A stanniocalcina-1 (STC1) é uma glicoproteína caracterizada como um fator endócrino com ação anti-hipercalcêmica/hipocalcêmica originalmente descoberta em peixes. Em mamíferos, esse hormônio está expresso em praticamente todos os tecidos, regula diversas funções biológicas e atua como um fator autócrino/ parácrino. Diversas evidências demonstram o envolvimento da STC1 no desenvolvimento ósseo. Durante a embriogênese, a STC1 é expressa nos primeiros estágios de condensação mesenquimal e, posteriormente, se mantém restrita a preosteoblastos e osteoblastos maduros. Além disso, a STC1 estimula a mineralização óssea através do aumento da expressão de transportadores de fosfato e da osteopontina, uma sialoglicoproteína que atua na mineralização óssea. Células-tronco adultas simbolizam atualmente a fonte mais acessível de células progenitoras utilizadas em terapias celulares e engenharia de tecidos. O tecido adiposo contém uma população de células biológica e clinicamente interessantes denominada células tronco adiposo derivadas (CTADs). Atualmente as CTADs são a melhor fonte de células tronco adultas podendo ser obtidas através de procedimentos minimamente invasivos. Um grande número de estudos têm demonstrado o potencial osteogênico dessas células, no entanto, ainda é um desafio a compreensão dos mecanismos envolvidos na diferenciação osteogênica a partir das CTADs. Neste estudo, foi demonstrado que sete dias de indução osteogênica das CTADs na presença de 50 ng/mL de STC1 aumentaram significativamente a expressão gênica e proteica dos marcadores osteogênicos: fosfatase alcalina (FA), runt related gene 2 (RUNX2) e osteopontina (OPN) O aumento na atividade da enzima FAS foi relacionado diretamente com a maior expressão gênica e proteica. Além disso, a STC1 modula a via de sinalização pAKt/pGSK3-β/βcatenina em preosteoblastos de 7 dias sugerindo que seus efeitos sobre a osteogênese sejam mediados por essa via de sinalização. O peptídeo neuroendócrino CGRP (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina) possui similaridades com STC1 e desempenha um importante papel nas fases iniciais da diferenciação dos osteoblastos. O CGRP ativa o receptor CALCRL, formando um dímero com a proteína transmembrana acessória RAMP1. Para elucidar o envolvimento da STC1 nas vias de sinalização relacionadas a receptores de calcitonina foi investigado o efeito desse hormônio na modulação 8 do receptor do CGRP e receptor de calcitonina (CTR) em CTADs diferenciadas para preosteoblastos e células Hek 293 superexpressoras de CALCRL/RAMP1 e CTR. A STC1 não alterou a expressão dos genes CALCRL e ramp1 durante a osteoblastogênese mas provocou alterações na distribuição espacial do complexo CALCRL/RAMP1 na membrana plasmática de preosteoblastos, induzindo a formação de clusters Além do efeito sobre a sinalização do CGRP a STC1 demonstrou inibir a sinalização da calcitonina diminuindo a produção de cAMP em células transfectadas com CTR. A STC1 não alterou os níveis intracelulares de cálcio e ATP. Esses resultados indicam que, embora não atue diretamente via os receptores CALCRL/RAMP1 e CTR, a STC1 modula a sinalização dos peptídeos CGRP e CT. Estudos mais detalhados sobre os efeitos da STC1 nas diferentes vias de sinalização são necessários para desvendar completamente os mecanismos de diferenciação osteogênicos das CTADs estimuladas por esse hormônio. / The stanniocalcin-1 (STC1) is a glycoprotein characterized as an endocrine factor with anti-hypercalcemic / hypocalcemic action, originally identified in fish. The hormone in mammals is expressed in virtually all tissues and regulates diverse biological functions, acting as an autocrine / paracrine factor. Many evidences demonstrate that STC1 is able to regulate bone development. During embryogenesis the STC1 is expressed in early stages of mesenchymal condensation and thereafter remains restricted to preosteoblast and mature osteoblast. Furthermore, STC1 stimulates bone mineralization by increasing the phosphate transporter expression and osteopontin, a sialoglycoprotein involved in bone mineralization. Adult stem cells currently symbolize the most accessible source of stem cells used in cell therapy and tissue engineering. Adipose tissue contains a population of biological cells clinically interesting called adipose derived stem cells (ASC). Currently, the ASCs are the best source of adult stem cells and can be harvested using minimally invasive procedures. A large number of studies had shown osteogenic potential of these cells, however, it is still a challenge to understand the mechanisms involved in osteogenic differentiation from ASCs This study demonstrated that 7-day preosteoblast in the presence of 50 ng / ml STC1 significantly increased gene and protein expression of osteogenic markers: alkaline phosphatase (ALP), runt related gene 2 (RUNX2), and osteopontin (OPN ). Also, there was an increase in the enzymatic activity of the ALP, possibly related to both gene and protein expression. Furthermore, STC1 modulates pAkt / pGSK3-β / βcatenina signaling in 7-day preosteoblast, suggesting that the STC1 effects on the osteogenesis is mediated by this pathway. The neuroendocrine peptide CGRP (calcitonin gene related peptide) has similarities to STC1 and plays an important role in the early stages of osteoblast differentiation. The active CGRP receptor form a dimer with the receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1). To elucidate the involvement of STC1 in signaling pathways related to calcitonin receptors, it was investigated the STC1 effect on peptide receptor modulating the calcitonin gene related peptide (CGRP) and the calcitonin receptor (CTR) in 7-day preosteoblast, and in Hek 293 cells transfected with CALCRL / RAMP1 and CTR The STC1 did not change the expression of genes CALCRL and ramp1 during osteoblastogenesis but modified the plasma membrane spatial distribution of 10 CALCRL/RAMP1 in preosteoblast. Besides the effect on CGRP signaling, STC1 inhibited the calcitonin signaling by decreasing cAMP production in cells transfected with CTR. The STC1 did not alter intracellular calcium levels and ATP. These results indicated that STC1 does not act on the same receptors for calcitonin and CGRP, but modulates the action of these peptides. Studies on the effects of STC1 in different signaling pathways are necessary for understanding the mechanisms underlying the STC1 ability in enhancing osteoblastogenesis from hASCs.

