Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foram caracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK. / C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17?, TNF? and IFN?, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFN? by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage- /CD3-/NK1.1+ cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulationsas immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFN?, may be important targets for the regulation of NK secretory function.

Este trabalho trata do processo de transcrição do Concerto em Dó Maior K 299 para Flauta e Harpa de Wolfgang Amadeus Mozart. O objetivo geral foi a transcrição da parte da harpa do concerto para violão de sete cordas. Por meio da análise comparativa de transcrições do próprio compositor do concerto e do estudo de referencial teórico, foram classificados os procedimentos necessários para a realização da transcrição, que são: compressão de registro, supressão de notas, mudança na disposição de notas, e transferência da parte da harpa para a orquestra. Esses procedimentos vão diretamente ao encontro da adaptação idiomática e musical ao instrumento para o qual verte a transcrição, e à fidelidade ao original da obra. Concluiu-se, por fim, que a transcrição de uma obra, deve se embasar em uma metodologia aplicada, que defina as diretrizes do processo e adapte a linha composicional do original às escolhas pessoais do transcritor. / The present work deals with the Concerto in C Major for Flute and Harp K299 by Wolfgang Amadeus Mozart. The main objective was the transcription of the Harp part of the concerto for a seven-string guitar. Through comparative analysis of transcriptions made by the composer himself, along with further reading, the necessary procedures to accomplish this transcription were identified and classified. They are: range compression, suppression of notes, change in the disposition of notes and the transference of accompaniment material from the harp part to the orchestra. Such procedures agree with an idiomatic and musical adaptation for the target instrument, while remaining accurate to the original work. It was concluded that the transcription of a work must be based on an applied methodology that define the guidelines and adapt the original compositional idiom to the personal choices of the transcriber.

Este trabalho visa analisar os problemas envolvidos na transcrição para o violão de obras compostas para alaúde barroco. São discutidas as diferenças entre os dois instrumentos relacionados à notação, número de cordas e afinação. É também apresentado um histórico do uso de scordatura nos diversos instrumentos de corda. São analisadas as características idiomáticas da música composta para alaúde barroco e as maneiras de adapta-las ao violão, propondo-se a utilização de afinação que reproduz no violão a relação intervalar das cordas do alaúde. Por fim é apresentada uma transcrição da Suíte XIII em Ré Maior, de S. L. Weiss, originalmente composta para alaúde barroco. / The aim of the present work is to analyze the problems involved in transcribing for guitar works originally composed for the baroque lute. The differences between the two instruments regarding notation, number of strings and tuning are discussed, followed by an overview of the use of scordatura in a variety of plucked instruments. The idiomatic characteristics of the music written for the Baroque lute and the possibility to adapt them to the guitar are analyzed. Finally, a guitar transcription of the Suíte XIII in D Major, by S. L. Weiss, originally written to the baroque lute, is presented.

As plantas são organismos sésseis que continuamente enfrentam situações ambientais adversas, o que acarreta em reduções significativas da biomassa e da produtividade. O trabalho, aqui exposto, teve como objetivo avaliar o papel dos fatores de transcrição ASR (do ingles ABA, stress and ripening) na resposta a estresses abióticos em plantas de arroz. Também teve como objetivo avaliar as respostas de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse produzido nos momentos iniciais da exposição ao metal alumínio. O capítulo 1 da presente tese, compara a expressão de miRNAs entre plantas silenciadas para o gene ASR5 (ASR5_RNAi) e plantas não transformadas (controle). De um total de 279 miRNAs maduros identificados, distribuídos em 60 famílias, 159 foram diferencialmente expressos quando as duas bibliotecas foram comparadas. Uma correlação negativa entre o MIR167 e seu gene alvo (LOC_Os07g29820) também foi confirmada por PCR em tempo real. Este é o primeiro trabalho sugerindo o envolvimento das proteínas ASR na regulação da expressão de miRNAs em planta. O segundo capítulo apresenta o estudo das proteínas ASR na manutenção da homeostase do pH em plantas de arroz. Verificou-se uma diminuição do crescimento radicular em plantas silenciadas em solução ácida, quando comparadas com plantas não transformadas nas mesmas condições. Também foi analisada a viabilidade da ponta de raízes quanto ao dano causado pelo baixo pH e diferentes concentrações de Ca+2, demonstrando que a adição de CaCl2 é capaz de aliviar o efeito tóxico do excesso de protons H+. Diversos genes reprimidos nas plantas silenciadas e envolvidos no mecanismo de manutenção do pH em células vegetais, também foram investigados. O terceiro e último capítulo é dedicado ao estudo da resposta inicial de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse por alumínio. Plantas com 7 dias de idade foram expostas a uma concentração de 25 μM de AlCl3 