A soja constitui uma das culturas mais importantes mundialmente, tanto social quanto economicamente. Consequentemente, informações moleculares sobre processos de desenvolvimento, bem como conhecimento detalhado das interações entre condições estressoras e a resposta da planta a fatores ambientais são necessários. A identificação e caracterização de genes que respondem a condições ambientais específicas constituem um passo inicial no entendimento dos processos adaptativos. Proteínas ricas em glicina (GRPs) são polipeptídeos contendo um grande número do aminoácido glicina em sua estrutura primária. Os genes codificantes de GRPs são regulados ao longo do desenvolvimento e regulados por auxina, ABA, frio, ferimentos, luz, ritmo circadiano, salinidade, seca, patógenos e encharcamento. Entretanto, há pouca informação sobre GRPs de plantas e seus papéis no desenvolvimento e resposta a estresses. As GRPs podem ser divididas em quatro classes (I, II, III, IV) de acordo com sua estrutura primária e presença de domínios característicos. A classe IV é composta por proteínas ligantes de RNA. Domínios adicionais permitem dividir a classe IV de GRPs em quatro subclasses (IVa, IVb, IVc, IVd). A subclasse IVc é representada por proteínas contendo um cold-schock domain (CSD) e dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. O objetivo do presente estudo foi: (i) identificar e caracterizar os genes codificantes de classe IV de GRPs, (ii) verificar a padrão de expressão dos genes codificantes da subclasse IVc de GRPs e (iii) produzir plantas de soja transgênicas expressando o gene AtGRP2, o qual foi mostrado estar envolvido na floração e desenvolvimento da semente em Arabidopsis, e também poderia desempenhar um papel na aclimatação ao frio. Um total de 47 genes codificantes da classe IV de GRPs foi identificado no genoma da soja: 19 da subclasse IVa, sete da IVb, seis da IVc e 15 da IVd. Análises in silico indicaram uma expressão preferencial de todos os genes codificantes da subclasse IVc em tecidos em desenvolvimento. Análises de RT-qPCR revelaram que plantas jovens e maduras exibem uma expressão mais alta em folhas do que em outros órgãos, com exceção dos genes GRP2L_4/5 que tiveram expressão mais alta em sementes. GRP2L_4/5 e GRP2L_2 foram induzidos em resposta a baixas temperaturas. Sob estresse com ABA a expressão de todos os genes foi reprimida em folhas e/ou raízes, com exceção do gene GRP2L_2 que foi induzido em raízes. Em resposta a infecção com Phakopsora pachyrhizi, a expressão de GRP2L_2 e GRP2L_3 foi mais alta e precoce no genótipo suscetível quando comparada com o resistente, enquanto que a resposta de GRP2L_4/5 e GRP2L_6 foi mais tardia no genótipo resistente. Ainda, embriões somáticos secundários das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora de soja foram usados para introduzir o gene AtGRP2 no genoma da soja por bombardeamento e sistema bombardeamento/Agrobacterium. Seis eventos de transformação independentes foram confirmados por PCR. No presente momento as plantas estão em desenvolvimento em frascos de vidro. No presente estudo a classe IV de GRPs em soja foi identificada e caracterizada. Este é o primeiro passo para elucidar o papel destas proteínas em plantas. / Molecular information on plant developmental process, as well as detailed knowledge of the interaction between stress conditions and plant response to environmental factors are essential for understanding the adaptive response. Glycine-Rich Proteins (GRP) have the amino acid glycine well represented in their primary structure. The genes encoding GRPs are developmentally regulated and induced by auxin, ABA, cold, wound, light, circadian rhythm, salinity, drought, pathogens, and flooding. However, there is scarce information about plant GRPs and its role on development and stress response. The GRPs can be divided into four classes (I, II, II and IV) according to their primary structure and the presence of characteristic domains. Class IV is composed by RNA-binding proteins. Additional domains permit to split class IV GRPs into four subclasses (IVa, IVb, IVc and IVd). Subclass IVc is represented by proteins containing a Cold-Shock Domain (CSD) and retroviral-like CCHC zinc fingers. The goal of the present study was: (i) to identify and characterize the genes encoding class IV GRPs, (ii) to verify the relative expression of genes encoding subclass IVc GRPs and (iii) to produce transgenic soybean plants expressing the AtGRP2 gene, which was shown to be involved in Arabidopsis flower and seed development, and can also play a role in cold acclimation. A total of 47 genes encoding class IV GRPs were found in the soybean genome: 19 from IVa, seven from IVb, six from IVc and 15 from IVd subclasses. In silico analyses indicated a preferential expression of all genes encoding subclass IVc GRPs in tissues under development. RT-qPCR analyses revealed that both young and mature plants exhibit relative higher expression of subclass IVc GRPs in leaves than in other organs, with exception of GRP2L_4/5 genes that have higher expression in seeds. The GRP2L_4/5 and GRP2L_2 were up-regulated in response to low temperatures. Under ABA stress the expression of all genes was down-regulated in leaves and roots, with exception of GRP2L_2 gene that was up-regulated in roots. In response to Phakopsora pachyrhizi infection, GRP2L_2 and GRP2L_3 expression was higher and earlier in the susceptible genotype when compared with that of the resistant one, while GRP2L_4/5 and GRP2_6 respond later in the resistant genotype. Furthermore, secondary somatic embryos of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora soybean cultivars were used to introduce the AtGRP2 gene into the soybean genome by particle bombardment and bombardment/Agrobacterium system. Six independent Bragg transformation events were confirmed by PCR. In the present moment the plants are under development in glass flasks. In the present study the soybean class IV GRPs were identified and characterized. This is the first step to elucidate the role of these proteins in plants.