Transtorno do espectro do autismo (TEA) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por perturbações na comunicação social e pela manifestação de comportamentos, interesses e atividades repetitivos e restritos. Embora a etiologia do autismo ainda seja desconhecida, fortes evidências mostram que a causa pode residir em uma complexa interação de fatores genéticos e ambientais durante o desenvolvimento. A exposição pré-natal ao ácido valproico (VPA) é um dos fatores de risco ambiental mais bem estabelecidos. Por isso, o VPA é comumente utilizado para desencadear um fenótipo do tipo autista em animais. Estudos prévios do nosso grupo demonstram que o tratamento com resveratrol (RSV) aplicado a ratas prenhes foi capaz de prevenir os prejuízos no comportamento social induzidos na prole do grupo VPA. As vias de sinalização CK2/PTEN e AKT/GSK-3β estão relacionadas a processos de plasticidade celular e conectividade neuronal, que são processos que exercem grande impacto em diversos parâmetros, incluindo o comportamento social. Assim, os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar o impacto da exposição pré-natal ao VPA sobre as vias CK2/PTEN e AKT/GSK-3β, nas regiões da amígdala e do hipocampo de ratos machos adultos de 120 dias e 2) avaliar o possível efeito protetor da exposição intra-útero ao RSV sobre as alterações causadas pelo VPA nas vias CK2/PTEN e AKT/GSK-3β. O tratamento com RSV combinado com o VPA induziu uma inibição da PTEN e GSK-3β na amígdala, e o RSV teve um efeito per se, inibindo a GSK-3β nesta mesma estrutura. Além disso, O VPA induziu um aumento de atividade da AKT e redução dos níveis proteicos totais de AKT e PTEN no hipocampo. O RSV foi capaz de prevenir estas alterações, com exceção aos níveis proteicos de AKT. Portanto, nossos resultados indicam que a exposição pré-natal ao VPA altera vias de sinalização importantes durante o desenvolvimento neural, e o tratamento com RSV foi capaz de prevenir alguns de seus efeitos. Estes resultados são muito promissores para estudos futuros e contribuem para uma maior compreensão sobre os processos relacionados com a indução de comportamentos do tipo autista pelo VPA e o possível mecanismo de prevenção do RSV sobre o comportamento social. / Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by disabilities in social communication and repetitive and stereotyped behaviour, interests and activities. Although the etiology is still unknown, there is growing evidence suggesting that the cause lies on a complex interaction between genetic and environmental factors during the development. The pre-natal exposure to valproic acid (VPA) is one of the most well established environmental risk factors. Therefore, the VPA is commonly used to induce an autistic-like phenotype in animals. Previous studies from our group shows that the treatment of pregnant rats with resveratrol (RSV) prevented the social behavior deficits induced in the male offspring of the VPA group. The CK2/PTEN and AKT/GSK-3β pathways are related to processes of cellular plasticity and neuronal connectivity, which are processes that exert a huge impact in several parameters, including the social behavior. Thus, the objectives of this work were: 1) to evaluate the impact of the pre-natal exposure to VPA in the CK2/PTEN and AKT/GSK-3β pathways, in amygdala and hippocampus of adult male rats with 120 days old and 2) to evaluate the possible protective effect of the intra-womb exposition to RSV on VPA-induced changes in CK2/PTEN and AKT/GSK-3β pathways. The treatment with RSV combined with VPA induced an inhibition of PTEN and GSK-3β in amygdala, and the RSV had an effect per se, inhibiting GSK-3β in the same structure. Furthermore, the VPA induced an increase in activity of AKT and a reduction in total protein levels of AKT and PTEN in hippocampus. The RSV prevented these effects, with exception of the protein levels of AKT. Thus, our results indicate that the pre-natal exposition to VPA changes important signaling pathways during the neural development, and the treatment with RSV prevented some of its effects. These findings are very promising for future studies and contribute for a better understanding about processes related to the induction of autistic-like behaviors by VPA and the possible mechanism of prevention by RSV on the social behavior.

