Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Introdução: O carcinoma renal (CR) é relativamente raro comparado a outros cânceres. Um dos mais potentes mitógenos tumorais, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, é regulado por inúmeras vias, particularmente Ras e Akt, que são alvo de inúmeros agentes terapêuticos, dentre eles o sorafenibe. Estas vias de sinalização têm importante papel no desenvolvimento e manutenção da resistência a múltiplas drogas (MDR). A Echinácea purpúrea é utilizada como tratamento alternativo para alguns tipos de câncer, sendo promissora para a terapêutica de CR. Objetivo: Analisar o efeito da Echinácea purpúrea (Ech) na viabilidade celular, apoptose, nas vias de sinalização Ras e Akt, bem como na angiogênese tumoral através do VEGF e potenciais alterações na resistência a múltiplas drogas. Métodos: O fitoterápico Ech, foi adicionado à cultura de células Caki-1 para posterior análise da viabilidade celular (Cristal Violeta), apoptose (Citometria de fluxo), liberação da enzima Lactato Desidrogenase – DHL (Bio 200) e expressão protéica do VEGF, Ras e Akt (Western blot) e expressão gênica MDR, MRP, LRP (PCR-RT). Os experimentos foram realizados após 24, 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados foram analisados pelo teste Anova One Way, com p<0,001 vs CT (X ± EP vs CT). Resultados: Os grupos tratados com Ech demonstraram diminuição significante da viabilidade celular, dose e tempo dependentes comparado aos seus controles. Nós observamos um aumento significante na porcentagem de células apoptóticas no grupo de 72 horas comparado com o grupo controle: 4,7±0,4 vs. 7,6±0,7 (p<0,001), respectivamente. Também, observamos diminuição na expressão protéica (p<0,001) da Akt (0,301±0,02 vs. 0,193±0,009) e VEGF (0,729±0,01 vs. 0,439±0,01) em 48 horas, bem como com 24 horas na proteína Ras (0,484±0,05 vs. 0,289±0,02). Analisando a expressão gênica das proteínas de resistência a múltiplas drogas, Ech causou diminuição substancial de 100% para as proteínas MDR e MRP e decréscimo de 25% na proteína LRP, sugerindo importante efeito nestas proteínas. Conclusão: Baseado em nossos resultados, observamos que a Ech apresenta propriedades anti-oncogênica, uma vez que demonstrou atividade sobre a viabilidade e apoptose celular. Da mesma forma, Ech apresentou importante papel sobre as vias de sinalização Akt e Ras, sendo estas importantes mediadoras da progressão do ciclo celular e do processo apoptótico. Essas vias inibidas demonstraram importante papel na inibição do VEGF, assim como, na regulação da resistência a múltiplas drogas. / Introduction: The renal cell carcinoma (CR) is relatively rare compared to other cancers. One of the most potent tumor mitogen, vascular endothelial growth factor, VEGF is regulated by numerous pathways, especially Ras and Akt, which are targets of many therapeutic agents, among them sorafenib. These signaling pathways play an important role in the development and maintenance of the multidrug resistance (MDR). Echinacea purpurea is used as an alternative treatment for some cancers, and promising for the treatment of CR. Aim: Analyze the effect of Ech purpurea (Ech) on the cellular viability, apoptosis, Ras and Akt signaling pathway as well as tumor angiogenesis throughout VGEF and potential proteins alteration in the cellular resistance to drugs. Methods: Herbal echinacea were added to cell culture Caki-1 for subsequent analysis of cell viability (Crystal Violet), apoptosis (flow cytometry), release of the enzyme lactate dehydrogenase - LDH (Bio 200), protein expression of VEGF, Ras and Akt (Western blot ) and gene expression MDR, MRP, LRP (RT-PCR). The experiments were performed after 24, 48 and 72 hours of treatment. The results were analyzed by One Way ANOVA, p <0.001 vs CT (X ± SE vs CT). Results: Group treated with Ech demonstrated decrease in cell viability dose and time dependent compared to the control (IC50, 150mg/mL) from 0 to 300ug/mL (p<0.001). We observed a statistically significant increase of apoptotic cells for group 72 hours comparing with control group: 4.7±0.4 vs. 7.6±0.7 (p<0.001), respectively. Also, a decrease in protein expression (p<0.05) of the Akt (0.301±0.02 vs. 0.193±0.009) and VEGF (0.729±0.01 vs. 0.439±0.01) in 48 hours, as well as Ras in 24 hours (0.484±0.05 vs. 0.289±0.02) were obtained. By analyzing the genic expression of the proteins resistance to multiple drugs, Ech caused a substantial decrease of 100% for MDR and MRP with 25% decreases in LRP, suggesting an important effect in blunt the resistance protein to drugs. Conclusion: To our knowledge, the Ech has anti-oncogenic properties since it showed activity on the viability and apoptosis. Likewise, Ech has its role on the signaling pathways Akt and Ras, which are important mediators of cell cycle progression and apoptosis. These blunted pathways demonstrated an important role on VEGF inhibition, as well as in the regulation of multidrug resistance. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O treinamento físico aeróbio (TFA) foi estabelecido como uma conduta importante capaz de alterar a musculatura esquelética humana. Os microRNAs (miRs) surgiram como importantes reguladores de processos biológicos, modulando a expressão de genes pós-transcricionalmente. Os myomiRs são miRs específico do músculo esquelético, em especial o miR-206, que é necessário para uma eficiente regeneração das fibras musculares esqueléticas. No entanto, a expressão do miR-206 em resposta ao TFA, não é completamente comprendida. O objetivo do presente estudo foi determinar os padrões de expressão dos myomiRs na musculatura esquelética humana. Doze voluntários saudáveis foram biopsiados pré e pós-treinamento físico. As expressões gênicas e proteicas envolvidas na miogênese foram observadas, incluindo; PAX-7, MYF5, MYOD, MRF4, MYOG, CD31 e FSTL. Além disso, a freqüência cardíaca (FC), pressão arterial média (PAM), consumo máximo de oxigênio (VO2max), fluxo sanguineo no antebraço (FSA) e condutância vascular no antebraço (CVA), foram avaliados. Ademais, os myomiRs foram analisados por PCR em tempo real. O treinamento físico aeróbio foi realizado durante 16 semanas. Todas as variáveis foram reavaliadas após o treinamento. Os indivíduos apresentaram um aumento nas expressões dos myomiRs, em especial do miRs-206 de 93%. Estas alterações foram acompanhadas por aumento nas expressões dos genes; PAX-7, MYOD, MYF5, MFR4, MYOG e FSTL, respectivamente. No entanto, quando analisamos as expressões proteicas, houve redução na FSTL e PAX-7, de 24%, 29%, respectivamente. Além disso, em MYOD, CD31, MYOG e MHC houve aumentos de 21%, 41%, 79% e 94%, respectivamente. Ademais, houve uma diminuição na frequência cardíaca de reposuso de 12,5% e aumentos no VO2pico, FSA e CVA de 14,1%, 68%, 63%, respectivamente. Estes resultados sugerem que em indivíduos saudáveis o miRs-206 é altamente expresso após o treinamento físico aeróbio, dessa forma, modulando localmente processos miogênicos regenerativos em homens saudáveis / Endurance training (ET) has been established as an important phenotype capable of altering the human skeletal muscle. MicroRNAs (miRs) have emerged as important regulators of numerous biological processes by modulating gene expression at the post-transcriptional level. The myomiRs are particulars miRs of muscles, in special skeletal muscle-specific miR-206 that is required for efficient regeneration muscle fiber. However, the expression of myomiRs and in special miR-206 in response to ET in human skeletal muscle is not completely understood. Twelve healthy volunteers were biopsied pre and post period endurance training. Most of the biological processes involved in the transcriptional regulation were observed, including PAX-7, MYF5, MYOD, MRF4, MYOG, CD31 and FSTL, analyzed by real time PCR. Moreover, heart rate (HR), mean blood pressure (MBP), maximal exercise capacity (VO2peak) forearm blood flow (FBF) and forearm vascular conductance (FVC) were evaluated. The myomiRs levels analyzed by real-time PCR. Endurance training was performed for 16 weeks. All variables were re-assessed following completion of the training period. After endurance training, the individuals showed an increase in myomiRs, in special of 93% in human skeletal muscle in miRNA-206 levels. These alterations were accompanied by increase in PAX-7, MYOD, MYF5, MFR4, MYOG and FSTL gene expression, respectively. However, when analyzed by western blot comparing pre and post period there were reduction in FSTL of 24% and PAX-7 of 29% in protein levels, but in MYOD, CD31, MYOG and MHC there were increase of 21%, 41%, 79% and 94% in protein levels, respectively. In addition, there was a decrease in hear rate of 12.5% and increases in VO2peak of 14.1%, FBF of 68% and FVC of 63%.These results suggest that in healthy individuals the miR-206 is highly expressed after endurance training, thus modulating locally important parts in myogenic processes in humans