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agrícolas no cenário econômico e social brasileiro. Na cultura de cana-de-açúcar o estresse hídrico é o principal fator limitante para o aumento de produtividade, sendo responsável por alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares nas plantas, que podem deflagrar perturbações metabólicas que ativam a morte celular programada (MCP). Sabendo-se que o gene BI-1 apresenta o potencial de reduzir os efeitos da MCP desencadeado por estresses bióticos e abióticos em plantas, este trabalho teve como objetivo analisar plantas transgênicas de cana-de-açúcar que expressam o gene BI-1 de Arabidopsis thaliana (AtBI-1) em condições de estresse hídrico. Também, plantas transgênicas e controle foram inoculadas com o fungo Puccinia melanocephala demonstrando que o processo de transformação genética com o gene AtBI-1 alterou as características pré existentes de resistência a ferrugem marrom nas plantas transgênicas. Os estudos de tolerância ao défict hídrico foram realizados em dois experimentos, o experimento 1 com plantas transgênicas e controles de 90 dias e o experimento 2 com plantas de 60 dias. Plantas do experimento 1 foram analisadas quanto características morfológicas como número de estômatos e tricomas, altura e circunferência do colmo e após ficarem 24 dias sem água foram analisadas quanto a taxa fotossintética, comportamento estomático e conteúdo relativo de água nas folhas, enquanto no experimento 2 as plantas foram analisadas quanto aos teores de prolina, atividades das enzimas guaiacol peroxidase (GPOX), ascorbato peroxidase (APX) e catalase (CAT) após as plantas ficarem 17 dias sob déficit hídrico. Estas enzimas estão envolvidas em processos de desativação de elementos ativos de oxigênio. Os resultados demonstraram que as plantas transgênicas expressando o gene AtBI-1 possuem fenótipo de menor altura, e maior taxa fotossintética, maior comportamento estomático e maior conteúdo relativo de água nas folhas, e assim apresentam maior tolerância ao déficit hídrico que plantas controle. Contudo, houve baixo acúmulo de prolina, baixa atividade da GPOX, APX e CAT nas plantas transgênicas durante o estresse hídrico comparada com as plantas controle do mesmo tratamento. Porém foi observado alta atividade constitutiva da catalase nas plantas transgênicas. A atividade da catalase nestas plantas transgênicas sugere a possibilidade da interação entre AtBI-1 e calmudolinas. Futuros estudos podem contribuir para elucidar se a proteína BI-1 é essencial para a ativação das catalases por calmudolinas. / Sugarcane is one of the main agricultural crops in the Brazilian social and economic scenario. Water stress in the culture of sugarcane is the main limiting factor for increasing productivity accounting for physiological, biochemical and molecular plants that can trigger metabolic disturbances activating programmed cell death (MCP). Knowing that the BI-1 gene has the potential to reduce the effects of MCP triggered by biotic and abiotic stresses in plants, this study aimed to analyze transgenic sugarcane that express the BI-1 gene of Arabidopsis thaliana (AtBI-1) under water stress. Also, transgenic and control plants were inoculated with Puccinia melanocephala fungus demonstrating that the genetic transformation process with the AtBI-1 gene altered the pre-existing characteristics of brown rust resistance in transgenic plants. Studies of tolerance to water deficit were performed in two experiments, the experiment 1 was prepared with transgenic and control plants with 90 days and the experiment 2 used plants with 60 days. Plants from experiment 1 were analyzed as for morphological characteristics such as number of stomata and trichomes, height and diameter of stem after plants being under water for 24 days as were analyzed photosynthetic rate, stomatal behavior, relative water content in leaves while in the experiment 2, plants were analyzed for the levels of proline, enzyme activities of guaiacol peroxidase (GPOX), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) under water deficit for 17 days. These enzymes are involved in deactivation of active elements oxygen. The results demonstrated that the transgenic plants expressing the AtBI-1 gene presented the phenotype of lower height, higher index of leaf area, higher photosynthetic rate, higher stomatal behavior and higher relative water content in leaves than control plants increasing tolerance to drought stress. However, there were low levels of proline, low activity of GPOX activity, APX and CAT in transgenic plants during drought stress compared to control plants of the same treatment, but the observed high constitutive activity of catalase in transgenic plants. Catalase activity in these transgenic plants suggests the possibility of interaction between AtBI-1 and calmudolinas. Future studies may contribute to understand whether the BI-1protein is essential for the activation of catalase by calmudolinas.