Em homens, com o avanço da idade ocorre declínio dos níveis plasmáticos de androgênios, enquanto os níveis de estrogênio permanecem constantes ou aumentados. Isto leva à diminuição da razão androgênio/estrogênio, sugerindo que os estrogênios podem ter um papel no desenvolvimento do câncer de próstata. Os estrogênios estão relacionados à indução da proliferação celular através da sua ligação aos receptores clássicos (ERs) e ao receptor não clássico GPER. Ambos receptores podem ativar as vias de sinalização PI3K e MAPK relacionadas à sobrevivência celular e ter importância no desenvolvimento do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB). Objetivo: Avaliar a relação dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isoformas com as vias PI3K e MAPK pela análise da expressão gênica e proteica dos receptores de estrogênio ERα, ERβ e GPER, pela análise da expressão de proteínas da via MAPK e PI3K e do estrogênio tecidual nos grupos HPB e CaP. Métodos: Tecidos prostáticos provenientes de CaP e de HPB foram submetidos à extração de RNA, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando q-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isformas. A expressão proteica de GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K e c-JUN e a ativação da p38α, ERK1/2, JNK, AKT e GSK3β foram analisadas por Western blot. A técnica de imunofluorescência foi utilizada para verificação da colocalização dos receptores GPER e ERα em estroma e epitélio de HPB e CaP. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão gênica e proteica de ERα e GPER em amostras de CaP comparadas à HPB. Além disso, a ativação da AKT, GSK3β e JNK e a expressão proteica da PI3K e c-JUN foram significativamente aumentadas nos tecidos de CaP enquanto que a expressão proteica de mTOR e a ativação de p38α e ERK estão diminuídas neste grupo. A expressão gênica do ERβ está aumentada no CaP porém não há diferença na expressão proteica entre os grupos. A análise da expressão gênica das isoformas do ERβ mostrou diminuição de ERβ1 e ERβ6 e aumento das isoformas ERβ2 e ERβ5 no CaP. Não foram detectadas as expressões das isoformas ERβ3 e ERβ4 em ambos os grupos. Nossos resultados também mostraram que os receptores GPER e ERα estão colocalizados no núcleo de células estromais de HPB e CaP. Além disso, o GPER está expresso com maior intensidade no epitélio de ambos os grupos enquanto o ERα está expresso com maior intensidade no estroma do CaP. A medida do estrogênio tecidual mostrou aumento deste no tecido de CaP em relação ao de HPB. Conclusões: O presente estudo mostrou aumento do estrogênio e de seus receptores ERα e GPER no CaP em relação ao HPB indicando que há modulação estrogênica na próstata. Além disso, proteínas das vias MAPK e PI3K que podem ser moduladas pela ação estrogênica estão expressas de maneiras diferentes em ambos os grupos. O estudo da ação estrogênica parece ser importante para o entendimento da progressão das doenças prostáticas. / In men with advancing age decline in plasma levels of androgens occurs while estrogen levels remain constant or increased. This leads to the decrease of the androgen / estrogen, suggesting that estrogens may play a role in the development of prostate cancer. Estrogens are related to the induction of cell proliferation by binding to classical receptors (ERs) and non-classical receptor GPER. Both receptors can activate signaling pathways PI3K and MAPK related to cell survival and have importance in the development of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). Objective: To evaluate the relationship of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ with the PI3K and MAPK pathways was performed analysis of gene and protein expression of ERα, ERβ and GPER, analysis of protein expression to MAPK and PI3K pathways and tissue estrogen in PCa and BPH groups. Methods: Prostatic tissues from PCa and BPH underwent RNA extraction, RNA was reverse transcribed to cDNA and evaluated using q-PCR for the expression of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ and their isformas. Protein expression of GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K and c-JUN and activation of p38α, ERK1/2, JNK, AKT and GSK3β were analyzed by Western blot. The immunofluorescence technique was used to verify the colocalization of GPER and ERα receptors in epithelium and stroma of BPH and PCa. Results: Comparisons between the hyperplastic tissue and carcinoma showed a higher gene and protein expression of ERα and GPER in samples of CaP compared to BPH. Furthermore, activation of AKT and GSK3β and JNK protein expression of PI3K and c-JUN were significantly increased in CaP tissues while mTOR protein expression and ERK activation p38α and are decreased in this group. ERβ gene expression is increased in PCa but there is no difference in protein expression between the groups. The analysis of gene expression of ERβ isoforms showed decreased ERβ1 and ERβ6 and increased isoforms ERβ2 and ERβ5 in CaP. Expressions were not detected isoforms and ERβ3 ERβ4 in both groups. Our results also showed that the GPER and ERα receptors are positively colocalized in nucleus of stromal cells of BPH and PCa. In addition, the GPER is expressed more intensely in the epithelium of both groups while ERα is expressed with greater intensity in the stroma of PCa. The extent of this tissue revealed increased estrogen in PCa tissue compared to BPH. Conclusions: The present study showed an increase of estrogen and its receptors ERα and GPER in CaP compared to BPH indicating that there is involvement modulation of estrogen in the prostate. Moreover, proteins of MAPK and PI3K pathways can be modulated by estrogenic activity are expressed differently in both groups. The study of estrogen action appears to be important for understanding the progression of prostatic diseases.