durante 3 horas e modificações na abundância de proteínas foi investigada com a técnica de espectrometria de massa. Um total de 3.213 proteínas foram identificadas, sendo que destas, 293 apresentaram variação no nível de expressão. Diversas proteínas com expressão induzida são funcionalmente associadas com a detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando que o tratamento ocasionou estresse oxidativo nas raízes de A. thaliana. Também foram identificadas uma proteína mitocondrial carreadora de substrato e uma acyl-CoA oxidase com possível papel nos mecanismos de defesa em resposta a alumínio e com potencial para futuros estudos funcionais na planta modelo. De uma maneira geral, os resultados aqui apresentados mostram, pela primeira vez, que ASR5 está envolvida na regulação de miRNAs e na homeostase do pH em plantas de arroz, além de identificar proteínas responsivas ao estresse por alumínio em A. thaliana. / Plants are sessile organisms that continuously face adverse environmental situations, leading to a significant reduction in biomass and yield. The aim of the present work was to further study the ASR (ABA, stress and ripening) transcription factors in rice plants. Moreover, the responses of Arabidopsis thaliana to aluminum stress were also analyzed. The chapter 1 of this thesis compares the expression of mature miRNAs in the ASR5 silenced plants (ASR5_RNAi) and in non-transformed plants (control). From a total of 279 mature miRNA of 60 families, 159 were differentially expressed. A negative correlation of MIR167 and its target gene (LOC_Os07g29820) was also confirmed by real time RT-qPCR. This is the first report showing the involvement of ASR proteins in miRNA gene expression regulation. The second chapter presents the study of participation of ASR proteins in the maintenance of pH homeostasis in rice plants. The evaluation of root growth in ASR5_RNAi plants upon acid solution showed inhibition of root growth when compared to non-transformed plants in the same condition. Root tip feasibility and damage caused by low pH and different concentrations of Ca+2 was also analyzed. The results indicate that addition of CaCl2 is capable of alleviating the toxic effects of H+ protons. Several genes downregulated in silenced plants and involved in pH maintenance in plant cells have also been investigated. This work demonstrates the importance of ASR transcription factors in a biological process not yet described. The third and final chapter describes the study of the initial response of Arabidopsis thaliana to aluminum stress. Seven-day old seedlings were treated with 25 μM AlCl3 for 3 hours and submitted to quantitative analyses by mass spectrometry. A total of 3,213 proteins were identified, from which 293 proteins were differentially responsive upon aluminum treatment. Several proteins with increased expression in response to the treatment are functionally associated with reactive oxygen species (ROS), indicating that the Al3+ exposure caused oxidative stress in the roots of A. thaliana. A mitochondrial substrate carrier (At1g78180) and an acyl-CoA oxidase (At3g51840) with a putative role in Al defense were also up-regulated and constitute interesting targets for functional studies of aluminum toxicity in the model plant. Overall, the results here presented show for the first time that ASR5 is involved in miRNA and pH homeostases regulation in rice plants and also identify proteins responsive to aluminum stress in A. thaliana.

Considerando que processos cruciais de diferenciação e maturação das células dendríticas (DCs) são regulados pelo fator de transcrição nuclear kappa B (NF-&#954;B), nos propusemos a estudar esta via em DCs derivadas de monócitos de pacientes com câncer de mama, partindo da hipótese de que alterações desta via contribuam, nesses indivíduos, para a geração de DCs com fenótipo e função alterados, levando ao escape tumoral. A análise da presença de NF-&#954;B no núcleo de monócitos, DCs imaturas (iDCs) e maduras indicou que as pacientes falham em modular tal fator de transcrição, de modo que a quantidade de NF-&#954;B no núcleo de iDCs de pacientes supera os níveis encontrados em controles, fenômeno possivelmente decorrente de alterações nas proteínas inibidoras do NF-&#954;B em pacientes. Observou-se menor frequência de células CD86+, CD83+ e HLA-DR+ (p < 0,05) ao final das culturas das pacientes, e aumento na concentração de IL-8 no sobrenadante das culturas. Coletivamente, estes dados corroboram a hipótese formulada. / Considering that crucial processes of differentiation and maturation of dendritic cells (DCs) are regulated by nuclear factor kappa B (NF-&#954;B), we proposed to study this pathway in monocyte-derived DCs from breast cancer patients, based on the hypothesis that alterations in such pathway may contribute in these individuals to the generation of DCs having phenotypic and functional changes, leading to tumor escape. The analysis of the presence of NF-&#954;B in the nucleus of monocytes, immature and mature DCs indicated that patients fail to modulate this transcription factor, so that the amount of NF-&#954;B in the nucleus of iDCs from patients exceeds levels found in controls, a phenomenon possibly due to alterations in inhibitory proteins of NF-&#954;B in patients. It was also observed diminished frequency of CD86+, CD83+ and HLA-DR+ cells (p <0.05) at the end of the patients cultures, as well as increased IL-8 concentration in the culture supernatants. Collectively, these data support the hypothesis previously formulated.

