Em homens, com o avanço da idade ocorre declínio dos níveis plasmáticos de androgênios, enquanto os níveis de estrogênio permanecem constantes ou aumentados. Isto leva à diminuição da razão androgênio/estrogênio, sugerindo que os estrogênios podem ter um papel no desenvolvimento do câncer de próstata. Os estrogênios estão relacionados à indução da proliferação celular através da sua ligação aos receptores clássicos (ERs) e ao receptor não clássico GPER. Ambos receptores podem ativar as vias de sinalização PI3K e MAPK relacionadas à sobrevivência celular e ter importância no desenvolvimento do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB). Objetivo: Avaliar a relação dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isoformas com as vias PI3K e MAPK pela análise da expressão gênica e proteica dos receptores de estrogênio ERα, ERβ e GPER, pela análise da expressão de proteínas da via MAPK e PI3K e do estrogênio tecidual nos grupos HPB e CaP. Métodos: Tecidos prostáticos provenientes de CaP e de HPB foram submetidos à extração de RNA, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando q-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio GPER, ERα, ERβ e suas isformas. A expressão proteica de GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K e c-JUN e a ativação da p38α, ERK1/2, JNK, AKT e GSK3β foram analisadas por Western blot. A técnica de imunofluorescência foi utilizada para verificação da colocalização dos receptores GPER e ERα em estroma e epitélio de HPB e CaP. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão gênica e proteica de ERα e GPER em amostras de CaP comparadas à HPB. Além disso, a ativação da AKT, GSK3β e JNK e a expressão proteica da PI3K e c-JUN foram significativamente aumentadas nos tecidos de CaP enquanto que a expressão proteica de mTOR e a ativação de p38α e ERK estão diminuídas neste grupo. A expressão gênica do ERβ está aumentada no CaP porém não há diferença na expressão proteica entre os grupos. A análise da expressão gênica das isoformas do ERβ mostrou diminuição de ERβ1 e ERβ6 e aumento das isoformas ERβ2 e ERβ5 no CaP. Não foram detectadas as expressões das isoformas ERβ3 e ERβ4 em ambos os grupos. Nossos resultados também mostraram que os receptores GPER e ERα estão colocalizados no núcleo de células estromais de HPB e CaP. Além disso, o GPER está expresso com maior intensidade no epitélio de ambos os grupos enquanto o ERα está expresso com maior intensidade no estroma do CaP. A medida do estrogênio tecidual mostrou aumento deste no tecido de CaP em relação ao de HPB. Conclusões: O presente estudo mostrou aumento do estrogênio e de seus receptores ERα e GPER no CaP em relação ao HPB indicando que há modulação estrogênica na próstata. Além disso, proteínas das vias MAPK e PI3K que podem ser moduladas pela ação estrogênica estão expressas de maneiras diferentes em ambos os grupos. O estudo da ação estrogênica parece ser importante para o entendimento da progressão das doenças prostáticas. / In men with advancing age decline in plasma levels of androgens occurs while estrogen levels remain constant or increased. This leads to the decrease of the androgen / estrogen, suggesting that estrogens may play a role in the development of prostate cancer. Estrogens are related to the induction of cell proliferation by binding to classical receptors (ERs) and non-classical receptor GPER. Both receptors can activate signaling pathways PI3K and MAPK related to cell survival and have importance in the development of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). Objective: To evaluate the relationship of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ with the PI3K and MAPK pathways was performed analysis of gene and protein expression of ERα, ERβ and GPER, analysis of protein expression to MAPK and PI3K pathways and tissue estrogen in PCa and BPH groups. Methods: Prostatic tissues from PCa and BPH underwent RNA extraction, RNA was reverse transcribed to cDNA and evaluated using q-PCR for the expression of estrogen receptors GPER, ERα, ERβ and their isformas. Protein expression of GPER, ERα, ERβ, mTOR, PI3K and c-JUN and activation of p38α, ERK1/2, JNK, AKT and GSK3β were analyzed by Western blot. The immunofluorescence technique was used to verify the colocalization of GPER and ERα receptors in epithelium and stroma of BPH and PCa. Results: Comparisons between the hyperplastic tissue and carcinoma showed a higher gene and protein expression of ERα and GPER in samples of CaP compared to BPH. Furthermore, activation of AKT and GSK3β and JNK protein expression of PI3K and c-JUN were significantly increased in CaP tissues while mTOR protein expression and ERK activation p38α and are decreased in this group. ERβ gene expression is increased in PCa but there is no difference in protein expression between the groups. The analysis of gene expression of ERβ isoforms showed decreased ERβ1 and ERβ6 and increased isoforms ERβ2 and ERβ5 in CaP. Expressions were not detected isoforms and ERβ3 ERβ4 in both groups. Our results also showed that the GPER and ERα receptors are positively colocalized in nucleus of stromal cells of BPH and PCa. In addition, the GPER is expressed more intensely in the epithelium of both groups while ERα is expressed with greater intensity in the stroma of PCa. The extent of this tissue revealed increased estrogen in PCa tissue compared to BPH. Conclusions: The present study showed an increase of estrogen and its receptors ERα and GPER in CaP compared to BPH indicating that there is involvement modulation of estrogen in the prostate. Moreover, proteins of MAPK and PI3K pathways can be modulated by estrogenic activity are expressed differently in both groups. The study of estrogen action appears to be important for understanding the progression of prostatic diseases.