O parasita Schistosoma mansoni é um dos principais causadores da esquistossomose, doença que acomete 200 milhões de indivíduos no mundo. O parasita possui um complexo ciclo de vida composto de seis estágios evolutivos em dois hospedeiros. S. mansoni possui um sofisticado sistema de interação com seus hospedeiros de modo a escapar da resposta imune e interagir com moléculas produzidas por eles. Alguns trabalhos na literatura descreveram o efeito do TNF-α humano sobre o processo de ovoposição do parasita adulto. Nosso trabalho teve por objetivo analisar o perfil de expressão gênica do S. mansoni ao longo de seus estágios de desenvolvimento, avaliar o efeito do TNF-α humano sobre o perfil de expressão gênica do parasita em dois estágios de desenvolvimento e descrever o gene homólogo ao receptor de TNF-α humano em S. mansoni. Para isso, duas plataformas de microarrays distintas foram utilizadas: uma composta por 4000 sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisa e a outra, composta por 44000 sondas de oligonucleotídeos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com estas plataformas foi detectada a expressão de 5798 genes em vermes adultos, sendo que 156 genes apresentavam a transcrição nas fitas senso e anti-senso; 6 destes tiveram confirmadas a transcrição nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 229 genes diferencialmente expressos entre vermes adultos machos e fêmeas. A análise de expressão gênica entre 5 estágios de desenvolvimento do parasita mostrou dois tipos de conjuntos de dados: (i) 1423 genes diferencialmente expressos entre dois estágios subseqüentes de desenvolvimento e (ii) 342 genes com expressão enriquecida em um estágio exclusivamente. 68 destes são transcritos intrônicos que não possuem potencial codificador de proteinas. Um gene ortólogo ao receptor de TNF-α humano (SmTNFR) foi clonado e sequenciado. O transcrito SmTNFR possui 1967pb e codifica uma proteína de 599 aminoácidos. Outros 9 genes codificando elementos conservados da via de sinalização de TNF-α também foram identificados no conjunto de ESTs público, revelando uma via completa de sinalização de TNF-α no parasita. Por fim, identificamos com microarrays o conjunto de genes com expressão alterada pela adição de TNF-α humano em esquistossômulos e vermes adultos. 340 genes tiveram expressão alterada em vermes adultos utilizando a plataforma de cDNA. 411 genes sofreram mudanças de expressão em esquistossômulos e 1093 genes em vermes adultos detectados na plataforma de oligonucleotídeos. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação parasita-hospedeiro em nível molecular. / The parasite Schistosoma mansoni is one of major causative agents of schistosomiasis, a disease which affects 200 million people in the world. The parasite has a complex life cycle with six developmental stages in two hosts. S. mansoni has a sofisticated system of interaction with the hosts, permitting it to escape the immune response and to interact with molecules produced by the hosts. The effect of human TNF-α on adult parasite egg-laying has been described in the literature. The present work intended to analyse the gene expression profile of S. mansoni among its developmental stages, to evaluate the effect of human TNF-α on gene expression profile in two different developmental stages and to describe a homologous gene to human TNF-α receptor in S. mansoni. Two microarrays platfoms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another, comprised by 44000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With these platforms, we detected the expression of 5798 genes in adult worms, of which 156 showed transcription in sense and anti-sense strands; 6 of them had their expression levels confirmed by strand specific Real Time PCR. 229 genes were identified as differentially expressed between male and female adult worms. Gene expression analysis among 5 parasite developmental stages identified two data sets: (i) 1423 differentially expressed genes between two subsequent developmental stages and (ii) 342 expressed genes enriched in one exclusive stage. 68 of them are intronic transcripts with no protein-coding potential. An ortologue to human TNF-α receptor (SmTNFR) was cloned and sequenced. SmTNFR transcritpt has 1967bp and encodes a 599-amino acid protein. Other 9 genes encoding conserved elements of the TNF-α signaling pathway were identified among the public S. mansoni ESTs dataset, thus revealing a complete TNF-α signaling pathway in the parasite. Finally, we identified with microarrays the set of genes that have an altered gene expression upon exposure of schistosomula and adult worms to human TNF-α. 340 genes were identified with altered expression in adult worms using the cDNA platform. 411 genes changed their expression pattern in schistosomula and 1093 genes in adult worms using the oligonucleotide platform. This work represents an important contribution to the understanding of host-parasite interaction at the molecular level.

PrPc é uma glicoproteína de 35 KDa, bastante conservada entre as espécies e essencial no processo de transmissão e patogênese de várias doenças neurodegenerativas como a encefalopatia espongiforme bovina e a doença de Creutzfeldt-Jacob (PRUSINER, 1991). Embora sua função fisiológica ainda seja desconhecida, sabe-se que a patogênese das doenças priônicas requer a sua expressão e é freqüentemente acompanhada do acúmulo no cérebro de uma isoforma anormal de PrPc, designada PrPsc (GABIZON e cols., 1997). Interessado nos possíveis papéis fisiológicos da proteína PrPc, nosso grupo tem se dedicado a estudar as interações que PrPc realiza com outras moléculas. Identificamos e caracterizamos duas interações nas quais PrPc está envolvido: com uma proteína ligante de 66 KDa, recém-identificada como sendo a proteína STI1 (ZANATA e cols., 2002) e com a principal proteína não colagênica da matriz extracelular, a laminina (GRANER e cols., 2000). No presente trabalho, procuramos investigar as vias de sinalização deflagradas por cada uma dessas interações, como também o seu papel nos mecanismos de morte celular programada e memória. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que a interação PrPc-p66 desencadeia uma resposta neuroprotetora na camada neuroblástica da retina de roedores em desenvolvimento via cAMP/PKA. Além disso, verificamos que a interação PrPc-laminina desempenha um importante papel na formação da memória de curta duração através da ativação da via cAMP-PKA-MAPK, e na memória de longa duração ativando somente a via cAMP/PKA. / PrPc is an extremely conserved 35 KDa glycoprotein which seems to be essential during the transmission and pathogenesis of several neurodegenerative diseases like bovine spongiform encephalopathy or Creutzfeldt-Jacob disease (PRUSINER, 1991). Although the physiological function of this protein remains unclear, it is well established that prion diseases require PrPc expression and are often characterized by deposition of an abnormal PrPc isoform, named PrPsc (GABIZON et. al., 1997). Interested in the normal fuction of PrPc, our group has been dedicated to study the interations that PrPc could entertain with other molecules. We have identified and characterized two interactions in which PrPc is involved: with a 66 KDa ligand protein, recently identified as the STI1 protein (ZANATA et. al., 2002) and with laminin (GRANER et. al., 2000). In this work, we have investigated the signaling pathways triggered by these interactions, as well as their relevance in programmed cell death and memory formation mechanisms. We show in this work that PrPc-p66 interaction transduces neuroprotective signals through a cAMP/PKA-dependent pathway in the neuroblastic layer of rodents\' retina. Moreover, we demonstrated that PrPc-laminin interaction has an important role for short-term memory formation through the activation of cAMP-PKA-MAPK pathways and for long-term memory with the activation of the cAMP/PKA pathway only.