A soja constitui uma das culturas mais importantes mundialmente, tanto social quanto economicamente. Consequentemente, informações moleculares sobre processos de desenvolvimento, bem como conhecimento detalhado das interações entre condições estressoras e a resposta da planta a fatores ambientais são necessários. A identificação e caracterização de genes que respondem a condições ambientais específicas constituem um passo inicial no entendimento dos processos adaptativos. Proteínas ricas em glicina (GRPs) são polipeptídeos contendo um grande número do aminoácido glicina em sua estrutura primária. Os genes codificantes de GRPs são regulados ao longo do desenvolvimento e regulados por auxina, ABA, frio, ferimentos, luz, ritmo circadiano, salinidade, seca, patógenos e encharcamento. Entretanto, há pouca informação sobre GRPs de plantas e seus papéis no desenvolvimento e resposta a estresses. As GRPs podem ser divididas em quatro classes (I, II, III, IV) de acordo com sua estrutura primária e presença de domínios característicos. A classe IV é composta por proteínas ligantes de RNA. Domínios adicionais permitem dividir a classe IV de GRPs em quatro subclasses (IVa, IVb, IVc, IVd). A subclasse IVc é representada por proteínas contendo um cold-schock domain (CSD) e dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. O objetivo do presente estudo foi: (i) identificar e caracterizar os genes codificantes de classe IV de GRPs, (ii) verificar a padrão de expressão dos genes codificantes da subclasse IVc de GRPs e (iii) produzir plantas de soja transgênicas expressando o gene AtGRP2, o qual foi mostrado estar envolvido na floração e desenvolvimento da semente em Arabidopsis, e também poderia desempenhar um papel na aclimatação ao frio. Um total de 47 genes codificantes da classe IV de GRPs foi identificado no genoma da soja: 19 da subclasse IVa, sete da IVb, seis da IVc e 15 da IVd. Análises in silico indicaram uma expressão preferencial de todos os genes codificantes da subclasse IVc em tecidos em desenvolvimento. Análises de RT-qPCR revelaram que plantas jovens e maduras exibem uma expressão mais alta em folhas do que em outros órgãos, com exceção dos genes GRP2L_4/5 que tiveram expressão mais alta em sementes. GRP2L_4/5 e GRP2L_2 foram induzidos em resposta a baixas temperaturas. Sob estresse com ABA a expressão de todos os genes foi reprimida em folhas e/ou raízes, com exceção do gene GRP2L_2 que foi induzido em raízes. Em resposta a infecção com Phakopsora pachyrhizi, a expressão de GRP2L_2 e GRP2L_3 foi mais alta e precoce no genótipo suscetível quando comparada com o resistente, enquanto que a resposta de GRP2L_4/5 e GRP2L_6 foi mais tardia no genótipo resistente. Ainda, embriões somáticos secundários das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora de soja foram usados para introduzir o gene AtGRP2 no genoma da soja por bombardeamento e sistema bombardeamento/Agrobacterium. Seis eventos de transformação independentes foram confirmados por PCR. No presente momento as plantas estão em desenvolvimento em frascos de vidro. No presente estudo a classe IV de GRPs em soja foi identificada e caracterizada. Este é o primeiro passo para elucidar o papel destas proteínas em plantas. / Molecular information on plant developmental process, as well as detailed knowledge of the interaction between stress conditions and plant response to environmental factors are essential for understanding the adaptive response. Glycine-Rich Proteins (GRP) have the amino acid glycine well represented in their primary structure. The genes encoding GRPs are developmentally regulated and induced by auxin, ABA, cold, wound, light, circadian rhythm, salinity, drought, pathogens, and flooding. However, there is scarce information about plant GRPs and its role on development and stress response. The GRPs can be divided into four classes (I, II, II and IV) according to their primary structure and the presence of characteristic domains. Class IV is composed by RNA-binding proteins. Additional domains permit to split class IV GRPs into four subclasses (IVa, IVb, IVc and IVd). Subclass IVc is represented by proteins containing a Cold-Shock Domain (CSD) and retroviral-like CCHC zinc fingers. The goal of the present study was: (i) to identify and characterize the genes encoding class IV GRPs, (ii) to verify the relative expression of genes encoding subclass IVc GRPs and (iii) to produce transgenic soybean plants expressing the AtGRP2 gene, which was shown to be involved in Arabidopsis flower and seed development, and can also play a role in cold acclimation. A total of 47 genes encoding class IV GRPs were found in the soybean genome: 19 from IVa, seven from IVb, six from IVc and 15 from IVd subclasses. In silico analyses indicated a preferential expression of all genes encoding subclass IVc GRPs in tissues under development. RT-qPCR analyses revealed that both young and mature plants exhibit relative higher expression of subclass IVc GRPs in leaves than in other organs, with exception of GRP2L_4/5 genes that have higher expression in seeds. The GRP2L_4/5 and GRP2L_2 were up-regulated in response to low temperatures. Under ABA stress the expression of all genes was down-regulated in leaves and roots, with exception of GRP2L_2 gene that was up-regulated in roots. In response to Phakopsora pachyrhizi infection, GRP2L_2 and GRP2L_3 expression was higher and earlier in the susceptible genotype when compared with that of the resistant one, while GRP2L_4/5 and GRP2_6 respond later in the resistant genotype. Furthermore, secondary somatic embryos of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora soybean cultivars were used to introduce the AtGRP2 gene into the soybean genome by particle bombardment and bombardment/Agrobacterium system. Six independent Bragg transformation events were confirmed by PCR. In the present moment the plants are under development in glass flasks. In the present study the soybean class IV GRPs were identified and characterized. This is the first step to elucidate the role of these proteins in plants.