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_D.pdf: 3971415 bytes, checksum: b23d47eff6b16f53235b5d581fcd3ae6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1 / Abstract: Many biotic and abiotic stresses such as drought, salinity and pathogen attack are responsible for major crop losses around the world. Several genes are regulated in response to these factors to counteract the stress effects and promote plant tolerance. Understanding the molecular mechanisms as well as the roles of genes and proteins involved in stress signaling pathways is key to a better understanding of plant tolerance. We report in chapter I the functional analysis of a TGA biding factor located in the promoter region of NIMIN-1 that is highly induced by SA during plant defense against pathogen attack (biotic stress). TGA factors play a key role in plant defense by binding to the promoter region of defense genes, inducing their expression. Salicylic acid (SA) induces the expression of the gene encoding NIMIN-1, which interacts with NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance. In this work we investigated whether the TGA2-binding motif TGACG located upstream of the NIMIN-1 gene is necessary for SA induction of NIMIN-1 expression. A mutated version of the NIMIN-1 promoter was created by site-directed mutagenesis. We generated T-DNA constructs in which native NIMIN-1 and mutated promoters were fused to green fluorescent protein and ?-glucuronidase reporters. We produced transgenic Arabidopsis plants and observed NIMIN-1 promoter-driven green fluorescent protein expression in the roots, petiole and leaves. Constructs were also agroinfiltrated into the leaves to evaluate gene expression of mutagenized and native promoters driving expression of GUS using quantitative real-time RT-PCR. We characterized the normal gene response to SA and compared it to the response of the mutant version of the NIMIN-1 promoter. Both the native NIMIN-1 construct and an endogenous copy of NIMIN-1 were induced by SA. However, the mutated promoter construct was much less sensitive to SA than the native NIMIN-1 promoter, indicating that this TGA2-binding motif is directly involved in the modulation of SA-induced NIMIN-1 expression in Arabidopsis. In chapter II we describe the characterization of a sugarcane ScCBL1 protein which displays high sequence identity to the calcium binding protein family calcineurin B-like (CBL) from plants. Using the two-hybrid system our group has shown that ScCBL1 binds to a protein kinase (ScCIPK8). Previous work done in our laboratory also showed that ScCIPK8 is involved in carbohydrate metabolism and that it is differentially expressed in response to ABA. ScCBL1 was cloned, expressed and purified by one round of affinity chromatography using a Ni-NTA resin and the purified eluted protein was used for structural analysis. Spectroscopic analysis by circular dichroism (CD) showed that ScCBL1 is mainly composed of ?-helices agreeing with secondary structure prediction by PredictProtein server. Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) analysis showed that ScCBL1 sample is homogeneous and monodisperse in solution and that the protein undergoes an oligomeric change when DTT is added, with a decrease in scattering intensity (I(0)) by a factor of 1,56 for samples with the same concentration, together with a decrease in the radius of gyration of 10 Å. SAXS experiments also showed that ScCBL1 is pentameric in its native state and the protein undergoes a change in its oligomeric state to a trimer when DTT is added. SAXS experiments also showed the protein is folded in solution and ab initio modeling of ScCBL1 protein envelope together with the pair-distribution function P(r) indicates that the protein has a rod-like, elongated shape. An initial crystallization screening with ScCBL1 monodisperse samples (confirmed by DLS experiments) was carried out and some crystallization signals were obtained, including a single crystal of around 0.05 mm in length. These data shed light on the structural features of ScCBL1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O gene SLC2A4 codifica a proteína GLUT4, fundamental