O sistema olfatório de mamíferos é capaz de detectar milhares de substâncias químicas diferentes, mesmo em baixas concentrações. Um odorante disperso no ar pode se ligar a um receptor olfatório (OR) iniciando o processo de detecção. Os ORs são membros da super família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Apesar de a via de transdução de sinal de odorantes estar bem descrita, pouco se sabe sobre os seus moduladores. Em 2005, nosso laboratório identificou RIC-8B como um possível fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) que poderia amplificar a atividade da proteína G olfatória (Golf). No presente trabalho mostramos que RIC-8B é capaz de interagir com Gγ13. Procurando os outros componentes desse complexo identificamos Gβ1 como sendo a subunidade Gβ mais expressa no epitélio olfatório. Além disso, RIC-8B, Gαolf, Gβ1 e Gγ13 encontram-se concentrados nos cílios dos neurônios olfatórios e se co-localizam nesse compartimento celular. Nossos experimentos de co-imunoprecipitação mostram que RIC-8B interage mais fortemente com Gαolf, na presença de GDP do que na presença de GTP, como esperado para uma GEF. Curiosamente quando Gβ1 e Gβ13 estão presentes, RIC-8B e Gαolf co-imunoprecipitam igual, independente do nucleotídeo de guanina utilizado. Apesar de, na presença de Gβ1 e Gγ13, não observarmos dissociação física de RIC-8B e Gαolf com a mudança do estado de ativação, o efeito de RIC-8B na produção de AMPc não é afetada. Também mostramos que a quantidade de Gαolf, Gβ1 e Gγ13 presentes na membrana celular aumenta quando estas são co-transfectadas com RIC-8B em células de mamíferos. Nossos resultados apontam para um papel duplo da RIC-8B. Primeiro, RIC-8B poderia funcionar como uma chaperona auxiliando na formação e transporte do complexo heterotrimérico, Golf, em neurônios olfatórios. Em segundo lugar, RIC-8B também atuaria como uma GEF sobre Gαolf, aumentando a produção de AMPc e portanto amplificando a via de transdução de sinal de odorantes. Por fim, acreditamos que um possível papel para Gβ1 e Gγ13 nesse complexo seria funcionar como um andaime molecular, aproximando RIC-8B de seu alvo, Gαolf, potencializando ainda mais a atividade de GEF. / The mammalian olfactory system detects small amounts of thousands of different chemical compounds. Odorant perception starts when an odorant in the air binds to an olfactory receptor (OR). ORs belong to the super family of G-protein coupled receptors (GPCRs). Even though the odorant signaling pathway is well known, little is known about its modulators. In 2005, our lab identified RIC-8B as a putative guanine nucleotide exchange factor (GEF) that is able to interact with the olfactory G-protein (Golf) and amplify its activity. Here we show that RIC-8B also interacts with Gγ13. We also found that Gβ1 is the Gβ subunit that is predominantly expressed in the olfactory epithelium. Furthermore, RIC-8B, Gαolf, Gβ1 and Gγ13 are highly concentrated in the cilia of olfactory neurons and co-localize in this cellular compartment. We also show that RIC-8B interaction with G&#945olf is stronger in the presence of GDP than GTP, as expected for a GEF. Curiously, in the presence of Gβ1 and Gγ13, RIC-8B and Gαolf remain associated, in the presence of both GDP or GTP, probably through an indirect interaction via Gβ1/Gγ13. We also showed that the amounts of Gαolf, Gβ1 and Gγ13 in the cell membrane increase if RIC-8B is cotransfected in the same cell. Our results suggest that RIC-8B plays two roles. First, it may act as a chaperone which assists in the assembly and trafficking of the G protein complex. Second, RIC-8B would also act as a GEF to increase Gαolf dependent cAMP production and thereby amplify odorant signal transduction. Lastly, we believe that Gβ1 and Gγ13 may act as a scaffold to position RIC-8B close to its target, Gαolf, further enhancing the GEF activity.

