimal ParD structure able to neutralize the toxic effect of ParE. The peptide sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by HPLC and characterized by mass spectrometry. The interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence quenching assays. The intrinsic fluorescence of the denominated ParEAC2 and ParEAC3 peptides was quenched by ParD derivatives, evidencing complex formation, results confirmed by affinity chromatography assays. Molecular Docking studies demonstrated that the interaction mode of ParEAC3-ParDAC3 complex was consistent with the obtained crystallographic complex ParE-ParD of...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2014-11-10T11:58:06Z : No. of bitstreams: 1 000783734_20160226.pdf: 349028 bytes, checksum: 6abc5bb1ce5dd6080f4e0a4d82b47b78 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:46Z: 000783734_20160226.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:45Z : No. of bitstreams: 1 000783734.pdf: 302036 bytes, checksum: 895ef9f5475395e674ad28f06f70556b (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-12T12:00:48Z: 000783734_int.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-12T12:01:21Z : No. of bitstreams: 1 000783734.pdf: 1329260 bytes, checksum: e33025609c90ab9da8a389d79e472b4f (MD5) / Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus são considerados patógenos oportunistas, cujas infecções estão principalmente associadas à produção de biofilme. As enterotoxinas, superantígenos relacionados a intoxicações alimentares, e as hemolisinas, moléculas capazes de causar lise de membranas celulares, parecem estar associadas à patogênese das infecções estafilocócicas, apesar de ainda ser questionado se elas constituem fatores de virulência importantes nesses organismos. O uso indiscriminado de antimicrobianos vem selecionando cepas resistentes à oxacilina com menor suscetibilidade à vancomicina. A resistência à oxacilina é codificada pelo gene mecA, contido em um elemento genético móvel, denominado SCCmec. Novos antimicrobianos, como a linezolida, tigeciclina, daptomicina e quinupristina/dalfopristina vêm sendo empregados no tratamento de infecções por estafilococos multirresistentes. Este estudo objetivou caracterizar S. epidermidis e S. haemolyticus isolados de hemoculturas quanto à presença de genes de hemolisinas, enterotoxinas, suscetibilidade aos antimicrobianos e perfil clonal. Cento e sessenta e nove isolados foram pesquisados quanto à presença do gene mecA por PCR em tempo real, estando presente em 100% dos S. haemolyticus e 92,9% dos S. epidermidis, cujos tipos de SCCmec mais frequentes, determinados por PCR Multiplex, foram, respectivamente, I e III. Os MICs (Concentração Inibitória Mínima) de linezolida, tigeciclina, daptomicina, quinupristina/dalfopristina e vancomicina foram obtidos por Etest® e revelaram 4,7% de isolados resistentes à tigeciclina, 1,2% resistentes ou com resistência intermediária à quinupristina/dalfopristina, sendo o MIC máximo de vancomicina igual a 3 μg/ml. A microdiluição em caldo para vancomicina mostrou MICs de 0,25 a 2 μg/ml, concordando em 88,2% com os resultados obtidos com Etest®. A tipagem por PFGE... / Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus are opportunistic pathogens that cause infections which are mainly related to the formation of a biofilm. Enterotoxins, superantigens related to food poisoning and hemolysins, molecules able to lyse mammalian cells, seem to be involved in the pathogenesis of staphylococcal infections, although the question remains whether they represent important virulence factors in these organisms. The indiscriminate use of antimicrobial drugs has selected strains that are resistant to oxacillin, in addition to isolates with reduced vancomycin susceptibility. Oxacillin resistance is encoded by the mecA gene which is carried on a mobile genetic element, SCCmec. New antimicrobial drugs such as linezolid, tigecycline, daptomycin and quinupristin/dalfopristin are being used for the treatment of infections caused by multidrug-resistant staphylococci. The objective of this study was to characterize S. epidermidis and S. haemolyticus strains isolated from blood cultures regarding the presence of hemolysin and enterotoxin genes, antimicrobial susceptibility, and clonal profile. Investigation of the mecA gene by real-time PCR in 169 isolates revealed the presence of the gene in 100% of S. haemolyticus isolates and 92.9% of S. epidermidis. The most frequent SCCmec types determined by multiplex PCR were types I and III, respectively. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of linezolid, tigecycline, daptomycin, quinupristin/dalfopristin and vancomycin determined by the Etest® showed that 4.7% of the isolates were resistant to tigecycline and 1.2% were resistant or intermediate resistant to quinupristin/dalfopristin. The maximum MIC for vancomycin was 3 μg/ml. Broth microdilution revealed vancomycin MICs of 0.25 to 2 μg/ml, showing 88.2% agreement with the Etest results. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) typing revealed the presence of S. epidermidis ...