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Dulcinéia Martins de Albuquerque / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_RegianeAparecida_M.pdf: 1067582 bytes, checksum: 33631c571ed5b3e047ee71d15d222e81 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As variantes de hemoglobina e as Talassemias estão entre as hemoglobinopatias hereditárias mais frequentes no Brasil. A hemoglobina S é resultante de uma mutação de ponto no gene que codifica a cadeia beta da globina e que em homozigose caracteriza a Anemia Falciforme. Outras variantes neste gene podem ocasionar redução parcial ou completa da síntese de uma ou mais cadeias da globina, originando as Talassemias do tipo beta. Recentemente, alguns estudos relacionaram a interação de fatores de transcrição e microRNAs que mediam, em conjunto, mecanismos regulatórios transcricionais e pós transcricionais e promovem a diferenciação, proliferação e maturação de células eritroides. Dessa maneira, alterações no perfil de expressão de fatores transcricionais e de pequenos RNAs podem ocasionar manifestações clínicas envolvidas na eritropoese de pacientes com Talassemia beta intermediária e com Anemia Falciforme. Este trabalho analisou o perfil de expressão dos fatores transcricionais GATA-1, TAL1, NFE-2, LDB1, SPI-1, LMO2 e EKLF e dos miRNAs miR24, miR144, miR155, miR210, miR221, miR222, miR223 e miR451 em reticulócitos de 9 pacientes com Talassemia beta intermediária e 8 pacientes com Anemia Falciforme, através da PCR quantitativa em tempo real. Os resultados apresentaram alterações significativas no perfil de expressão dos FTs GATA-1, TAL1 e NFE-2 em reticulócitos de pacientes com Talassemia beta intermediária. Nos pacientes com Anemia Falciforme, diferenças significativas foram observadas na expressão dos FTs LMO2 e EKLF e dos microRNAs miR221, miR223 e miR451. Em conjunto, nossos resultados sugerem o envolvimento dos fatores de transcrição em associação aos microRNAs como moduladores da manifestação clínica em pacientes com Talassemia e Anemia Falciforme. Trata-se do primeiro estudo que avalia o perfil de expressão de microRNAs e fatores de transcrição relacionados à eritropoese em reticulócitos de pacientes com Anemia Falciforme e Talassemia beta no Brasil / Abstract: The hemoglobin variants and thalassemias are the most frequent hemoglobinopathies in Brazil. Hemoglobin S results from a point mutation in the gene that encodes the beta globin chain, which is characterized in homozygous sickle cell disease. Other variants of this gene can cause partial or complete reduction of the synthesis of one or more globin chains that result in beta-thalassemias. Recently, some studies have identified the interaction of transcription factors and microRNAs that mediate, together, regulation of transcriptional and post transcriptional mechanisms to promote the differentiation, proliferation and maturation of erythroid cells. Thus, disorders in the transcriptional factors and small RNAs expression can cause clinical manifestations involved in the erythropoiesis of patients with beta thalassemia intermediate and in sickle cell disease. This study analyzed the expression profile of the transcription factors GATA-1, TAL1, NFE2, LDB1, SPI1, LMO2 and EKLF and microRNAs miR24, miR144, miR155, miR210, miR221, miR222, miR223 and miR451, in reticulocytes from 9 patients with beta thalassemia intermediate and 8 patients with sickle cell disease, by real-time quantitative PCR. The results showed significant changes in the expression profiles of the transcription factors, GATA-1, TAL1 and NFE-2, in the reticulocytes of patients with beta thalassemia intermediate. In patients with sickle cell disease, significant differences were observed in the expression of the transcription factors, LMO2 and EKLF, and microRNAs miR221, miR223 and miR451. Together, our results suggest the involvement of transcription factors in association with miRNAs as modulators of the clinical manifestation in patients with beta thalassemia and sickle cell disease. This is the first study that evaluates the gene expression of microRNAs and transcription factors related to erythropoiesis in reticulocytes from patients with sickle cell anemia and beta thalassemia in Brazil / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:20:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_FlaviaRaquelGoncalves_D.pdf: 4565621 bytes, checksum: 26bdfc2a971d3837321625172c6745e8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O gene que codifica a proteína INT6 corresponde a um dos sítios de inserção do vírus de tumor de glândula mamária em camundongo (MMTV). Esta inserção pode levar à formação de proteínas truncadas sem a porção C-terminal e sem o domínio PCI, descrito como domínio de interação entre proteínas. Neste