na homeostasia glicêmica. OBJETIVO: Investigar o efeito do diabetes na expressão do GLUT4 pela atividade contrátil. MÉTODOS: Músculos sóleos de ratos não diabéticos (ND) e diabéticos tratados com insulina (DI) ou salina (DS) foram incubados e contraídos. A expressão de GLUT4, pAMPK e CAMKII foram analisados por PCR e Western blotting, e a atividade de MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a e TR<font face=\"Symbol\">a1 por gel shift. Células C2C12 transfectadas com plasmídeos contendo os sítios de ligação para MEF2, HIF, e TR foram tratadas com AICAR ou cafeína. RESULTADOS: Em animais ND e DI, a contração aumentou o conteúdo de GLUT4, mas não nos DS. Em animais ND, a contração aumentou a atividade da AMPK e dos fatores MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1, mas não nos DS. Em animais ND, os inibidores de AMPK e CAMKII aboliram o aumento do GLUT4 e da atividade de MEF2D e GEF. Em células C2C12 a cafeína e a AMPK ativaram os 3 sítios. CONCLUSÃO: O diabetes abole o aumento da expressão do GLUT4 sob a atividade contrátil devido a redução da atividade de MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1 e AMPK. / The SLC2A4 gene encodes the GLUT4 protein, which is essential in glucose homeostasis. OBJECTIVE: To investigate the diabetes effect on muscle contraction-induced in SLC2A4 gene expression. METHODS: Soleus muscles of Non diabetic rats (ND) and diabetic treated with insulin (DI) or saline (DS) were incubated and contracted. The GLUT4, pAMPK and CAMKII expressions were analyzed by PCR and Western blotting, and the MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity by gel shift. C2C12 cells transfected with plasmids containing the binding sites for MEF2, HIF, and TR were treated with AICAR or caffeine. RESULTS: Contraction increased the GLUT4 amount in animals ND and DI, but not in DS. In ND animals, contraction increased AMPK, MEF2D, GEF and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity, but not in DS. In ND animals, AMPK and CAMKII inhibitors abolished the GLUT4 increase as like MEF2D and GEF activity. In C2C12 cells AMPK and caffeine activated the 3 sites. CONCLUSION: Diabetes abolishes the muscle contraction-induced GLUT4 increase due to reduced of MEF2D, GEF, TR<font face=\"Symbol\">a1 and AMPK activity.

Orientador: Hugo Enrique Hernandez Figueroa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-22T03:58:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MuriloOliveirade_M.pdf: 26552033 bytes, checksum: 9a9022f8aa6d5e4e72047f0798ad57da (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A complexidade dos sistemas eletrônicos atuais cria a demanda por mais componentes num mesmo sistema, ao mesmo tempo em que exige sistemas mais compactos. Esta dissertação apresenta o desenvolvimento, fabricação e testes de uma antena GSM quadribanda, integrada a um módulo rastreador automotivo produzido no mercado nacional. A antena opera dentro das faixas de freqüências correspondentes _as bandas GSM 850/900/1800/1900, com desempenho adequado para uso no sistema de comunicação GSM, estando em conformidade com testes de TRP, sendo o produto final homologado pela ANATEL e agências reguladoras de outros países. A antena é um monopolo com dobras especiais para ajuste de ressonância. O casamento da antena com o sistema _e realizado via um toco em curto dobrado, não trivial, otimizado para um casamento banda-larga ao longo do espectro GSM ocupado / Abstract: The complexity of today's electronic systems creates demand for more quantity and less cost of components in a system, at the same time that the system must be made smaller. This dissertation presents the design and tests of a quadband GSM antenna, embedded into an existing automotive tracking module produced in Brazil. The antenna operates within the GSM 850/900/1800/1900 bands, with performance suitable for its use in the GSM system, being in conformance with TRP tests. The final product is approved by Brazil's regulatory agency ANATEL and by other countries' agencies. The antenna is a monopole with special bandings for resonance adjustment. The antenna matching is achieved with a shorted bent stub, non-trivial, optimized for a broadband matching over the occupied GSM spectrum / Mestrado / Telecomunicações e Telemática / Mestre em Engenharia Elétrica