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-08T17:02:11Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-05T13:04:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T13:04:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) Previous issue date: 2018-06-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / Os escorpiões, pertencentes ao filo Arthropoda, representam aproximadamente 1,5% das espécies presentes na classe dos aracnídeos. No Brasil, existem diversas espécies de escorpiões presentes em todas as regiões, dentre eles os que mais se destacam são os pertencentes ao gênero Tityus devido à sua grande distribuição geográfica e importância médica. Dentre eles, uma espécie que se destaca é o Tityus fasciolatus mais presente na região central do Brasil. Essa espécie de escorpião, assim como as outras, possui uma peçonha extremamente complexa formada por uma série de compostos, e dentre eles estão os peptídeos conhecidos como neurotoxinas capazes de interagir e afetar o funcionamento dos canais de sódio dependentes de voltagem, responsáveis pela iniciação e propagação dos potenciais de ação. A peçonha do escorpião Tityus fasciolatus foi coletada e submetida ao fracionamento utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC). As frações obtidas foram analisadas em espectrômetro de massa (MALDI-TOF) a fim de identificar o peptídeo de interesse, que teve sua sequência determinada e sua atividade testada nos sete subtipos de canais de sódio de mamíferos e em canais de sódio de inseto e aracnídeo por meio da técnica de patch-clamp em configuração voltage clamp. O peptídeo purificado denominado Tf1a foi capaz de alterar a cinética de todos os subtipos de canais de mamífero e, ainda, agir sobre os canais de inseto e de aranha modificando também seu funcionamento. O efeito observado permite classificar a toxina Tf1a como uma β-toxina escorpiônica do tipo like. Sendo assim esse trabalho foi capaz de descrever uma nova neurotoxina purificada da peçonha de um escorpião e caracterizar a sua atividade em diversos tipos de canais iônicos, colaborando assim com o entendimento da ação destes peptídeos. / Scorpions, belonging to the Arthropoda phylum, represent approximately 1.5% of the species present in the Arachnidae class. There are several species of scorpions present in all regions of Brazil, among them the ones that stand out most are those belonging to the genus Tityus thanks to its great geographic distribution and medical importance. Between them, one species that stands out is the Tityus fasciolatus most present in the central region of Brazil. This species of scorpion, like the others, has an extremely complex venom formed by a several compounds. Among them are the peptides also known as neurotoxins capable of interacting and affect the functioning of the voltagegated sodium channels, responsible for the initiation and propagation of the action potential. The venom of the scorpion Tityus fasciolatus was collected and submitted to fractionation using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) technique. The fractions obtained were analyzed by mass spectrometer (MALDI-TOF) to identify the peptide of interest, which had its sequence determined and its activity tested on the seven subtypes of mammalian sodium channels and on insect and arachnid sodium channels by the use of the patch-clamp technique in voltage clamp configuration. The purified peptide named Tf1a was able to change the kinetics of all subtypes of mammalian channels and also act on the insect and arachnid channels, modifying their normal functioning. The effects caused allows us to classify the toxin Tf1a as a β-like scorpion toxin. Thus, this work was able to describe a new neurotoxin purified from the venom of a scorpion and characterize its activity in several types of ion channels, thus collaborating with the understanding of the action of these peptides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-23T19:58:37Z No. of bitstreams: 1 2015_EliasFerreiraSabiáJunior.pdf: 2573495 bytes, checksum: a427160f631b1cd7d6dc2a361354a78f (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-24T14:53:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_EliasFerreiraSabiáJunior.pdf: 2573495 bytes, checksum: a427160f631b1cd7d6dc2a361354a78f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-24T14:53:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_EliasFerreiraSabiáJunior.pdf: 2573495 bytes, checksum: a427160f631b1cd7d6dc2a361354a78f (MD5) / A bactéria Gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt) é amplamente conhecida devido à sua grande importância no controle biológico, graças à sua capacidade de produzir inclusões cristalinas formadas por proteínas inseticidas (Cry e Cyt), ativas contra um amplo espectro de insetos. Uma nova atividade foi relatada para cristais sem atividade inseticida, a citotoxicidade contra células cancerosas humanas. Essas proteínas citotóxicas, chamadas de Parasporinas (PS), não são hemolíticas e são estruturalmente diferentes das proteínas Cry e Cyt. Até o momento, seis grupos de PS foram identificadas, com base na homologia das suas sequências de aminoácidos. As Parasporinas apresentam modo de ação diferente entre as famílias, assim como diferente espectro citotóxico e nível de atividade. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia possui uma Coleção de Bacillus spp. que conta com aproximadamente 2500 isolados. Esse trabalho teve como objetivo identificar, entre as estirpes dessa coleção, genes da família de Parasporinas através de diferentes marcadores moleculares, analisar o perfil proteico dessas estirpes, a possível produção de β-exotoxinas, avaliar sua toxicidade para linhagens de células tumorais, analisar a influência dessas proteínas no padrão de migração celular de linhagens de câncer e as possíveis alterações morfológicas causadas pelas toxinas Parasporinas nas células tumorais suscetíveis. Duzentos e sessenta e nove estirpes foram selecionadas aleatoriamente do banco de bactérias e triadas com os iniciadores específicos desenhados para identificação dos diferentes genes de Parasporina. Trinta e cinco estirpes apresentaram padrões de amplificação para esses genes, dentre estes, 30 isolados obtiveram amplificações para o gene parasporina 1, enquanto 5 isolados para o gene parasporina 3. O perfil proteico sugere que as proteínas secretadas por algumas estirpes possuem o tamanho esperado para o grupo de Parasporina (aproximadamente 81 e 88 kDa para as famílias 1 e 3, respectivamente). Nenhuma das estirpes positivas por PCR apresentou produção de β-exotoxinas. As proteínas das estirpes testadas não mostraram toxicidade contra as linhagens tumorais DU-145 e HeLa. A proteína PS1 da estirpe S1338 mostrou toxicidade específica a células tumorais de mama MCF-7, alterando sua morfologia após 24 horas do tratamento com a toxina ativa, sugerindo que o tipo de morte celular envolvendo a Parasporina 1 seja por apoptose. Nenhuma alteração significativa no padrão de migração das células MCF-7 pode ser observada após o tratamento com a toxina. Desta forma, nossos dados sugerem que a Parasporina 1 produzida pela estirpe S1338 possui características únicas e especificidade contra a linhagem MCF-7 de adenocarcinoma de mama. Estudos mais aprofundados sobre o mecanismo de ação desta toxina, bem como sobre o possível receptor nas células suscetíveis, poderão tornar viável a utilização das Parasporinas como terapia alternativa para o tratamento de câncer, ou até mesmo como ferramenta molecular para o diagnóstico dessa doença. / The Gram-positive bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) is widely known for its importance on biological control, due to their hability to produce crystalline inclusions formed by insecticide proteins (Cry e Cyt), active against a broad range of insects. A new activity was reported for crystals without insecticide activity, the cytotoxic against human cancer cells. These cytotoxic proteins are known as Parasporins (PS), are not hemolytic and have different structure from the Cry and Cyt proteins. So far, six classes of PS were identified, based on the homology of their aminoacids sequences. The Parasporins have different mode of action among theirs families, as well as different cytotoxic range