A soja constitui uma das culturas mais importantes mundialmente, tanto social quanto economicamente. Consequentemente, informações moleculares sobre processos de desenvolvimento, bem como conhecimento detalhado das interações entre condições estressoras e a resposta da planta a fatores ambientais são necessários. A identificação e caracterização de genes que respondem a condições ambientais específicas constituem um passo inicial no entendimento dos processos adaptativos. Proteínas ricas em glicina (GRPs) são polipeptídeos contendo um grande número do aminoácido glicina em sua estrutura primária. Os genes codificantes de GRPs são regulados ao longo do desenvolvimento e regulados por auxina, ABA, frio, ferimentos, luz, ritmo circadiano, salinidade, seca, patógenos e encharcamento. Entretanto, há pouca informação sobre GRPs de plantas e seus papéis no desenvolvimento e resposta a estresses. As GRPs podem ser divididas em quatro classes (I, II, III, IV) de acordo com sua estrutura primária e presença de domínios característicos. A classe IV é composta por proteínas ligantes de RNA. Domínios adicionais permitem dividir a classe IV de GRPs em quatro subclasses (IVa, IVb, IVc, IVd). A subclasse IVc é representada por proteínas contendo um cold-schock domain (CSD) e dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. O objetivo do presente estudo foi: (i) identificar e caracterizar os genes codificantes de classe IV de GRPs, (ii) verificar a padrão de expressão dos genes codificantes da subclasse IVc de GRPs e (iii) produzir plantas de soja transgênicas expressando o gene AtGRP2, o qual foi mostrado estar envolvido na floração e desenvolvimento da semente em Arabidopsis, e também poderia desempenhar um papel na aclimatação ao frio. Um total de 47 genes codificantes da classe IV de GRPs foi identificado no genoma da soja: 19 da subclasse IVa, sete da IVb, seis da IVc e 15 da IVd. Análises in silico indicaram uma expressão preferencial de todos os genes codificantes da subclasse IVc em tecidos em desenvolvimento. Análises de RT-qPCR revelaram que plantas jovens e maduras exibem uma expressão mais alta em folhas do que em outros órgãos, com exceção dos genes GRP2L_4/5 que tiveram expressão mais alta em sementes. GRP2L_4/5 e GRP2L_2 foram induzidos em resposta a baixas temperaturas. Sob estresse com ABA a expressão de todos os genes foi reprimida em folhas e/ou raízes, com exceção do gene GRP2L_2 que foi induzido em raízes. Em resposta a infecção com Phakopsora pachyrhizi, a expressão de GRP2L_2 e GRP2L_3 foi mais alta e precoce no genótipo suscetível quando comparada com o resistente, enquanto que a resposta de GRP2L_4/5 e GRP2L_6 foi mais tardia no genótipo resistente. Ainda, embriões somáticos secundários das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora de soja foram usados para introduzir o gene AtGRP2 no genoma da soja por bombardeamento e sistema bombardeamento/Agrobacterium. Seis eventos de transformação independentes foram confirmados por PCR. No presente momento as plantas estão em desenvolvimento em frascos de vidro. No presente estudo a classe IV de GRPs em soja foi identificada e caracterizada. Este é o primeiro passo para elucidar o papel destas proteínas em plantas. / Molecular information on plant developmental process, as well as detailed knowledge of the interaction between stress conditions and plant response to environmental factors are essential for understanding the adaptive response. Glycine-Rich Proteins (GRP) have the amino acid glycine well represented in their primary structure. The genes encoding GRPs are developmentally regulated and induced by auxin, ABA, cold, wound, light, circadian rhythm, salinity, drought, pathogens, and flooding. However, there is scarce information about plant GRPs and its role on development and stress response. The GRPs can be divided into four classes (I, II, II and IV) according to their primary structure and the presence of characteristic domains. Class IV is composed by RNA-binding proteins. Additional domains permit to split class IV GRPs into four subclasses (IVa, IVb, IVc and IVd). Subclass IVc is represented by proteins containing a Cold-Shock Domain (CSD) and retroviral-like CCHC zinc fingers. The goal of the present study was: (i) to identify and characterize the genes encoding class IV GRPs, (ii) to verify the relative expression of genes encoding subclass IVc GRPs and (iii) to produce transgenic soybean plants expressing the AtGRP2 gene, which was shown to be involved in Arabidopsis flower and seed development, and can also play a role in cold acclimation. A total of 47 genes encoding class IV GRPs were found in the soybean genome: 19 from IVa, seven from IVb, six from IVc and 15 from IVd subclasses. In silico analyses indicated a preferential expression of all genes encoding subclass IVc GRPs in tissues under development. RT-qPCR analyses revealed that both young and mature plants exhibit relative higher expression of subclass IVc GRPs in leaves than in other organs, with exception of GRP2L_4/5 genes that have higher expression in seeds. The GRP2L_4/5 and GRP2L_2 were up-regulated in response to low temperatures. Under ABA stress the expression of all genes was down-regulated in leaves and roots, with exception of GRP2L_2 gene that was up-regulated in roots. In response to Phakopsora pachyrhizi infection, GRP2L_2 and GRP2L_3 expression was higher and earlier in the susceptible genotype when compared with that of the resistant one, while GRP2L_4/5 and GRP2_6 respond later in the resistant genotype. Furthermore, secondary somatic embryos of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora soybean cultivars were used to introduce the AtGRP2 gene into the soybean genome by particle bombardment and bombardment/Agrobacterium system. Six independent Bragg transformation events were confirmed by PCR. In the present moment the plants are under development in glass flasks. In the present study the soybean class IV GRPs were identified and characterized. This is the first step to elucidate the role of these proteins in plants.