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Análises de expressão em larga escala identificaram aumento da expressão de miR-146b-5p no carcinoma papilífero (PTC), o subtipo mais prevalente do câncer de tiróide. Uma análise in silico apontou SMAD4, um membro da via de sinalização de TGFbeta, como potencial alvo de miR-146b-5p. A via de TGFbeta é uma via inibitória da proliferação da célula folicular, contudo o mecanismo de escape do sinal inibitório de TGFbeta pela célula tumoral tiroideana permanence não esclarecido. A expressão de miR-146b-5p em linhagem normal PCCL3 diminuiu os níveis de SMAD4, conferindo resistência ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta e aumentando a proliferação celular. A inibição de miR-146b-5p em linhagens de PTC aumentou os níveis de SMAD4, restaurou a resposta ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta, diminuindo a proliferação celular. Os dados obtidos neste trabalho revelam o papel oncogênico de miR-146b-5p como um regulador negativo da via de TGFbeta. / MicroRNAs are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation. Large-scale analyses revealed that miR-146b-5p is overexpressed in papillary carcinomas (PTC), the most prevalent form of thyroid cancer. A computational analysis indicated SMAD4, an important member of the TGF-<font face=\"Symbol\">b signaling pathway, as a putative target of miR-146b-5p. The TGFbeta pathway is a negative regulator of thyroid follicular cell growth, and the mechanism by which thyroid cancer cells evade its inhibitory signal remains unclear. The overexpression of miR-146b-5p in normal follicular PCCL3 cells decreased SMAD4 levels, conferred resistance to TGFbeta anti-proliferative signal and increased cell proliferation. The specific inhibition of miR-146b-5p in papillary carcinoma cell lines significantly increased SMAD4 levels, restored the TGFbeta signal transduction and decreased cell growth. Altogether, our data confirm the oncogenic role of miR-146b-5p in thyroid follicular cells as a negative regulator of TGFbeta signaling pathway.

A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.

O treinamento físico aeróbio (TFA) foi estabelecido como uma conduta importante capaz de alterar a musculatura esquelética humana. Os microRNAs (miRs) surgiram como importantes reguladores de processos biológicos, modulando a expressão de genes pós-transcricionalmente. Os myomiRs são miRs específico do músculo esquelético, em especial o miR-206, que é necessário para uma eficiente regeneração das fibras musculares esqueléticas. No entanto, a expressão do miR-206 em resposta ao TFA, não é completamente comprendida. O objetivo do presente estudo foi determinar os padrões de expressão dos myomiRs na musculatura esquelética humana. Doze voluntários saudáveis foram biopsiados pré e pós-treinamento físico. As expressões gênicas e proteicas envolvidas na miogênese foram observadas, incluindo; PAX-7, MYF5, MYOD, MRF4, MYOG, CD31 e FSTL. Além disso, a freqüência cardíaca (FC), pressão arterial média (PAM), consumo máximo de oxigênio (VO2max), fluxo sanguineo no antebraço (FSA) e condutância vascular no antebraço (CVA), foram avaliados. Ademais, os myomiRs foram analisados por PCR em tempo real. O treinamento físico aeróbio foi realizado durante 16 semanas. Todas as variáveis foram reavaliadas após o treinamento. Os indivíduos apresentaram um aumento nas expressões dos myomiRs, em especial do miRs-206 de 93%. Estas alterações foram acompanhadas por aumento nas expressões dos genes; PAX-7, MYOD, MYF5, MFR4, MYOG e FSTL, respectivamente. No entanto, quando analisamos as expressões proteicas, houve redução na FSTL e PAX-7, de 24%, 29%, respectivamente. Além disso, em MYOD, CD31, MYOG e MHC houve aumentos de 21%, 41%, 79% e 94%, respectivamente. Ademais, houve uma diminuição na frequência cardíaca de reposuso de 12,5% e aumentos no VO2pico, FSA e CVA de 14,1%, 68%, 63%, respectivamente. Estes resultados sugerem que em indivíduos saudáveis o miRs-206 é altamente expresso após o treinamento