and level of activity. The Embrapa Genetic Resources and Biotechnology has a collection of Bacillus spp. with approximately 2500 isolates. This work aims to identify, among the strains of this collection, genes of Parasporin families through different molecular markers, analyse the protein profile of strains, the possible production of β-exotoxins, evaluate its toxicity to tumor cells line and the possible morphological changes caused by the toxins Parasporins in susceptible tumor cells. Two hundred and sixty-nine strains were selected randomly on the bacteria bank, and were screened with specific primers to identify the different Parasporin genes. Thirty-five strains showed amplification patterns, of which, 30 isolates showed amplification to the parasporin 1 gene, and other 5 isolates to parasporin 3 gene. The protein profile suggested that the secreted proteins by some strains has the expected size to the group of Parasporin (approximately 81 and 88 kDa for the family 1 and 3, respectively). None of the positive strains identified by PCR showed β-exotoxins production. The protein of the tested strains didn’t show toxicity against tumor lines DU-145 and HeLa. The protein PS1 from the strain S1338 showed specific toxicity against breast cancer cells MCF-7, changing their morphology after 24 hours of treatment with active toxin, suggesting that the type of cell death involving Parasporina 1 is through apoptosis. No significant alteration in the patterns of MCF-7 cell migration could be observed after treatment with the toxin. Therefore, our data suggest that Parasporin 1 from S1338 strain has unique characteristics and specificity against MCF-7 cell line of breast adenocarcinoma. Further studies on the mode of action involving this toxin, and the possible receptor of susceptible cells, can make the use of Parasporin feasible as an alternative therapy in cancer treatment, or even as a molecular tool for the diagnosis of the disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-10-27T10:33:17Z No. of bitstreams: 1 2015_IgorDeOliveiraPoty.pdf: 923333 bytes, checksum: c7ebab31ea778a96493f6f986d77be55 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-16T13:33:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_IgorDeOliveiraPoty.pdf: 923333 bytes, checksum: c7ebab31ea778a96493f6f986d77be55 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-16T13:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_IgorDeOliveiraPoty.pdf: 923333 bytes, checksum: c7ebab31ea778a96493f6f986d77be55 (MD5) / O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença de Clostridium perfringens em 54 amostras de carne bovina embaladas a vácuo comercializadas no Distrito Federal e Entorno, bem como detectar a produção da toxina cpe por PCR, ainda avaliar os meios de cultivo agar SPS® e agar TSC®, com e sem etapa de pré-enriquecimento das amostras em caldo infusão de cérebro e coração (BHI), e incubação tanto em jarra de anaerobiose quanto em câmara de anaerobiose. Na análise da incubação em Agar SPS® e TSC®, sem a etapa de pré-enriquecimento em caldo BHI, observou-se o crescimento em apenas uma (1,85%) das 54 amostras analisadas, em ambos os meios de cultivo e formas de incubação. Com a etapa de pré-enriquecimento com caldo BHI em câmara de anaerobiose, observou-se crescimento em todas as 54 amostras (100%), em ambos os meios de cultivo e formas de incubação. Na reação em cadeia de polimerase (PCR) nenhuma das cepas oriundas das amostras analisadas apresentaram a amplificação de fragmento do gene da toxina cpe. Os resultados evidenciam a presença de C. perfringens em carnes embaladas a vácuo comercializadas no Distrito Federal e Entorno, porém não foi detectada a toxina cpeem nenhuma cepa isolada analisada. Na comparação estatística aplicando o teste qui-quadrado de McNemar, observou-se que houve diferença significativa (p<0,001) entre as análises sem e com a etapa de pré-enriquecimento em caldo BHI, verificando-se a influencia positiva do meio na recuperação de esporos, destacando desta forma a importância do enriquecimento prévio em meio BHI e a incubação em câmara de anaerobiose, na recuperação de esporos deste microrganismo. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective of this study was to evaluate the presence of Clostridium perfringens in vaccum packed beef samples commercialized at Distrito Federal and the Entorno area, as well as to detect the presence of the cpe toxin producing gene by Polymerase chain reaction (PCR), also evaluate the culture medium SPS® agar and TSC® agar, with and without pre-enrichment step of the samples in Brain Heart Infusion (BHI) broth, and to promote the incubation in anaerobic jar and anaerobic chamber. The results of the incubation on SPS® agar and TSC® agar, without the pre-enrichment step in BHI, growth was observed at only 1 (1,85%) of the 54 analyzed samples, in both culture media and incubation methods. With the pre-enrichment step in BHI broth at the anaerobic chamber, growth was observed in all of the 54 samples (100%), in both culture media and incubation methods. At the PCR, none of the strains detected from the analyzed samplespresented amplification of the fragment of the cpe toxin gene. The results showed the presence of C. perfringens in vaccum packed beef samples commercialized at the Distrito Federal and Entorno area, however the cpe toxin wasn’t detected in none of the analyzed samples. In statistical analysis, using McNemar’s qui-square test, a significant difference (p<0,001) was observed between the analysis with and without pre-enrichment step in BHI broth, verifying the positive influence of the medium in spore recovery, therefore to enhance the importance of the pre-enrichment stage in BHI broth and the incubation in anaerobic chamber in spore recovery for this microorganism.

Orientadora : Profª Drª Andréa Emilia Marques Stinghen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 02/08/2013 / Inclui referências / Área de concentração: Microbiologia / Resumo: O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) sao toxinas uremicas de baixo peso molecular que quando ligadas a proteinas, sobretudo a albumina, podem desencadear via NF-ƒÈB a producao da quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Essa quimiocina e responsavel pela quimioatracao de monocitos para a camada intima do vaso durante os eventos que precedem a aterosclerose. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro o papel do PC e PCS na expressao de MCP-1, via fator de transcricao NF-ƒÈB p65. O PCS foi sintetizado a partir da sulfatacao do PC com acido clorosulfonico e caracterizado por cromatografia de camada delgada (CCD). As concentracoes de PC e PCS utilizadas nos experimentos seguiu o preconizado pelo European Group of Uremic Toxins (EuTox). Sendo assim, utilizaram-se as concentracoes normais, PC1 (0,60 mg/L) e PCS1 (2,87 mg/L), minimas uremicas PC2 (20,10 mg/L) e PCS2 (15,60 mg/L) e maximas uremicas PC3 (40,70 mg/L) e PCS3 (47,20 mg/L). Como modelo experimental foram utilizadas celulas musculares lisas humanas (VSMC) extraidas atraves de digestao enzimatica de veia de cordao umbilical. A fim de avaliar a viabilidade das celulas frente as toxinas foi realizado o ensaio de MTT. Para verificar a expressao de MCP-1, as celulas foram tratadas com PC e PCS em cinetica de 0 e 3 horas nas concentracoes descritas acima. Para fins de comparacao, as VSMC tambem foram tratadas com 1 ƒÊg/mL de lipopolissacarideo (LPS), outra conhecida toxina uremica de baixo peso molecular. Todos os ensaios foram realizados na presenca e ausencia de inibidor da via NF-ƒÈB p65. Atraves do ensaio de MTT verificou-se que nao houve diferenca significativa na viabilidade celular entre o controle e todas as concentracoes testadas de PC e PCS. As VSMC expostas a PC2 e PC3 produziram niveis significativos de MCP-1 apos 3h de tratamento (149,8 } 16 pg/mL, p<0,001 e 143,5 } 28,7 pg/mL, p<0,05 respectivamente) quando comparados ao tempo 0h. PCS3 estimulou de forma mais intensa a producao de MCP-1 do que as VSMC tratadas com PC3 (162,7 } 7,5 pg/mL vs 143,7 } 28 pg/mL, p<0,005) em 3h. Na presenca do inibidor de NF-ƒÈB p65, houve uma diminuicao significativa na producao de MCP-1 apos o tratamento por 3h com PC2 (149,8 } 16 pg/mL vs 36,4 } 10,5 pg/mL; p<0,001) e PC3 (143,6 } 28 pg/mL vs 50 } 18 pg/mL; p<0,05). Apos tratamento com PCS1 houve diferenca significativa nos niveis de MCP-1 na presenca de inibidor (156,49 } 15,9 pg/mL vs 102,3 } 4,6 pg/mL; p<0,05). Apos 3h de tratamento com LPS, nao houve producao significativa de MCP-1 em relacao ao controle (35,5 } 8,9 pg/mL vs 34 } 8,9 pg/mL). Ainda, na presenca do inibidor, verificou-se uma leve diminuicao nos niveis de MCP-1, porem nao significativa (35,5 } 8,9 pg/mL vs 25,6 } 6,5 pg/mL). Com base em nossos resultados, concluimos que apesar de PC e PCS nao serem citotoxicas, induzem a expressao de niveis significativos de MCP-1, sendo o PCS mais efetivo na inducao da expressao de MCP-1 que seu precursor PC. Assim como PC e PCS, LPS tambem ativa a producao de MCP-1 via NF-ƒÈB. Desta forma sugerimos que a inibicao da via NF-ƒÈB p65 poderia diminuir niveis de MCP-1 e consequentemente a progressao do desenvolvimento da aterosclerose na DRC. Palavras chave: doenca renal cronica, toxicidade uremica, p-cresol, p-cresilsulfato, LPS, MCP-1 e NF-ƒÈB. / Abstract: p-cresol (PC) and its conjugate p-cresyl sulfate are low molecular weight uremic toxins that when attached to proteins, especially albumin, can trigger via NF-êB the production of chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). This chemokine is responsible for monocytes chemoattraction to the vessel intimal layer during the events that precede atherosclerosis. Thus, the aim of this study was to investigate the in vitro role of PC and PCS in MCP-1 expression via transcription factor NF-êB p65. PCS was synthesized from PC sulfation with chlorosulphonic acid and characterized by thin layer chromatography (TLC). The PCS and PC concentrations were used according to the recommendations of the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). So we used normal, PC1 (0.60 mg/L) and PCS1 (2.87 mg/L), uremic minimum PC2 (20.10 mg/L) and PCS2 (15.60 mg/L) and maximum uremic concentrations PC3 (40.70 mg/L) and PCS3 (47.20 mg/L). As experimental model we used human smooth muscle cells (VSMC) extracted by enzymatic digestion of umbilical cord vein. In order to assess the cells viability after toxins treatment, MTT assay was performed. To verify MCP-1 expression, cells were treated with PC or PCS in a kinetics of 0 and 3 h using the concentrations described above. For comparison purposes, the VSMC were also treated with lipopolysaccharide (LPS) (1 ìg/mL), other low molecular weight uremic toxin. All assays were performed in the presence and absence of NF-êB p65 inhibitor pathway. MTT assay showed that there was no significant difference in cell viability between control and all concentrations of PC and PCS tested. VSMC exposed to PC2 and PC3 produced significant levels of MCP-1 after 3h treatment (149.8 ± 16 pg/mL, p<0.001, and 143.5 ± 28.7 pg/mL, p<0.05 respectively) when compared to time 0h. PCS3 stimulated more intensively MCP-1 production in VSMC treated with the PC3 (162.7 ± 7.5 pg/mL vs 143.7 ± 28 pg/mL, p<0.005) after 3h. In the presence of NF-êB p65 inhibitor, there was a significant decrease in MCP-1 production after 3h treatment with PC2 (149.8 ± 16 pg/mL vs 36.4 ± 10.5 pg/mL, p<0.001) and PC3 (143.6 ± 28 pg/mL vs 50 ± 18 pg/mL, p<0.05). After PCS1 treatment there was a significant difference in MCP-1 levels in the presence of inhibitor (156.49 ± 15.9 pg/mL vs 102.3 ± 4.6 pg/mL, p<0.05). Finally after 3h treatment with LPS, there was no significant production of MCP-1 compared to control (35.5 ± 8.9 pg/mL vs 34 ± 8.9 pg/mL), and , in the presence of the inhibitor, there was a slightly decrease in MCP-1 levels, but not significantly (35.5 ± 8.9 pg/mL vs. 25.6 ± 6.5 pg/mL). Based on our findings, we concluded that in spite of PCS and PC are not cytotoxic, they induce significantly MCP-1expression and PCS is more effective than its precursor PC. As PC and PCS, LPS also activates MCP-1 production via NF-êB. Therefore, we suggest that the inhibition of NF-êB could decrease MCP-1 levels and hence the development of atherosclerosis progression of CKD. Keywords: chronic kidney disease, uremic toxicity, p-cresol, p-cresyl sulfate, LPS, MCP-1 and NF-êB.