A transformação genética pode contribuir substancialmente para o melhoramento genético do feijão, permitindo a introdução de genes que contribuam para o aumento da produtividade e estabilidade da produção. A metodologia de transformação genética de feijão (Phaseolus vulgaris), ora disponível (biobalística em embriões) apresenta baixa eficiência, o que dificulta o seu uso em pesquisas envolvendo a transferência de genes e não permite seu uso de forma ampla em programas de melhoramento genético da cultura. Um método efetivo e reprodutível de regeneração de plantas, a partir de células ou tecidos, é essencial em estudos de genética e melhoramento envolvendo a transferência de genes pela engenharia genética. Os métodos de transformação somente terão sucesso se tivermos previamente estabelecido um protocolo eficiente de regeneração de plantas a partir de tecidos potencialmente transformáveis. O objetivo principal deste trabalho é o desenvolvimento de um protocolo de transformação genética de feijão via Agrobacterium. O primeiro passo no desenvolvimento deste protocolo foi o estabelecimento de um sistema eficiente de regeneração de plantas a partir de calos. O passo seguinte foi o estabelecimento de metodologia da transformação de calos via Agrobacterium. / The genetic transformation can contribute substantially with the bean (Phaseolus vulgaris L.) breeding, allowing the introduction of genes to improve productivity and its stability. The transformation methodology of bean, now available (biolistic in embryos), is not efficient, which prevents its use in bean breeding programs. A reproducible and effective method of plant regeneration, from cells or tissues is essential in genetics studies and plant breeding, involving the genetic engineering. The transformation methods will only work if we can previously establish an efficient plant regeneration protocol from tissues with potential for transformation. The aim of this work was to develop an efficient transformation protocol of bean via Agrobacterium. The first step was to establish an efficient system of plant regeneration from callus, followed by the establishment of a transformation methodology via Agrobacterium.

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Lectinas são proteínas que se ligam a carboidrados e estão envolvidas em diferentes processos biológicos, inclusive na defesa de plantas contra diversos tipos de patógenos. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi introduzir o gene da lectina bvl de Bauhinia veriegata em diferentes explantes da cultivar IRGA 426 a fim de se obter plantas transformadas geneticamente com o gene bvl. Para a obtenção das plantas transformadas foram usados calos organogênicos, mesocótilos e a técnica de transformação de botões florais. No experimento para a obtenção de calos via organogênese indireta, o 2,4-D na concentração de 2,0 mg L-1 foi efetiva, induzindo uma média de 47,3 calos, sendo 89% calos organogênicos aptos para à regeneração. Na regeneração dos calos, observou-se a formação média de 12,73 brotações no meio com 0,5 mg L-1 de ANA e 2,5 mg L-1 de BAP. Já na regeneração do mesocótilo, o incremento de BAP no meio de cultivo reduziu diretamente o comprimento das brotações primárias, no entanto esse efeito foi compensado pelo aumento da multiplicação dos explantes, principalmente com 5 mg L-1 de BAP, onde observou-se uma média de 21,16 brotações. Após o processo de infecção com o vetor pH7WGD2::bvl e seleção com antibiótico, os calos da cv. IRGA 426 apresentaram hiperhidricidade e não foram regenerados. Dos mesocótilos que passaram pela transformação, 20,66% sobreviveram ao meio de seleção. A análise de PCR revelou uma eficiência de transformação de 6,35% em relação ao total de brotos e, a partir do Western Blot, confirmou-se que 3 plantas estavam expressando a lectina BVL. No método de transformação imersão floral, em todas as sementes putativamente transformadas o gene gfp estava ativo, sendo observada a expressão transiente. De acordo com os resultados obtidos, os protocolos de regeneração dos explantes foram eficientes. Análises moleculares das plantas transformadas deverão ser realizadas para determinar o número de cópias do transgene no gDNA e o papel da lectina BVL na fisiologia vegetal e defesa da planta de arroz. / Rio Grande do Sul is the largest producer of irrigated rice in Brazil. However, due to the region's climate, the productive potential of crop farms is still limited by fungal diseases. The use of tolerant or resistant cultivars is a sustainable alternative to reduce loss in rice production. Genetic transformation, coupled with tissue culture, has been assisting vegetable breeding in the production of crops resistant and tolerant to abiotic/biotic stress, contributing to the sustainability of rice culture. Lectins are proteins that bind to carbohydrates and are involved in several biological processes, including defense against diseases in plants. The main goal of this study was the insertion of the Bauhinia variegata BVL Lectin gene in different explants of cultivar IRGA 426 to obtain transformed plants with the BVL gene. To obtain the transformed plants, organogenic callus, mesocotyls and flower buds transformation technique were used. In the experiment for obtaining callus through indirect organogenisis, 2,4-D at 2,0 mg L-1 was effective, inducing the formation of an average of 47,3 calluses, of which 89% of embriogenic callus were apt for regeneration. In the regeneration step, an average of 12,73 sprouts in medium with 0,5 mg L-1 of ANA and 2,5 mg L-1 of BAP was observed. In the mesocotyls regeneration, the BAP increment in the growing medium directly reduced the length of primary shoots; however, this effect was compensated by the increse of explant multiplication, mainly with 5 mg L-1 of BAP, where an average of 21,16 sprouts were observed. After infection with the pH7WGD2::bvl vector and antibiotic selection, the callus of cv. IRGA 426 showed hyperhydricity and were not regenerated. Of the mesocotyls that went through transformation, 20,66% survived the selection medium. PCR analysis revealed a transformation efficiency of 6,35% in all sprouts and, through Western Blot, 3 plants were confirmed to express the BVL lectin. In the floral immersion transformation method, in all transformed seeds the GFP gene was active, with transient expression being observed. Based on the results obtained, the explant regeneration protocols were efficient. Molecular analysis of the transformed plants should be made to determine the number of copies of the transgene in gDNA and the role of BVL lectin in the plant physiology and its role in the plant's defense.