A superexpressão de receptores HER-2 é anormalidade celular de grande relevância clínica no câncer de mama. Ela ocorre em aproximadamente 30% de carcinomas de mama incluindo lesões pré-neoplásicas e malignas, e está associada a prognóstico desfavorável. A hiperativação dos receptores HER-2, consequência natural de sua superexpressão, promove proliferação celular aberrante e tumorigênese. Admite-se que a ativação e envio de sinais via HER-2 possa acontecer quando estes receptores se encontram em compartimentos específicos da membrana celular, os lipid rafts. Assim, um número maior de HER-2 poderia implicar em maior quantidade de lipis rafts. Para testar essa hipótese, usamos modelo de transformação oncogênica que nos permitiu avaliar, especificamente, os efeitos da superexpressão de HER-2 e identificar a quantidade de lipid rafts. Para isso utilizamos a linhagem celular HB4a, derivada de célula epitelial luminal do tecido mamário humano normal com baixa expressão de HER-2; e a linhagem HB4aC5.2, um clone derivado da HB4a, que superexpressa receptores HER-2. Nas células HB4aC5.2, a superexpressão de HER-2 foi acompanhada pelo aumento dos lipid rafts na membrana celular, bem como, hiperativação de sinais de sobrevivência, proliferação (aumento da ativação de proteínas Akt e Erk1/2, respectivamente), e taxa de proliferação celular duas vezes mais rápida que a linhagem normal HB4a. Adicionalmente, a superexpressão de HER-2 foi associada com aumento da lipogênese celular (fenótipo lipogênico), dependente do aumento de ativação da enzima FASN e da superexpressão de DEPTOR. A FASN é responsável pela síntese de palmitato, utilizado para formação de lipid rafts. A superexpressão de DEPTOR, por modular a atividade transcricional de PPAR?, pode evitar a lipotoxicidade do excesso de palmitato. Além disso, DEPTOR, por sua capacidade em reduzir atividade do complexo mTORC1, contribui para sobrevivência celular dependente da proteína Akt. Em continuidade, consideramos, como segunda hipótese, que a desestruturação de lipid rafts poderia influenciar negativamente a ativação dos receptores HER-2. Para isso tratamos, as mesmas linhagens celulares anteriormente descritas, com ácido docosaexaenoico (DHA), um tipo de ácido graxo ômega-3. Nossos resultados mostraram que, nas células HB4aC5.2, o tratamento com DHA desestruturou os lipid rafts, inibiu a sinalização iniciada pelos receptores HER-2 ( diminuição da ativação das proteínas Akt, Erk1/2, FASN, atividade transcricional de PPAR? e expressão de DEPTOR) e reverteu o fenótipo lipogênico. Adiciona-se que essas modificações celulares e moleculares foram acompanhadas por indução significativa de morte e apoptose. As mesmas alterações não foram observadas nas células normais HB4a. Em conclusão, o presente estudo reforça a associação entre a presença de HER-2 e lipid rafts. Adicionalmente aponta que a desestruturação de lipid rafts por DHA reduz a sinalização de HER-2. Por fim, sugere que distúrbios em lipid rafts, induzidos por DHA, possam representar ferramenta útil no controle da sinalização aberrante deflagrada pelos receptores HER-2, e aponta potencial terapêutico na suplementação de DHA para quimioprevenção e tratamento do câncer de mama HER-2 positivo. / HER-2 receptor overexpression is a cellular abnormality of great clinical significance in breast cancer. It is described in approximately 30% of breast carcinomas, including preneoplasic and malignant lesions, and is associated with poor prognosis. Hyperactivation of HER-2 receptors, a natural consequence of its overexpression, promotes aberrant cell proliferation and tumorigenesis. For signal activation and transduction to occur, HER-2 must be localized in specific compartments in the cell membrane: the lipid rafts. Therefore, we hypothesize that a greater number of HER-2 receptors could indicate a greater quantity of lipid rafts. To test this, we used an oncogenic transformation model that specifically allowed assessment of the effects of HER-2 overexpression and identification of the quantity of lipid rafts: an HB4a cell line derived from normal human breast tissue luminal epithelial cells with low HER-2 