Em homens, com o avanço da idade ocorre declínio dos níveis plasmáticos de androgênios, enquanto os níveis de estrogênio permanecem constantes ou aumentados. Isto leva à diminuição da razão androgênio/estrogênio, sugerindo que os estrogênios podem ter um papel no desenvolvimento do câncer de próstata. Os estrogênios estão relacionados à indução da proliferação celular através da sua ligação aos receptores clássicos (ERs) e ao receptor não clássico GPER. Ambos receptores podem ativar as vias de sinalização PI3K e MAPK relacionadas à sobrevivência celular e ter importância no desenvolvimento do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB). Objetivo: Avaliar a relação dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isoformas com as vias PI3K e MAPK pela análise da expressão gênica e proteica dos receptores de estrogênio ERα, ERβ e GPER, pela análise da expressão de proteínas da via MAPK e PI3K e do estrogênio tecidual nos grupos HPB e CaP. Métodos: Tecidos prostáticos provenientes de CaP e de HPB foram submetidos à extração de RNA, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando q-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isformas. A expressão proteica de GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K e c-JUN e a ativação da p38α, ERK1/2, JNK, AKT e GSK3β foram analisadas por Western blot. A técnica de imunofluorescência foi utilizada para verificação da colocalização dos receptores GPER e ERα em estroma e epitélio de HPB e CaP. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão gênica e proteica de ERα e GPER em amostras de CaP comparadas à HPB. Além disso, a ativação da AKT, GSK3β e JNK e a expressão proteica da PI3K e c-JUN foram significativamente aumentadas nos tecidos de CaP enquanto que a expressão proteica de mTOR e a ativação de p38α e ERK estão diminuídas neste grupo. A expressão gênica do ERβ está aumentada no CaP porém não há diferença na expressão proteica entre os grupos. A análise da expressão gênica das isoformas do ERβ mostrou diminuição de ERβ1 e ERβ6 e aumento das isoformas ERβ2 e ERβ5 no CaP. Não foram detectadas as expressões das isoformas ERβ3 e ERβ4 em ambos os grupos. Nossos resultados também mostraram que os receptores GPER e ERα estão colocalizados no núcleo de células estromais de HPB e CaP. Além disso, o GPER está expresso com maior intensidade no epitélio de ambos os grupos enquanto o ERα está expresso com maior intensidade no estroma do CaP. A medida do estrogênio tecidual mostrou aumento deste no tecido de CaP em relação ao de HPB. Conclusões: O presente estudo mostrou aumento do estrogênio e de seus receptores ERα e GPER no CaP em relação ao HPB indicando que há modulação estrogênica na próstata. Além disso, proteínas das vias MAPK e PI3K que podem ser moduladas pela ação estrogênica estão expressas de maneiras diferentes em ambos os grupos. O estudo da ação estrogênica parece ser importante para o entendimento da progressão das doenças prostáticas. / In men with advancing age decline in plasma levels of androgens occurs while estrogen levels remain constant or increased. This leads to the decrease of the androgen / estrogen, suggesting that estrogens may play a role in the development of prostate cancer. Estrogens are related to the induction of cell proliferation by binding to classical receptors (ERs) and non-classical receptor GPER. Both receptors can activate signaling pathways PI3K and MAPK related to cell survival and have importance in the development of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). Objective: To evaluate the relationship of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ with the PI3K and MAPK pathways was performed analysis of gene and protein expression of ERα, ERβ and GPER, analysis of protein expression to MAPK and PI3K pathways and tissue estrogen in PCa and BPH groups. Methods: Prostatic tissues from PCa and BPH underwent RNA extraction, RNA was reverse transcribed to cDNA and evaluated using q-PCR for the expression of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ and their isformas. Protein expression of GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K and c-JUN and activation of p38α, ERK1/2, JNK, AKT and GSK3β were analyzed by Western blot. The immunofluorescence technique was used to verify the colocalization of GPER and ERα receptors in epithelium and stroma of BPH and PCa. Results: Comparisons between the hyperplastic tissue and carcinoma showed a higher gene and protein expression of ERα and GPER in samples of CaP compared to BPH. Furthermore, activation of AKT and GSK3β and JNK protein expression of PI3K and c-JUN were significantly increased in CaP tissues while mTOR protein expression and ERK activation p38α and are decreased in this group. ERβ gene expression is increased in PCa but there is no difference in protein expression between the groups. The analysis of gene expression of ERβ isoforms showed decreased ERβ1 and ERβ6 and increased isoforms ERβ2 and ERβ5 in CaP. Expressions were not detected isoforms and ERβ3 ERβ4 in both groups. Our results also showed that the GPER and ERα receptors are positively colocalized in nucleus of stromal cells of BPH and PCa. In addition, the GPER is expressed more intensely in the epithelium of both groups while ERα is expressed with greater intensity in the stroma of PCa. The extent of this tissue revealed increased estrogen in PCa tissue compared to BPH. Conclusions: The present study showed an increase of estrogen and its receptors ERα and GPER in CaP compared to BPH indicating that there is involvement modulation of estrogen in the prostate. Moreover, proteins of MAPK and PI3K pathways can be modulated by estrogenic activity are expressed differently in both groups. The study of estrogen action appears to be important for understanding the progression of prostatic diseases.