trabalho, realizamos 3 triagens para a identificação dos ligantes protéicos da proteína humana INT6 (hINT6) pelo método do duplo-híbrido de levedura. Embora interações específicas tenham sido identificadas, não foi possível a confirmação in vitro das novas interações isoladas. Para análises estruturais, usamos a proteína INT6 de Arabidopsis thaliana (AtINT6), visto que a proteína humana expressou em níveis muito baixos na fração solúvel do extrato de Escherichia coli. Análises de dicroísmo circular revelaram que a proteína AtINT6 é rica em estrutura do tipo a-hélice. A região que compreende os aminoácidos 172 a 415, incluindo o domínio PCI, foi identificada por proteólise parcial e espectrometria de massas como um domínio estrutural que após sua clonagem apresentou alto nível de expressão, solubilidade e estabilidade. Este trabalho envolveu também a caracterização da NY-REN-21, que foi isolada pelo duplo-híbrido para a identificação dos ligantes protéicos da proteína hINT6 e representa uma possível ortóloga para o fator de transcrição ZFP38 de camundongo. Ambas as proteínas apresentam um domínio de dimerização (SCAN), 7 domínios dedos de zinco tipo C2H2 na porção C-terminal e uma região central predita como desestruturada. A proteína NY-REN-21 se mostrou parcialmente desenovelada e sua estrutura secundária é afetada pela incubação com EDTA. Ensaios de proteólise limitada, dicroísmo circular e fluorescência confirmaram que sua região central é intrinsicamente desordenada, além de apresentar mobilidade anômala em gel de SDS-PAGE e representa uma fração flexível da proteína. Não foi possível a caracterização da região dos dedos de zinco, pois esta região se mostrou altamente instável. O domínio SCAN da NY-REN-21 é capaz de formar homodímeros e heterodímeros com a proteína SCAND1. Esta interação pode representar uma forma de regulação da atividade da proteína NY-REN-21 / Abstract: The INT6 gene was reported as a frequent genome integration site of Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV). This integration may result in truncated forms of INT6 protein lacking its C-terminal region and the PCI domain. It has been reported that this domain is involved in protein-protein interaction. We performed 3 yeast two-hybrid screens in order to identify the human INT6 (hINT6) interaction partners. Although two previously described specific interactions were identified in these screens, it was not possible to confirm the new interactions by in vitro binding assays. The Arabidopis thalina INT6 ortholog (AtINT6) was used for structural analyses, since the hINT6 was insoluble following expression in Escherichia coli. AtINT6 showed CD spectra with high helical content. The region comprising amino acids 172 to 415 forms a compact protease resistant domain as determined by limited proteolysis and mass spectrometry analyses. This domain, comprising the PCI domain sequence, was cloned and expressed in E. coli and showed high solubility and stability. This recombinant protein has the potential to serve as a model protein for three-dimensional structure determination of the PCI domain. We also studied the NY-REN-21 protein, which was isolated as a potential hINT6 interaction partner and represents a putative ortholog of the mouse ZFP38 transcriptional factor. Both proteins are C2H2 type multifinger proteins, containing a conserved oligomerization domain (SCAN) in the N-terminal region and a predicted disordered central region. Our analyses showed that full-length NY-REN-21 is partially unfolded and its secondary structure content is affected by incubation with EDTA. The central region of NY-REN-21 shows an aberrant mobility on SDS-PAGE and is intrinsically unstructured as reveled by circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis. The zinc finger region was not characterized because of its unstable nature. The recombinant SCAN domain of NY-REN-21 can form homodimers and heterodimers with the SCAND1 protein. This interaction may represent a novel regulatory mechanism of NY-REN-21 activity / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Nilson Ivo Tonin Zanchin, Beatriz Gomes Guimaraes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T09:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scapin_SandraMaraNaressi_D.pdf: 11335048 bytes, checksum: 153f9eea9142fb7f3cb17de59a608da6 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As GTPases da família Rab regulam o transporte intracelular de vesículas em eucariotos. Cada Rab atua em uma via de transporte específica e seu mecanismo de ação se dá através da realização de um ciclo de ligação e hidrólise de GTP. Neste trabalho, foi determinada a estrutura cristalográfica das formas inativa (ligada a GDP) e ativa (ligada a GppNHp) da GTPase Rab11b, um membro da subfamília