A transformação genética está se tornando uma importante ferramenta, dentro dos programas de melhoramento genético de citros, e uma alternativa para contornar barreiras naturais da espécie, que dificultam o desenvolvimento de novas variedades pelo melhoramento convencional. Entretanto, os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado num baixo número de plantas transgênicas. Com o objetivo de estudar fatores que possam influenciar o processo de transformação genética de citros via Agrobacterium tumefaciens analisou-se o efeito do uso de acetoseringona em diferentes etapas do processo, as condições de incubação dos explantes durante e após o período de co-cultivo e o tipo de corte do explante. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro da variedade de laranja doce ‘Hamlin’ (Citrus sinensis L. Osbeck.) e da variedade citrange ‘Carrizo’ (C. sinensis x Poncirus trifoliata Raf.), inoculados com a estirpe EHA 105 de A. tumefaciens, contendo o plasmídeo p35SGUSINT, com o gene de seleção que codifica a enzima neomicina fosfotransferase II (nptII) e o gene repórter uidA que codifica a enzima b-glucuronidase (gus). O protocolo básico para transformação genética foi com a inoculação dos explantes por 20 minutos, com o período de co-cultivo de 3 dias em me io de cultura suplementado com acetoseringona (100 mM) e transferidos para meio de cultura de seleção, constituído de meio de cultura EME, suplementado com BAP (1mg L -1 ), canamicina (100 mg L -1 ) e cefotaxime (500 mg L -1 ). As avaliações foram realizadas após 5-6 semanas de incubação, determinando-se o número de explantes com gemas adventícias, o número de gemas adventícias gus + e calculando-se a eficiência de transformação genética, definida pela relação entre o número de gemas gus + regeneradas e o número de explantes inoculados. Pelos resultados obtidos pôde-se observar uma maior eficiência de transformação genética para a variedade citrange ‘Carrizo’; e que a eficiência da transformação genética aumentou, principalmente para a variedade de laranja doce 'Hamlin', quando a incubação do material durante o período de co-cultivo foi feita sob temperaturas inferiores a 27 °C. A suplementação do meio de cultura de co-cultivo com acetoseringona depende do pH deste meio de cultura. A utilização de explantes seccionados longitudinalmente não se mostrou favorável devido ao crescimento excessivo da bactéria na superfície do explante. / Genetic transformation is an important biotechnological tool in citrus genetic breeding programs, and an alternative to overcome natural barriers to the development of new varieties, by conventional breeding. However, the protocols used for citrus genetic transformation have resulted in a low number of transgenic plants. Therefore, this research evaluated some factors that might influence citrus genetic transformation process via Agrobacterium tumefaciens, such as: the addition of acetosyringone in different steps of the process, the explant incubation conditions during and after the period of co-cultivation, and the explant type cut. Epicotyl segments from seedlings of 'Hamlin' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and ‘Carrizo’ citrange (C. sinensis L. Osbeck x Poncirus trifoliata Raf.) were inoculated with EHA 105 strain of A. tumefaciens harboring the binary plasmid p35SGUSINT containing the selection gene for neomicyn phosphotransferase II (nptII) and the reporter gene uidA for b-glucuronidase (GUS). The basic protocol for genetic transformation included the explant inoculation for 20 minutes, and 3 days of co-cultivation in the culture medium supplemented with acetosyringone (100 mM). The epicotyl segments were transferred to selection culture medium, EME culture medium supplemented with BAP (1 mg L -1 ), kanamycin (100 mg L -1 ) and cefotaxime (500 mg L -1 ). The evaluations were done after 5-6 weeks of incubation, determining the number of explants with shoots, the number of gus + shoots, and calculating the genetic transformation efficiency, defined by the relation between the number of gus + shoots and the number of inoculated explants. The highest genetic transformation efficiency was observed in 'Carrizo' citrange. An increase of genetic transformation efficiency, mainly for the 'Hamlin' sweet orange occurred when the segments were incubated under temperatures below 27 o C. The supplementation of the co-cultivation culture medium with acetosyringone depends on pH value of itself. The use of explant sectioned did not favor transformation, probably due to the excessive bacterial growth on explant surface.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agrícolas no cenário econômico e social brasileiro. Na cultura de cana-de-açúcar o estresse hídrico é o principal fator limitante para o aumento de produtividade, sendo responsável por alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares nas plantas, que podem deflagrar perturbações metabólicas que ativam a morte celular programada (MCP). Sabendo-se que o gene BI-1 apresenta o potencial de reduzir os efeitos da MCP desencadeado por estresses bióticos e abióticos em plantas, este trabalho teve como objetivo analisar plantas transgênicas de cana-de-açúcar que expressam o gene BI-1 de Arabidopsis thaliana (AtBI-1) em condições de estresse hídrico. Também, plantas transgênicas e controle foram inoculadas com o fungo Puccinia melanocephala demonstrando que o processo de transformação genética com o gene AtBI-1 alterou as características pré existentes de resistência a ferrugem marrom nas plantas transgênicas. Os estudos de tolerância ao défict hídrico foram realizados em dois experimentos, o experimento 1 com plantas transgênicas e controles de 90 dias e o experimento 2 com plantas de 60 dias. Plantas do experimento 1 foram analisadas quanto características morfológicas como número de estômatos e tricomas, altura e circunferência do colmo e após ficarem 24 dias sem água foram analisadas quanto a taxa fotossintética, comportamento estomático e conteúdo relativo de água nas folhas, enquanto no experimento 2 as plantas foram analisadas quanto aos teores de prolina, atividades das enzimas guaiacol peroxidase (GPOX), ascorbato peroxidase (APX) e catalase (CAT) após as plantas ficarem 17 dias sob déficit hídrico. Estas enzimas estão envolvidas em processos