expression, and an HB4aC5.2 cell line, a clone derived from HB4a that overexpresses HER-2 receptors. In the HB4aC5.2 cells, HER-2 overexpression was accompanied by an increase in lipid rafts in cell membranes as well as hyperactivation of survival signals, proliferation (increased activation of the proteins Akt and ERK1/2, respectively), and an increased rate of proliferation, compared to the normal HB4a line. In addition, HER-2 overexpression was associated with increased cellular lipogenesis (lipogenic phenotype), dependent on the increased activation of the FASN enzyme and the overexpression of DEPTOR. FASN is responsible for the synthesis of palmitate, used to synthesize lipid rafts. Overexpression of DEPTOR by modulating PPAR? transcriptional activity, may avoid lipotoxicity from excess palmitate. Moreover, DEPTOR, with its ability to reduce mTORC1 complex activity, contributes to cell survival dependent on Akt. To continue, we considered as a second hypothesis that the disruption of lipid rafts could negatively influence HER-2 receptor activation. For this, we treated the same cell lines described above with docosahexaenoic acid (DHA), a omega-3 fatty acid. Our results showed that in HB4aC5.2 cells DHA treatment disrupted the lipid rafts, inhibited signaling initiated by HER-2 receptors (reduced activation of Akt, ERK1/2, and FASN proteins, PPAR? transcriptional activity, and DEPTOR expression) and reversed the lipogenic phenotype. In addition, these cellular and molecular changes were accompanied by a significant induction of apoptosis and death. The same changes were not observed in normal HB4a cells. In conclusion, the present study reinforces the association between HER-2 presence and lipid rafts. It also indicates that the disruption of lipid rafts by DHA reduces HER-2 signaling. Finally, it suggests that DHA-induced disturbances in lipid rafts may represent a useful tool in controlling aberrant signaling triggered by HER-2 receptors, and indicate therapeutic potential in DHA supplementation for chemoprevention and treatment of HER-2 positive breast cancer.

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events

INTRODUÇÃO: Na Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 2 (NEM2), o desenvolvimento do Carcinoma Medular de Tireoide (CMT), Feocromocitoma (FEO) e Hiperparatireoidismo primário (HPT) está associado à mutações germinativas ativadoras no proto-oncogene RET. Casos de CMT esporádico podem apresentar mutações somáticas no RET (~40%). A variabilidade fenotípica observada em casos de CMT e FEO familiais associados à NEM2 indica o envolvimento de eventos genéticos adicionais que seriam responsáveis pelas diferenças clínicas observadas nos indivíduos afetados (idade de desenvolvimento, progressão e agressividade do tumor). Outras alterações genéticas no RET como duplas mutações, SNPs e haplótipos específicos podem influenciar na susceptibilidade, agressividade e modulação do fenótipo NEM2. Entretanto, os estudos de outros genes envolvidos no processo da tumorigênese NEM2 ainda estão em andamento. Recentemente foi mostrado que RET ativado controla a expressão de proteínas inibidoras do ciclo celular (p18 e p27). Mutações germinativas no gene p27 foram recentemente associadas à susceptibilidade de tumores neuroendócrinos e estão associadas à síndrome NEM4 (Neoplasia endócrina múltipla tipo 4). Mutações somáticas, inativadoras de p27, são raramente encontradas em vários tipos de tumores. Entretanto, diversos estudos documentaram que a redução na expressão e a sublocalização citoplamática de p27 são controladas por alterações pós-transducionais e/ou epigenéticas. OBJETIVOS: o estudo teve como objetivos avaliar a participação de genes, recentemente associados ao RET ativado, em tumores de pacientes com NEM2 e também verificar se polimorfismos no gene p27 estariam atuando como moduladores de fenótipo em uma grande família com NEM2. CASUÍTICA: foram analisadas 66 amostras tumorais advindas de 36 pacientes com diagnóstico clínico e genético de NEM2 e 28 indivíduos pertencentes a uma grande família com NEM2A-CMTF e mutação C620R no gene RET. MÉTODOS: As análises somáticas do p27 e também de p15, p18 e RET foram realizadas por PCR e sequenciamento direto de DNA e análise de microssatélites para p27 foi realizada por PCR e eletroforese capilar. Análises de expressão e localização da proteína p27 