físico aeróbio, dessa forma, modulando localmente processos miogênicos regenerativos em homens saudáveis / Endurance training (ET) has been established as an important phenotype capable of altering the human skeletal muscle. MicroRNAs (miRs) have emerged as important regulators of numerous biological processes by modulating gene expression at the post-transcriptional level. The myomiRs are particulars miRs of muscles, in special skeletal muscle-specific miR-206 that is required for efficient regeneration muscle fiber. However, the expression of myomiRs and in special miR-206 in response to ET in human skeletal muscle is not completely understood. Twelve healthy volunteers were biopsied pre and post period endurance training. Most of the biological processes involved in the transcriptional regulation were observed, including PAX-7, MYF5, MYOD, MRF4, MYOG, CD31 and FSTL, analyzed by real time PCR. Moreover, heart rate (HR), mean blood pressure (MBP), maximal exercise capacity (VO2peak) forearm blood flow (FBF) and forearm vascular conductance (FVC) were evaluated. The myomiRs levels analyzed by real-time PCR. Endurance training was performed for 16 weeks. All variables were re-assessed following completion of the training period. After endurance training, the individuals showed an increase in myomiRs, in special of 93% in human skeletal muscle in miRNA-206 levels. These alterations were accompanied by increase in PAX-7, MYOD, MYF5, MFR4, MYOG and FSTL gene expression, respectively. However, when analyzed by western blot comparing pre and post period there were reduction in FSTL of 24% and PAX-7 of 29% in protein levels, but in MYOD, CD31, MYOG and MHC there were increase of 21%, 41%, 79% and 94% in protein levels, respectively. In addition, there was a decrease in hear rate of 12.5% and increases in VO2peak of 14.1%, FBF of 68% and FVC of 63%.These results suggest that in healthy individuals the miR-206 is highly expressed after endurance training, thus modulating locally important parts in myogenic processes in humans

A superexpressão de receptores HER-2 é anormalidade celular de grande relevância clínica no câncer de mama. Ela ocorre em aproximadamente 30% de carcinomas de mama incluindo lesões pré-neoplásicas e malignas, e está associada a prognóstico desfavorável. A hiperativação dos receptores HER-2, consequência natural de sua superexpressão, promove proliferação celular aberrante e tumorigênese. Admite-se que a ativação e envio de sinais via HER-2 possa acontecer quando estes receptores se encontram em compartimentos específicos da membrana celular, os lipid rafts. Assim, um número maior de HER-2 poderia implicar em maior quantidade de lipis rafts. Para testar essa hipótese, usamos modelo de transformação oncogênica que nos permitiu avaliar, especificamente, os efeitos da superexpressão de HER-2 e identificar a quantidade de lipid rafts. Para isso utilizamos a linhagem celular HB4a, derivada de célula epitelial luminal do tecido mamário humano normal com baixa expressão de HER-2; e a linhagem HB4aC5.2, um clone derivado da HB4a, que superexpressa receptores HER-2. Nas células HB4aC5.2, a superexpressão de HER-2 foi acompanhada pelo aumento dos lipid rafts na membrana celular, bem como, hiperativação de sinais de sobrevivência, proliferação (aumento da ativação de proteínas Akt e Erk1/2, respectivamente), e taxa de proliferação celular duas vezes mais rápida que a linhagem normal HB4a. Adicionalmente, a superexpressão de HER-2 foi associada com aumento da lipogênese celular (fenótipo lipogênico), dependente do aumento de ativação da enzima FASN e da superexpressão de DEPTOR. A FASN é responsável pela síntese de palmitato, utilizado para formação de lipid rafts. A superexpressão de DEPTOR, por modular a atividade transcricional de PPAR?, pode evitar a lipotoxicidade do excesso de palmitato. Além disso, DEPTOR, por sua capacidade em reduzir atividade do complexo mTORC1, contribui para sobrevivência celular dependente da proteína Akt. Em continuidade, consideramos, como segunda hipótese, que a desestruturação de lipid rafts poderia influenciar negativamente a ativação dos receptores HER-2. Para isso tratamos, as