de desativação de elementos ativos de oxigênio. Os resultados demonstraram que as plantas transgênicas expressando o gene AtBI-1 possuem fenótipo de menor altura, e maior taxa fotossintética, maior comportamento estomático e maior conteúdo relativo de água nas folhas, e assim apresentam maior tolerância ao déficit hídrico que plantas controle. Contudo, houve baixo acúmulo de prolina, baixa atividade da GPOX, APX e CAT nas plantas transgênicas durante o estresse hídrico comparada com as plantas controle do mesmo tratamento. Porém foi observado alta atividade constitutiva da catalase nas plantas transgênicas. A atividade da catalase nestas plantas transgênicas sugere a possibilidade da interação entre AtBI-1 e calmudolinas. Futuros estudos podem contribuir para elucidar se a proteína BI-1 é essencial para a ativação das catalases por calmudolinas. / Sugarcane is one of the main agricultural crops in the Brazilian social and economic scenario. Water stress in the culture of sugarcane is the main limiting factor for increasing productivity accounting for physiological, biochemical and molecular plants that can trigger metabolic disturbances activating programmed cell death (MCP). Knowing that the BI-1 gene has the potential to reduce the effects of MCP triggered by biotic and abiotic stresses in plants, this study aimed to analyze transgenic sugarcane that express the BI-1 gene of Arabidopsis thaliana (AtBI-1) under water stress. Also, transgenic and control plants were inoculated with Puccinia melanocephala fungus demonstrating that the genetic transformation process with the AtBI-1 gene altered the pre-existing characteristics of brown rust resistance in transgenic plants. Studies of tolerance to water deficit were performed in two experiments, the experiment 1 was prepared with transgenic and control plants with 90 days and the experiment 2 used plants with 60 days. Plants from experiment 1 were analyzed as for morphological characteristics such as number of stomata and trichomes, height and diameter of stem after plants being under water for 24 days as were analyzed photosynthetic rate, stomatal behavior, relative water content in leaves while in the experiment 2, plants were analyzed for the levels of proline, enzyme activities of guaiacol peroxidase (GPOX), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) under water deficit for 17 days. These enzymes are involved in deactivation of active elements oxygen. The results demonstrated that the transgenic plants expressing the AtBI-1 gene presented the phenotype of lower height, higher index of leaf area, higher photosynthetic rate, higher stomatal behavior and higher relative water content in leaves than control plants increasing tolerance to drought stress. However, there were low levels of proline, low activity of GPOX activity, APX and CAT in transgenic plants during drought stress compared to control plants of the same treatment, but the observed high constitutive activity of catalase in transgenic plants. Catalase activity in these transgenic plants suggests the possibility of interaction between AtBI-1 and calmudolinas. Future studies may contribute to understand whether the BI-1protein is essential for the activation of catalase by calmudolinas.

Huanglongbing (HLB), considerada uma das mais graves doenças dos citros, está associada a Candidatus Liberibacter spp., bactérias endógenas restritas ao floema e de difícil cultivo em meio de cultura. Diferentemente de outras doenças que afetam plantas cítricas, ainda não foram encontradas dentro do gênero Citrus espécies resistentes ao HLB. Genes de interesse agronômico têm sido empregados na transformação genética de citros visando a resistência a doenças. Dentre estes, destacam-se os que conferem resistência a bactérias incluindo attA, que codificam os peptídeos antibacterianos atacinas, e hrpN, que ativam a produção de proteínas harpinas, relacionadas ao sistema de defesa. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de plantas de laranja doce contendo o gene da atacina A (attA) ou o gene da harpina (hrpN) à Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) utilizando duas formas de inoculação: borbulhões infectados e o inseto vetor da bactéria, Diaphorina citri. Para as plantas contendo o gene hrpN, apenas o segundo método foi utilizado. Os principais sintomas do HLB foram observados aos quatro e oito meses após a inoculação por borbulhões. A infecção das plantas foi confirmada com a detecção de CLas por PCR (quatro e oito meses) e Rt-qPCR (oito meses). Em plantas inoculadas por D. citri, os sintomas foram observados oito e doze meses após a inoculação, assim como a detecção da bactéria por PCR. Após 15, 17 e 18 meses, foi realizada uma nova avaliação por Rt-PCR a partir de spots (imprints em membrana) de folhas. Rt-PCR foi empregado também em spots dos psilídeos utilizados na inoculação. Não foi possível avaliar a resistência ao HLB em plantas contendo o gene attA ou hrpN a partir da inoculação por D. citri. Os resultados de detecção da bactéria nas plantas e nos psilídeos utilizados para inoculação indicam que, possivelmente, não ocorreu a inoculação devido ao baixo percentual de psilídeos que continham CLas utilizados. Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA inoculadas por borbulhões infectivos, oito eventos (cinco de laranja Pera, dois de laranja Hamlin e um de laranja Valência) apresentaram menores títulos bacterianos e algumas também demonstraram redução dos sintomas do HLB quando comparadas com plantas não transgênicas, oito meses após a inoculação, indicando uma possível ação do peptídeo atacina A contra o agente causal do HLB. / Haunglongbing (HLB), considered one of the most serious diseases of citrus, is associated to Candidatus Liberibacter spp., endogenous and phloem-inhabiting bacteria not easily grown in culture medium No species within the genus Citrus is known to resist this bacterial infection. The use of genes of agronomic interest for genetic transformation aiming disease resistance in citrus has been reported. Among these genes, attA that codes for the antibacterial peptides attacin, and hrpN, that codes for proteins harpin that activate the plant defense system may have potential in searching for HLB resistance. The objective of this study was to evaluate the resistance