Rab11 que está envolvida na reciclagem de proteínas dos endossomos para a membrana plasmática, no tráfego de vesículas da rede trans-Golgi para a membrana plasmática e na fagocitose. Os resultados foram confrontados com os dados estruturais da Rab11a descritos anteriormente. A Rab11b inativa cristalizou como um monômero, o que gera conflitos a respeito da formação de dímeros funcionais pela Rab11a. A Rab11b e a Rab11a ativas divergiram em relação à posição e à interação da serina 20, que é importante na hidrólise de GTP, mas apresentaram taxas hidrolíticas semelhantes in vitro. Visando uma investigação mais ampla da família Rab, a GTPase Rab21 também foi cristalizada, mas os cristais difrataram até 2.90 Å de resolução. Ensaios de desnaturação térmica revelaram que a Rab21 é estruturalmente mais instável do que a Rab11, talvez pela presença de cisteínas que estão susceptíveis à oxidação, contribuindo para a agregação e precipitação da proteína. A Rab11 é bastante estável, e possivelmente forma estruturas do tipo beta-amilóide em altas temperaturas. Este trabalho envolveu também o estudo funcional da interação entre a proteína TIP41 humana (TIPRL) e o fator de transcrição MafB. A TIPRL é uma proteína conservada que foi identificada como uma ativadora de MAP quinases enquanto sua homóloga em levedura foi caracterizada como um antagonista da via de sinalização da quinase TOR que regula o crescimento celular. A MafB está envolvida no controle transcricional em diversos processos de desenvolvimento, mas seus reguladores ainda não estão bem estabelecidos. A interação direta entre a TIPRL e a MafB inteira, ou seu domínio bZIP isolado, foi confirmada através de ensaios de ligação in vitro. As proteínas co-localizaram no núcleo de células HEK293 e nossos resultados preliminares mostram que a TIPRL inibe a atividade transcricional da MafB in vivo, embora apenas interfira na ligação in vitro do domínio bZIP da MafB ao seu DNA-alvo mediante a estabilização do complexo TIPRL-bZIP. A TIPRL pode, portanto, constituir um novo regulador da atividade de MafB / Abstract: GTPases of the Rab family are responsible for the intracellular transport of vesicles. Each family member acts on a specific transport pathway and their function is regulated by GTP binding and hydrolysis, cycling between inactive (GDP-bound) and active (GTP-bound) forms. In this work, we describe the crystal structure of inactive and active forms of the GTPase Rab11b, a member of the Rab11 subfamily which is involved in recycling of proteins from endosomes to the plasma membrane, in polarized transport in epithelial cells, in the transport of molecules of the trans-Golgi network to the plasma membrane and in phagocytosis. The Rab11b structure showed several differences from the Rab11a isoform previously described. Inactive Rab11b crystallized as a monomer, contradicting the hypothesis about functional dimers formed by Rab11a. Active Rab11b differ from Rab11a relative to the position of the serine 20 sidechain, which is involved in GTP hydrolysis, although both GTPases show similar GTP hydrolysis rates in vitro. In order to obtain structural information on Rab GTPases, Rab21 was also crystallized, but the crystals diffracted to a relatively low resolution (2.90 Å). Rab21 is a cysteine rich protein, showing a higher instability relative to Rab11b. Thermal unfolding followed by circular dicroism confirmed this hypothesis. Both Rab11b and Rab11a show a relatively high thermal stability and circular dicroism analysis indicate that they undergo conversion to structures rich in beta-strands upon thermal denaturation. This work includes also studies on the function of TIPRL in regard to its interaction with the transcription factor MafB. TIPRL is a conserved human protein identified as an activator of MAP kinases whereas its yeast counterpart Tip41 functions as an antagonist of the TOR kinase pathway. MafB is a large member of the Maf family of bZIP transcription factors controlling developmental processes in vertebrates. Regulation of MafB is critical, for example, during erythroid differentiation. A direct interaction between TIPRL and full length MafB and the bZIP domain of MafB was confirmed by in vitro interaction assays. TIPRL is localized throughout the whole cell and overlaps with MafB in the nucleus of HEK293 cells. Preliminary assays showed that TIPRL inhibits transcriptional activation mediated by MafB in HEK293 cells, although MafB shows a higher binding affinity to its target DNA relative to TIPRL in vitro. This evidence indicates that TIPRL may control MafB activity in vivo / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_RosiclerLazaro_D.pdf: 3769373 bytes, checksum: ba15f76eb9d63f64834d030ffed2482a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O gene XF0767 de Xylella fastidiosa está localizado num operon composto por mais quatro genes classificados como proteínas hipotéticas (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764). Este operon está conservado em uma série de bactérias associadas a plantas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. A região upstream ao códon de iniciação deste operon possui seqüências canônicas correspondentes a sítios -35 e ¿10 de regiões promotoras reguladas por fatores sigma70. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sistema de regulação do operon pela proteína XF0767, nomeada BigR (biofilm growth-associated repressor), visando à compreensão deste sistema e sua importância para a bactéria. A proteína BigR se liga na seqüência repetida invertida (9-4-9) localizada na região ¿10 do promotor do operon XF0768-0764, denominada BigRbox. BigR inibe a atividade do operon reprimindo a expressão do gene repórter GFP em Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Xylella fastidiosa. Mutações no BigRbox dos promotores de Xylella e Agrobacterium afetam a ligação do repressor e abole a transcrição do gene repórter. Esses dados indicam, portanto, que BigR compete com a RNA polimerase pelo mesmo sítio de ligação ao DNA, revelando assim o mecanismo de regulação do operon. BigR apresenta similaridade com fatores transcricionais de bactérias contendo domínio HTH (helix-turn-helix) de ligação ao DNA. Apesar de BigR ter sido inicialmente classificada como uma proteína da família SmtB/ArsR, as quais regulam operons relacionados à resistência a metais, nossos dados indicam que BigR não atua como sensor de metal. A adição de cádmio, ferro e cobre na mistura de ligação causam uma aparente dissociação do complexo DNA/BigR, entretanto, estudos in vivo na presença de metais não evidenciaram nenhuma alteração na expressão do gene repórter. Mutantes deficientes em BigR também não apresentam diferença de crescimento na presença de metais. O gene XF0768 codifica uma proteína nomeada BLH (beta-lactamase-like hydrolase) por pertencer à superfamília das metalo-beta-lactamases. Dada a presença de BigR e BLH no operon de Xylella e Agrobacterium, a atividade do operon foi analisada em diferentes condições como crescimento das células repórter in planta, co-cultivo com bactérias endofíticas e deficiência nutricional. Entretanto, uma maior atividade do operon em Xylella e Agrobacterium foi detectada apenas na condição de biofilme. Células de Agrobacterium aderidas em raiz de tabaco também apresentaram maior expressão do gene repórter quando comparadas às células em suspensão. Mutantes de Agrobacterium deficientes em BigR (bigR-) apresentam maior expressão do gene repórter, confirmando que BigR age como o repressor transcricional do operon. A quantificação da formação de biofilme das células mutante e selvagem revelou uma maior densidade de biofilme no mutante bigR- em superfície de vidro e também maior quantidade de células aderidas em raiz de tabaco, indicando que o operon pode estar envolvido com o processo de adesão ou desenvolvimento do biofilme bacteriano. Do ponto de vista estrutural, foi mostrado que a proteína BigR truncada no N-terminal (?BigR) encontra-se estruturada na forma de trímero, diferindo do observado para as proteínas com domínio HTH que em geral formam dímeros e monômeros. BigR é estável termicamente, começando a perder estrutura à 74oC, mas retendo um sinal residual de a-hélice até 90oC. Tratamentos com altas concentrações de (NH4) SO 2 4 interferiram na ligação da proteína ao DNA alvo e no conteúdo de estrutura secundária sem alterar, contudo, sua estabilidade térmica. A purificação e cristalização da proteína ?BigR resultou na coleta de alguns conjuntos de dados da proteína nativa e derivada, através de soaking ou marcada com SeMet. Apesar dos dados obtidos serem de boa qualidade, até o momento, não foi possível a resolução da estrutura cristalográfica desta proteína / Abstract: The XF0767 gene from Xylella fastidiosa is located in an operon composed by a set of genes (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764) of unknown function. This operon is conserved in a number of plant-associated bacteria including Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. The DNA region upstream of the operon has canonical sequences corresponding to ¿35 and ¿10 elements found in sigma70-regulated promoters. The aim of this work was to elucidate the biological function of the protein encoded by XF0767, named BigR (biofilm growth-associated repressor), as a transcriptional regulator and its importance to the bacteria. BigR binds to an inverted repeat sequence (9-4-9) located in the ¿10 region of the XF0768-0764 operon promoter. This sequence was named BigRbox. BigR repressed transcription of its own operon upon