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Vani Xavier de Oliveira Júnior / Resumo: O sistema ParE-ParD, identificado no plasmídeo RK2 de uma ampla gama de hospedeiros, é um sistema toxina-antitoxina (TA), sendo ParE (103 aminoácidos) a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE pela formação de um complexo estável, que também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. ParE possui atividade citotóxica na replicação do DNA por interferir no mecanismo de ação da DNA girase. Diversos estudos demonstraram que ParD consiste de duas regiões estruturalmente distintas: uma N-terminal, bem ordenada que consiste no sitio de ligação do DNA e outra C-terminal, não estruturada, onde sugere-se ocorrer a ligação da toxina. Em relação à ligação com a toxina, um modelo atual de reconhecimento e ligação em sistemas TA invoca uma transição de fases desordenada-ordenada, na parte C-terminal da antitoxina, porém faltam dados que confirmem se este modelo de transição de fases desordenada-ordenada também pode ser aplicado para o sistema ParE-ParD. Neste sentido, este trabalho objetivou o design, a síntese e o estudo de interação de peptídeos derivados da toxina ParE, com peptídeos derivados da antitoxina ParD. Com base nas informações estruturais destas proteínas, sequências peptídicas derivadas de ParE e ParD foram projetadas, com o propósito de encontrar a estrutura mínima de ParD capaz de neutralizar a ação tóxica de ParE. As sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por HPLC e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação dos peptídeos foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca dos peptídeos denominados ParEAC2 e ParEAC3 foi suprimida pelos derivados de ParD, evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados... / Abstract: The ParE-ParD system represents a toxin-antitoxin module of the broad host range plasmid RK2. ParE (103 amino acids) is the toxin, whereas ParD (83 amino acids) constitutes the antidote able to neutralize ParE by forming a stable complex that is also effective in the autorepression of the parDE operon. The ParE toxin inhibits DNA gyrase activity and thereby blocks DNA replication. Several studies have shown that ParD consists of two structurally distinct regions: an N-terminal, orderly, consisting of the DNA binding site and another C-terminus, unstructured, where it is suggested to occur toxin binding. For binding with toxin, a current model of recognition and binding in TA systems invokes a disorder-to-order transition in the antitoxin. Specifically, a disordered region of the free antitoxin is organized into a well-defined secondary structure upon binding to its cognate toxin. But, no available data that proves the application of disorder-to-order transition model for ParE-ParD system. Therefore, this work aims to study the interaction of the ParE protein and its analogues with peptides from ParD antitoxin. Based on the structural information's of these proteins, peptide sequences derived from ParE and ParD were designed in order to find the minimal ParD structure able to neutralize the toxic effect of ParE. The peptide sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by HPLC and characterized by mass spectrometry. The interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence quenching assays. The intrinsic fluorescence of the denominated ParEAC2 and ParEAC3 peptides was quenched by ParD derivatives, evidencing complex formation, results confirmed by affinity chromatography assays. Molecular Docking studies demonstrated that the interaction mode of ParEAC3-ParDAC3 complex was consistent with the obtained crystallographic complex ParE-ParD of... / Mestre