mesmas linhagens celulares anteriormente descritas, com ácido docosaexaenoico (DHA), um tipo de ácido graxo ômega-3. Nossos resultados mostraram que, nas células HB4aC5.2, o tratamento com DHA desestruturou os lipid rafts, inibiu a sinalização iniciada pelos receptores HER-2 ( diminuição da ativação das proteínas Akt, Erk1/2, FASN, atividade transcricional de PPAR? e expressão de DEPTOR) e reverteu o fenótipo lipogênico. Adiciona-se que essas modificações celulares e moleculares foram acompanhadas por indução significativa de morte e apoptose. As mesmas alterações não foram observadas nas células normais HB4a. Em conclusão, o presente estudo reforça a associação entre a presença de HER-2 e lipid rafts. Adicionalmente aponta que a desestruturação de lipid rafts por DHA reduz a sinalização de HER-2. Por fim, sugere que distúrbios em lipid rafts, induzidos por DHA, possam representar ferramenta útil no controle da sinalização aberrante deflagrada pelos receptores HER-2, e aponta potencial terapêutico na suplementação de DHA para quimioprevenção e tratamento do câncer de mama HER-2 positivo. / HER-2 receptor overexpression is a cellular abnormality of great clinical significance in breast cancer. It is described in approximately 30% of breast carcinomas, including preneoplasic and malignant lesions, and is associated with poor prognosis. Hyperactivation of HER-2 receptors, a natural consequence of its overexpression, promotes aberrant cell proliferation and tumorigenesis. For signal activation and transduction to occur, HER-2 must be localized in specific compartments in the cell membrane: the lipid rafts. Therefore, we hypothesize that a greater number of HER-2 receptors could indicate a greater quantity of lipid rafts. To test this, we used an oncogenic transformation model that specifically allowed assessment of the effects of HER-2 overexpression and identification of the quantity of lipid rafts: an HB4a cell line derived from normal human breast tissue luminal epithelial cells with low HER-2 expression, and an HB4aC5.2 cell line, a clone derived from HB4a that overexpresses HER-2 receptors. In the HB4aC5.2 cells, HER-2 overexpression was accompanied by an increase in lipid rafts in cell membranes as well as hyperactivation of survival signals, proliferation (increased activation of the proteins Akt and ERK1/2, respectively), and an increased rate of proliferation, compared to the normal HB4a line. In addition, HER-2 overexpression was associated with increased cellular lipogenesis (lipogenic phenotype), dependent on the increased activation of the FASN enzyme and the overexpression of DEPTOR. FASN is responsible for the synthesis of palmitate, used to synthesize lipid rafts. Overexpression of DEPTOR by modulating PPAR? transcriptional activity, may avoid lipotoxicity from excess palmitate. Moreover, DEPTOR, with its ability to reduce mTORC1 complex activity, contributes to cell survival dependent on Akt. To continue, we considered as a second hypothesis that the disruption of lipid rafts could negatively influence HER-2 receptor activation. For this, we treated the same cell lines described above with docosahexaenoic acid (DHA), a omega-3 fatty acid. Our results showed that in HB4aC5.2 cells DHA treatment disrupted the lipid rafts, inhibited signaling initiated by HER-2 receptors (reduced activation of Akt, ERK1/2, and FASN proteins, PPAR? transcriptional activity, and DEPTOR expression) and reversed the lipogenic phenotype. In addition, these cellular and molecular changes were accompanied by a significant induction of apoptosis and death. The same changes were not observed in normal HB4a cells. In conclusion, the present study reinforces the association between HER-2 presence and lipid rafts. It also indicates that the disruption of lipid rafts by DHA reduces HER-2 signaling. Finally, it suggests that DHA-induced disturbances in lipid rafts may represent a useful tool in controlling aberrant signaling triggered by HER-2 receptors, and indicate therapeutic potential in DHA supplementation for chemoprevention and treatment of HER-2 positive breast cancer.

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.