binding to the BigRbox in Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens. Mutations in the BigRbox significantly affected the repressor binding and abolished transcription of the reporter gene in both bacteria, indicating that BigR compete with the RNA polymerase for the same promoter site. BigR is similar to HTH transcriptional factors of the SmtB/ArsR family, which control tolerance and detoxification of heavy metals in prokaryotes. Despite the similarities, BigR does not appear to function as a metal sensor, as initially predicted. Although binding of BigR to its target DNA was diminished in the presence of cadmium, copper and iron, operon regulation in response to metals was not demonstrated in vivo. In addition, Agrobacterium mutants deficient in BigR did not show changes in growth rates in the presence of metals. BLH is an unusual beta-lactamase-like hydrolase coded by the XF0768 gene. To gain insights into the possible function of the operon, the activity of reporter cells was observed in the presence of different compounds and conditions including in planta growth, effect of endophytic competition and nutrient deficiency. Significantly, an increased operon activity was observed in Xylella and Agrobacterium biofilms. Agrobacterium cells attached to tobacco roots also showed high levels of reporter gene expression in comparison to cells in suspension. A. tumefaciens mutants deficient in the BigR showed constitutive expression of the operon, confirming that BigR acts as a transcriptional repressor. Biofilm quantification showed increased biofilm formation in glass surfaces as well as in tobacco roots, indicating that the operon may play a role in cell adherence or biofilm development. Structurally, the truncated BigR protein (?BigR) is a trimmer in solution, as opposed to most HTH regulators known, which are usually found as dimmers or monomers. BigR is stable at high temperatures (74oC); however, treatments with high concentrations of ammonium sulfate interfere with the protein secondary structure and its DNA binding capacity, without affecting its thermal stability. Good quality X-ray diffraction data were collected for the native and derivative ?bigR protein; however, structure resolution was not possible probably due to problems with the crystals / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:15:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AnaHelenaMacedo_M.pdf: 6567293 bytes, checksum: b9a8c070b3b65fe7a4fb095ccfc59d42 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Doenças do coração são freqüentemente associadas à hipertrofia miocárdica. Estímulos mecânicos induzem o crescimento hipertrófico e contribuem para a degeneração e morte dos miócitos cardíacos. Dentre os fatores de transcrição envolvidos no processo de hipertrofia miocárdica, estão os da família MEF2 (Myocyte Enhancer Factor-2), que é composto por 4 membros, MEF2A, B, C e D. O MEF2C é descrito como o principal transcrito no miocárdio. Tanto a deleção quanto a hiperexpressão de seu gene causam efeitos deletérios na formação e na função do músculo cardíaco. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o MEF2 é ativado por estiramento de cardiomiócitos e influencia a expressão de genes do programa hipertrófico. O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do silenciamento gênico do MEF2C nas alterações estruturais e funcionais do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica. Para isso, utilizamos a técnica de interferência por RNA para o MEF2C. A padronização constituiu de: 1) avaliação do silenciamento do MEF2C em cultura de células C2C12 e no ventrículo esquerdo de camundongos Swiss; 2) determinação da dose necessária de siRNA para o silenciamento da expressão protéica do MEF2C; 3) determinação do curso temporal do silenciamento; 4) avaliação dos efeitos do tratamento com molécula irrelevante de siRNA direcionada para a proteína exógena GFP; 5) avaliação da especificidade do silenciamento (off-targets) pela análise do RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2; 6) avaliação do silenciamento em outros órgãos, como pulmão e rim; 7) avaliação da efetividade do silenciamento de MEF2C em miócitos cardíacos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos. O tratamento com siRNA diminuiu a expressão protéica do MEF2 em 70% das células C2C12. Também verificamos que o tratamento com siRNA silenciou 85% da expressão protéica e do RNAm do MEF2C no ventrículo esquerdo de camundongos em até 4 dias de seguimento. Não foi verificada alteração na expressão de RNAm para o MEF2A e das proteínas FAK, GAPDH, JNK1/2 e SHP2. O silenciamento foi efetivo no pulmão e nos cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de camundongos tratado com siRNAMEF2C. Após a padronização do silenciamento, procedeu-se