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_D.pdf: 3971415 bytes, checksum: b23d47eff6b16f53235b5d581fcd3ae6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1 / Abstract: Many biotic and abiotic stresses such as drought, salinity and pathogen attack are responsible for major crop losses around the world. Several genes are regulated in response to these factors to counteract the stress effects and promote plant tolerance. Understanding the molecular mechanisms as well as the roles of genes and proteins involved in stress signaling pathways is key to a better understanding of plant tolerance. We report in chapter I the functional analysis of a TGA biding factor located in the promoter region of NIMIN-1 that is highly induced by SA during plant defense against pathogen attack (biotic stress). TGA factors play a key role in plant defense by binding to the promoter region of defense genes, inducing their expression. Salicylic acid (SA) induces the expression of the gene encoding NIMIN-1, which interacts with NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance. In this work we investigated whether the TGA2-binding motif TGACG located upstream of the NIMIN-1 gene is necessary for SA induction of NIMIN-1 expression. A mutated version of the NIMIN-1 promoter was created by site-directed mutagenesis. We generated T-DNA constructs in which native NIMIN-1 and mutated promoters were fused to green fluorescent protein and ?-glucuronidase reporters. We produced transgenic Arabidopsis plants and observed NIMIN-1 promoter-driven green fluorescent protein expression in the roots, petiole and leaves. Constructs were also agroinfiltrated into the leaves to evaluate gene expression of mutagenized and native promoters driving expression of GUS using quantitative real-time RT-PCR. We characterized the normal gene response to SA and compared it to the response of the mutant version of the NIMIN-1 promoter. Both the native NIMIN-1 construct and an endogenous copy of NIMIN-1 were induced by SA. However, the mutated promoter construct was much less sensitive to SA than the native NIMIN-1 promoter, indicating that this TGA2-binding motif is directly involved in the modulation of SA-induced NIMIN-1 expression in Arabidopsis. In chapter II we describe the characterization of a sugarcane ScCBL1 protein which displays high sequence identity to the calcium binding protein family calcineurin B-like (CBL) from plants. Using the two-hybrid system our group has shown that ScCBL1 binds to a protein kinase (ScCIPK8). Previous work done in our laboratory also showed that ScCIPK8 is involved in carbohydrate metabolism and that it is differentially expressed in response to ABA. ScCBL1 was cloned, expressed and purified by one round of affinity chromatography using a Ni-NTA resin and the purified eluted protein was used for structural analysis. Spectroscopic analysis by circular dichroism (CD) showed that ScCBL1 is mainly composed of ?-helices agreeing with secondary structure prediction by PredictProtein server. Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) analysis showed that ScCBL1 sample is homogeneous and monodisperse in solution and that the protein undergoes an oligomeric change when DTT is added, with a decrease in scattering intensity (I(0)) by a factor of 1,56 for samples with the same concentration, together with a decrease in the radius of gyration of 10 Å. SAXS experiments also showed that ScCBL1 is pentameric in its native state and the protein undergoes a change in its oligomeric state to a trimer when DTT is added. SAXS experiments also showed the protein is folded in solution and ab initio modeling of ScCBL1 protein envelope together with the pair-distribution function P(r) indicates that the protein has a rod-like, elongated shape. An initial crystallization screening with ScCBL1 monodisperse samples (confirmed by DLS experiments) was carried out and some crystallization signals were obtained, including a single crystal of around 0.05 mm in length. These data shed light on the structural features of ScCBL1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O endotélio reveste a parede vascular e possui função essencial na manutenção da homeostase. A célula endotelial é capaz de perceber estímulos extracelulares, como fatores químicos e mecânicos, transmitir a informação para dentro da célula e regular sua função e fenótipo. Neste sentido, investigamos os mecanismos moleculares associados as células endoteliais em dois contextos importantes de intervenções vasculares 1) nos stents farmacológicos, onde a rapamicina exerce funções antiproliferativas e pró-trombogênicas, e 2) na revascularização cardíaca por ponte de safena, onde o alto estiramento mecânico exerce grande impacto no remodelamento vascular e no fenótipo da célula endotelial. A rapamicina pertence à classe de drogas limus, bastante utilizadas nos stents farmacológicos usados no procedimento de desobstrução vascular. Além de sua função antiproliferativa, exploramos os efeitos deletérios associados a pró-trombogênese. Os dados demonstraram que a rapamicina ativa o receptor de TGF independentemente de seu ligante TGFbeta, promovendo aumento na expressão da PAI-1 (pró-trombogênica), alteração no fenótipo endotelial (Transição endotélio-mesenquimal - EndMT) e na formação de fibras de estresse. Os efeitos observados são dependentes da ativação de Smad2 e independentes da via clássica antiproliferativa por mTOR. Experimentos in vivo mostraram que o tratamento com inibidor do receptor de TGF diminui os efeitos pró-trombogênicos e a expressão de PAI-1 induzidos pela rapamicina em artérias carótidas de camundongos. A ponte de safena é um procedimento bastante utilizado na cirurgia de revascularização cardíaca e a arterialização do segmento venoso submetido ao estresse hemodinâmico arterial resulta em remodelamento vascular, que influencia o sucesso do procedimento. Nossos dados demonstram que a célula endotelial humana de veia safena humana (hSVEC), susceptível as modificações do tipo EndMT induzido quimicamente (estímulo pró-fibrótico e pró-inflamatório), não expressou o mesmo comportamento em resposta ao aumento de estiramento mecânico que ocorre durante a arterialização