of sweet orange containing attA or hrpN to Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) inoculated through infected budstick grafting or the insect vector, Diaphorina citri. For the plants containing hrpN, only the second method was used. The most obvious HLB symptoms were observed four and eight months after inoculation by infected budstick when CLas also was detected by PCR (four months) and RT-qPCR (eight months). For those inoculated with D. citri, symptoms were observed and bacteria detected eight and twelve months after inoculation. Fifteen, 17 and 18 months after inoculation, a new attempt was made for CLas detection, now through Rt-PCR from leaf and psyllids imprinting spots on membrane. It was not possible to evaluate the HLB resistance in plants containing attA or hrpN gene from D. citri inoculation. The results of CLas detection in plants and psyllids indicate that possibly there was no inoculation due the low rate of psyllids contained CLas used. Among the plants containing attA, five, two and one event of, respectively, Pera, Hamlin, and Valencia sweet orange had lower bacterial titers than those non transgenic plants and some also showed milder HLB symptoms, eight months after inoculation, suggesting a possible effect of attacin A against the causal agent of HLB.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gabriel_klafke.pdf: 1619582 bytes, checksum: dcdfb7127ef88b680dc43b41887f2c86 (MD5) Previous issue date: 2010-03-18 / During the past decades, the development of genetically modified plants became a consolidated reality. Taking advantage of the genetic engineering process, it is possible to obtain modified plants to use as bioreactors in the production of tissue or organs expressing antigens which can be easily used as vaccines. The plant-based expression systems as tomato and lettuce, which attend as models for that process, present innumerous advantages such as conservation of eukaryotic machinery, which promote pos-translational modifications, possibility of large-scale production and development of safer and economically more attractive vaccines. Taking use of that strategy, the Swine mycoplasm hyopneumoniae (SMP) disease can be one important and possible target to either be eradicated or controlled. The SMP, caused by fastidious bacterium Mycoplasma hyopneumoniae, is one of the most important respiratory disease in swine breeding, due to its very high prevalence coupled with associated losses all over the whorld, and has in the recombinant DNA technology a viable alternative in the development of more effective and safe vaccines The objective of my work was to genetically manipulate tobacco plants in order to use them as bioreactor in the production of an antigen against PMS. Tobacco leaves and internodes were cultured in different concentrations of BAP and AIA hormones. The best regeneration results for both explants were seen with 1,5mg.L-1 BAP and 0,1mg.L-1 AIA. The selection test with the kanamycin antibiotic appeared to be highly effective, showing a total inhibition of regeneration with 30 mg.L-1 and 100 mg.L-1 for leaves and internodes respectively. The recombinant colonies of A. tumefaciens, containing ltb-r, were co-cultivated with the internodes and leaves from plants germinated in vitro. The next step, the explants were transferred to the selection medium in order to induce the selection of the putatively transformed cells. The genomic DNA from regenerated and putatively transformed plants were extracted and amplified by PCR, where it was detected the presence of a band referent to ltb r1. The analyses of the integration and the transcription of ltb-r1 were carried out by Southern blot and RT-PCR, respectively. In both techniques, it was possible to confirm the presence of one band which corresponds to the expected size of ltb-r1, supporting the integration and expression of the gene. However, with the tests used here, it was not possible to detect with accuracy the recombinant protein / Nas últimas décadas, o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma realidade consolidada. Nesse sentido, utilizando-se da engenharia genética, é possível obter plantas servindo como biorreatores na produção de tecidos ou orgãos expressando antígenos que podem ser facilmente utilizados como vacina. Os sistemas de expressão em plantas como tomate, alface, tabaco que servem como modelos desse processo, apresentam várias vantagens, entre elas, a conservação da maquinaria eucariótica que promove as modificações póstraducionais das proteínas e ainda a possibilidade de produção em larga escala. Dentro desta estratégia de produção de proteínas, pode-se citar a pneumonia micoplásmica suína (PMS), causada pelo agente Mycoplasma hyopneumoniae, uma das principais doenças de suínos que provoca elevadas perdas econômicas em todo mundo, e tem, na tecnologia do DNA recombinante, uma alternativa de desenvolvimento de vacinas mais efetivas. O objetivo do trabalho foi transformar plantas de tabaco para sua utilização como biorreator na produção de um antígeno vacinal contra a PMS. Folhas e entrenós foram cultivados em diferentes concentrações de BAP e AIA. As melhores taxas de regeneração foram encontradas utilizando 1,5 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA para segmentos de folhas e entrenós. O teste de seleção utilizando canamicina mostrou-se altamente eficiente, obtendo-se a supressão da regeneração com 30 mg.L-1 e 100 mg.L-1 para segmentos de folhas e entrenós, respectivamente. Colônias recombinantes de A. tumefaciens contendo ltb-r1 foram co-cultivadas com entrenós e segmentos foliares de plantas germinadas in vitro. Após esta etapa, os explantes foram transferidos para meios de seleção, visando selecionar células possivelmente transformadas. O DNA genômico das plantas regeneradas e putativamente transformadas foi extraído e amplificado por PCR, na qual foi possível visualizar uma banda referente ao ltb-r1. A detecção da integração e transcrição do gene foi realizada por Southern blot e RTPCR, respectivamente. Em ambas as técnicas, foi possível verificar a presença de uma banda do tamanho esperado para ltb-r1, demonstrando assim, a integração e expressão do gene. Entretanto, não foi possível detectar com precisão, através dos testes utilizados, a proteína recombinante.