celular foram realizadas por Western blot e imunohistoquímica. A análise da modulação de fenótipo na família com NEM2A foi realizada por meio da amplificação do éxon 1 do gene p27 na amostra de sangue total. RESULTADOS: Não foram encontradas mutações somáticas no gene p27 e também nos genes p15 e p18. Entretanto, verificamos baixa expressão proteica de p27 em tumores CMT e FEO, a qual se encontrava relacionada com o tipo e agressividade do códon mutado no RET, principalmente em tumores que apresentavam mutação RET no códon 634 (controle x 634 p=0,05; controle x 634/791 p= 0,032; 620 x 634 p=0,045; 620 x 634/791 p= 0,002; 620 x 634 + 634/791 p=0,036). Notou-se também correlação positiva entre os níveis de expressão de p27 na localização nuclear, analisada por imunohistoquímica, e o genótipo TT do SNP p27 p.V109G (p=0,03). CONCLUSÕES: Alterações moleculares somáticas no gene p27 nos tumores NEM2 não são frequentes. Entretanto, a redução na expressão e a localização citoplasmática de p27 provavelmente estão associadas a alterações somáticas em outros genes que controlam os processos de fosforilação da proteína p27 (eventos pós-transducionais) / INTRODUCTION: In Multiple Endocrine Neoplasia type 2 (MEN2) the development of medullary thyroid carcinoma (MTC), pheochromocytoma (PHEO) and primary hyperparathyroidism (HPT) are associated with activating germline mutations in RET proto-oncogene. Cases of sporadic MTC may have somatic RET mutations (~ 40%). The phenotypic variability observed in cases with familial MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 indicates the probable involvement of additional genetic events that could be responsible for the clinical differences observed in the affected individuals (age development, progression and aggressiveness of the tumor). Other genetic alterations such as RET double mutations, SNPs and specific haplotypes may influence susceptibility, aggressiveness and MEN2 phenotype modulation. However, studies of other genes involved in the tumorigenesis of MEN2 are still in progress. Recently, it was shown that the activated RET controls the expression of cell cycle inhibitory proteins (p18 and p27). Germline mutations in the p27 gene have recently been associated with the susceptibility to neuroendocrine tumors and are associated with the MEN4 syndrome (Multiple endocrine neoplasia type 4). Somatic inactivating mutations p27 are rarely found in many types of tumors. However, several studies have documented that reduced expression and subcellular location of p27 is controlled by post-transductional changes and/or epigenetic factors. OBJECTIVES: This study aimed to evaluate the role of genes recently associated with RET activated in tumors from MEN2 patients and also check whether polymorphisms in the p27 gene would be acting as modulators of phenotype in a large MEN2 family. PATIENTS: We analyzed 66 tumor samples from 36 patients with clinical and genetic diagnosis of MEN2 and from 28 individuals belonging to a large family with FMTC/MEN2A and RET C620R mutation. METHODS: The analyses of somatic p27, p15, p18 and RET were performed by PCR and direct sequencing of DNA and microsatellite analysis was performed for p27 by PCR and capillary electrophoresis. Expression analysis and subcellular localization of p27 protein were performed by Western blot and immunohistochemistry. The analysis of phenotype modulation in MEN2A families was performed by the amplification of exon 1 of the p27 gene in a whole blood sample. RESULTS: There were no somatic mutations in the p27 gene and also in the p15 and p18 genes. However, we verified a low p27 protein expression in MTC/MEN2 and PHEO/MEN2 that showed a definite correlation with the type and aggressiveness of the mutated RET codon, mainly in those tumors from cases with germline RET codon 634 mutations (control vs 634, p=0,05; control vs 634/791, p= 0,032; 620 vs 634, p=0,045; 620 vs 634/791, p= 0,002; 620 vs 634 + 634/791, p=0,036). It was also verified a positive correlation between the immunohistochemistry expression of nuclear p27 subcellular location and the p27 p.V109G TT genotype (p=0,03). CONCLUSIONS: The reduction in the expression of p27 and its subcellular localization are likely to be associated with somatic changes in other genes that control the processes of phosphorylation of p27 protein through post-transductional events