venosa. Entretanto, detectamos uma pronunciada redução dos filamentos de actina, modulação no padrão de ativação da cofilina e na proporção de actina glomerular (G-actina) entre citoplasma e núcleo, com redução da biodisponibilidade de NO. De modo interessante, demonstramos que a redução no filamento de actina é específica para a célula endotelial venosa, não sendo observado em células endoteliais de origem arterial de aorta e coronária. Em conjunto, os dados mostram que 1) efeitos pró-trombogênicos associados a rapamicina são mediados por ativação do receptor de TGF independente do seu ligante e da atividade antiproliferativa da droga e 2) a adaptação da célula endotelial venosa ao estiramento mecânico envolve modulação da síntese/degradação de filamentos de actina e redução na biodisponibilidade de NO. Estes novos elementos sobre o mecanismo de transdução de estímulos químicos e físicos pelo endotélio poderão ser explorados terapeuticamente para modular a plasticidade endotelial em disfunções cardiovasculares / Endothelium is the inner layer in vascular wall and displays an essential role in the maintenance of cardiovascular homeostasis. Endothelial cell senses the extracellular stimuli, such as chemical and mechanical factors, transduce and process these signals to regulate cell function and phenotype. Here, we investigated molecular underpinning of the endothelial cells under two important scenarios: 1) in drug-eluting stents, where rapamycin exerts antiproliferative and undesirable prothrombogenic functions, and 2) in vein graft bypass surgery, where increased stretch modulates vascular remodeling and endothelial cell phenotype. Rapamycin belongs to the class of limus drugs and is widely used in drug eluting stents (DES) to vascular restenosis. In addition to its antiproliferative function, we explore the deleterious effects associated with prothrombogenesis. Our data demonstrated that rapamycin activates TGF receptor independent of its ligand TGFbeta, in concert with promotion of PAI-1 expression (prothrombogenic), changes in endothelial phenotype (Endothelial to Mesenchymal Transition - EndMT) and stress fibers induction. These effects are Smad2 dependent and independent of the classical antiproliferative mTOR pathway of rapamycin. Our in vivo experiments showed that TGF receptor inhibitor treatment decreases prothrombogenic effects and PAI-1 expression induced by rapamycin in mice carotid arteries. Saphenous vein is widely used in coronary artery bypass surgery (CABG) and the vein arterialization remodeling in response to the increased stress influences graft patency. Our data demonstrated that human saphenous vein endothelial cell (hSVEC) is susceptible to chemically induced endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) by pro-fibrotic and pro-inflammatory stimuli. On the other hand, physical stimulus associated with high stretch failed to induce EndMT. However, we detected a pronounced decrease of actin filaments, modulation of the cofilin activation, changes in the proportion of glomerular actin (G-actin) between cytoplasm and nucleus, and reduction of NO bioavailability. Interestingly, the reduction of actin fibers by high stretch is specific to venous endothelial cell since arterial endothelial cells from aorta, and coronary artery failed to display the response. Altogether, our data show that 1) the thrombogenic effects of rapamycin are mediated by TGF receptor activation independent of its ligand and independent of the antiproliferative pathway of the drug, and 2) the adaptation of venous endothelial cell to mechanical stretch involves synthesis/degradation of actin filaments and reduced NO bioavailability. These new elements on signal transduction of endothelial cells in response to chemical and physical stimuli may be therapeutically explored to modulate endothelial plasticity in cardiovascular disorders

O gene SLC2A4 codifica a proteína GLUT4, fundamental na homeostasia glicêmica. OBJETIVO: Investigar o efeito do diabetes na expressão do GLUT4 pela atividade contrátil. MÉTODOS: Músculos sóleos de ratos não diabéticos (ND) e diabéticos tratados com insulina (DI) ou salina (DS) foram incubados e contraídos. A expressão de GLUT4, pAMPK e CAMKII foram analisados por PCR e Western blotting, e a atividade de MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a e TR<font face=\"Symbol\">a1 por gel shift. Células C2C12 transfectadas com plasmídeos contendo os sítios de ligação para MEF2, HIF, e TR foram tratadas com AICAR ou cafeína. RESULTADOS: Em animais ND e DI, a contração aumentou o conteúdo de GLUT4, mas não nos DS. Em animais ND, a contração aumentou a atividade da AMPK e dos fatores MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1, mas não nos DS. Em animais ND, os inibidores de AMPK e CAMKII aboliram o aumento do GLUT4 e da atividade de MEF2D e GEF. Em células C2C12 a cafeína e a AMPK ativaram os 3 sítios. CONCLUSÃO: O diabetes abole o aumento da expressão do GLUT4 sob a atividade contrátil devido a redução da atividade de MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1 e AMPK. / The SLC2A4 gene encodes the GLUT4 protein, which is essential in glucose homeostasis. OBJECTIVE: To investigate the diabetes effect on muscle contraction-induced in SLC2A4 gene expression. METHODS: Soleus muscles of Non diabetic rats (ND) and diabetic treated with insulin (DI) or saline (DS) were incubated and contracted. The GLUT4, pAMPK and CAMKII expressions were analyzed by PCR and Western blotting, and the MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity by gel shift. C2C12 cells transfected with plasmids containing the binding sites for MEF2, HIF, and TR were treated with AICAR or caffeine. RESULTS: Contraction increased the GLUT4 amount in animals ND and DI, but not in DS. In ND animals, contraction increased AMPK, MEF2D, GEF and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity, but not in DS. In ND animals, AMPK and CAMKII inhibitors abolished the GLUT4 increase as like MEF2D and GEF activity. In C2C12 cells AMPK and caffeine activated the 3 sites. CONCLUSION: Diabetes abolishes the muscle contraction-induced GLUT4 increase due to reduced of MEF2D, GEF, TR<font face=\"Symbol\">a1 and AMPK activity.