à determinação dos efeitos do silenciamento na estrutura e na função do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica crônica. Para isso, realizaram-se as análises ecocardiográfica, hemodinâmica, gravimétrica e morfométrica do ventrículo esquerdo de camundongos submetidos à coarctação da aorta com seguimento de 15 dias. Demonstramos que o tratamento com siRNAMEF2C atenuou a hipertrofia cardíaca nos animais coarctados. Esta conclusão foi baseada em dados de ecocardiografia que revelaram menor espessura da parede posterior (30% menor) e por gravimetria que revelou atenuação de aproximadamente 45% da massa do ventrículo esquerdo. Apesar de ter havido aumento do gradiente sistólico nos animais coarctados, a pressão arterial sistêmica não apresentou diferença estatisticamente significativa com o tratamento do siRNAMEF2C. Morfologicamente, o siRNA atenuou a fração de colágeno no ventrículo esquerdo de camundongos coarctado com 15 dias de seguimento. Entretanto, o diâmetro dos miócitos e o infiltrado de células inflamatórias foram comparáveis dentre os grupos. Somente os animais coarctados por 24 horas tiveram maior expressão de ß- MHC, e quando tratados com siRNAMEF2C apresentaram menor razão ATP/ADP. Dessa forma, esses dados sugerem que o MEF2C regula múltiplos aspectos da hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga pressórica tais como a expressão de genes sarcoméricos e genes envolvidos na adaptação metabólica do músculo cardíaco. / Abstract: Heart diseases are frequently associated with myocardial hypertrophy. Mechanical stimuli can trigger hypertrophic growth as well as degeneration and death of the cardiac myocytes. The MEF2C family of transcription factors plays a role in the process of myocardial hypertrophy. It is composed by 4 members, MEF2A, B, C and D, and the MEF2C is the main transcript in the heart. Both the deletion and overexpression of mef2c induce deleterious effects in the formation and function of the heart. Previous studies of the our laboratory has shown that the transcription factor MEF2C is activated by mechanical stretch in cardiomyocytes and regulates the expression of genes related to cardiac hypertrophy. This study was performed to address the effects of MEF2C gene silencing in the structural and functional changes of the left ventricle (LV) induced by pressure overload in mice. To silence MEF2C, it was employed the RNA interference technique, specific siRNA target to MEF2C was administered through the mice jugular vein. To optimize the MEF2C knockdown, it was necessary to 1) analyze the MEF2C silencing in C2C12 cells, 2) determine the dose required to induce significant MEF2C silencing in LV of mice, 3) determine the time course of gene silencing, 4) assess the effects of the treatment with irrelevant siRNA target to the protein GFP, 5) evaluate the specificity of gene silencing by siRNAMEF2C through the expression analysis of the transcription factor MEF2A and other non-related proteins, 6) analyze of the MEF2C knockdown in other organs, 7) determine the effectiveness of the MEF2C silencing in cardiac myocytes harverst from the LV of mice treated systemically with siRNAMEF2C. Treatment with 100ng/mL of siRNAMEF2C induced MEF2C silencing (~70%) in C2C12 cells. Intrajugular delivery of 30µg of siRNAMEF2C in mice induced the reduction in the mRNA and protein levels (~85%) until 4 days after the injection. The treatment with siRNAMEF2C did not affect the expression of MEF2A and other non-related proteins. The MEF2C silencing was effective in lung and in cardiac myocytes harverst from LV of mice treated with siRNAMEF2C. After knockdown optimization, echocardiographic, hemodynamic, gravimetric and morphometric analysis was performed to address the effects of MEF2C silencing in the structure and function of the LV from 15 days aorticbanded mice. Myocardial MEF2C silencing attenuated the load-induced hypertrophy in banded mice, indicated by the reductions of the wall thickness and the mass (~45%) of the LV. An increase in transconstriction gradient was observed in banded mice but the systemic blood pressure did not shown a significant statistically difference with the siRNAMEF2C treatment. The siRNAMEF2C injection reduced the collagen fraction in the LV of 15 days banded mice. On the other hand, the myocytes diameter and inflammatory cells level were comparable between the groups. Only the 24 hours banded mice showed an increase in the â-MHC expression and the treatment with siRNAMEF2C reduced ATP/ADP ratio. This study indicate that MEF2C regulates many aspects of the cardiac hypertrophy induced by pressure overload, like the expression of sarcomeric genes and genes involved in metabolic adaptation of the heart muscle. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica