Made available in DSpace on 2014-04-08T02:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000456553-Texto+Completo-0.pdf: 3406463 bytes, checksum: 401e17a9aecc3c36095588e483dd1282 (MD5) Previous issue date: 2014 / The causative agent of tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis, infects one-third of the world population. The World Health Organization estimates that 8. 6 million new TB cases occurred in 2012, resulting in 1. 3 million deaths worldwide. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents and to identify pathogenic determinants associated with M. tuberculosis virulence aiming the development of attenuated mutant strains as new vaccine candidates against TB. Enzymes involved in purine and pyrimidine biosynthesis have important roles in cellular metabolism, as they provide nucleotides that are essential components of a number of essential biomolecules. Cytidine deaminase (CDA) catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine to uridine, and belongs to the pyrimidine salvage pathway. The CDA from M. tuberculosis (MtCDA) is a target for the development of attenuated strains of M. tuberculosis because it may be involved in mechanisms of pathogenicity such as latency. This work presents the crystal structures of MtCDA in complex with uridine (2. 4 Å resolution) and deoxyuridine (1. 9 Å resolution).Molecular dynamics (MD) simulation was performed to analyze the physically relevant motions involved in the protein–ligand recognition process, showing that structural flexibility of some residues are important to product binding. In addition, MD simulations allowed the analysis of the stability of tetrameric MtCDA structure. The role of the conserved glutamate-47 (E47) residue was evaluated by construction of five mutant proteins (E47A, E47D, E47L, E47H, and E47Q). Mutants E47A and E47H were expressed in insoluble fraction, whereas E47D, E47L and E47Q were soluble and purified by HPLC. The E47D, E47L and E47Q mutants contained 1 mol of Zn2+ per mol of protein subunit. These mutations had no effect on oligomerization state of MtCDA. Steady-state kinetic results showed that KM values for the E47D and E47Q mutants were not significantly altered, whereas there was a decrease in kcat values of 37-fold for E47D and 19-fold for E47Q mutant. No activity could be detected for E47L mutant. The crystal structure of the E47D mutant was solved by X-rays diffraction, using synchrotron light. An essential role was proposed for the g-carboxyl group of E47, and its involvement in the catalityc process. On the other hand, an important part of drug and vaccine development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this way the knockout of the cdd gene was performed in order to evaluate the importance of the cdd gene for mycobacteria growth in vitro and in vivo. Our results suggest that cdd gene is not an essential gene for in vitro growth under the employed experimental conditions. Infection in mice with the knockout strain of cdd gene has shown a significant reduction in the CFU’s in lungs and spleen of the infected animals. Futher experiments are under way to confirm such findings. Finally, results from enzymatic characterization, site directed mutagenesis and gene replacement may be the starting point for a better understanding about the role of cytidine deaminase in M. tuberculosis metabolism and open up the possibility for a rational design of attenuated strain, that may be useful for future development of a new vaccine candidate against human TB. / O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um terço da população mundial. A Organização Mundial da Saúde estima que 8,6 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milhões de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade contínua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virulência associados com a patogênese de M. tuberculosis, visando a obtenção de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na biosíntese de purina e pirimidina têm papéis importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucleótidos, os quais são componentes essenciais de um grande número de biomoléculas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desaminação hidrolítica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas.A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua não essencialidade pode ser um alvo interesante para a obtenção de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotróficas contra a tuberculose, já que pode estar envolvido nos mecanismos de invasão e latência. No presente trabalho são apresentadas as estruturas cristalográficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 Å de resolução) e deoxiuridina (1,9 Å de resolução). Simulação da Dinâmica Molecular (MD) foi realizada com o propósito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento proteína-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regiões da proteína são importantes para a ligação do produto. Além disso, simulações MD permitiram a análise da estabilidade da estrutura tetramérica da MtCDA. O papel do resíduo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a construção de cinco proteínas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fração insolúvel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fração solúvel e purificadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC).Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de proteína. Estas mutações não tiveram efeito sobre o estado de oligomerização da MtCDA. Resultados cinéticos em estado estacionário mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q não foram alterados significativamente, enquanto houve uma redução nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. Não foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalográfica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catalítico para o grupo g-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um próton na catálise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos fármacos e vacinas, é a identificação de produtos de genes que são fundamentais para o crescimento e a sobrevivência bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a importância deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condições de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd não é um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condições experimentais utilizadas. Experimentos de infecção em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redução nas UFC’s determinadas no pulmão e baço dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infecção em camundongos estão sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracterização enzimática e substituição gênica são o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleotídeos em M. tuberculosis, além de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, útil para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana.

Made available in DSpace on 2014-07-17T02:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459170-Texto+Completo-0.pdf: 2176701 bytes, checksum: a35f9eb08768c0d90b70f0dca32cbe46 (MD5) Previous issue date: 2014 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1. 4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A proteína micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis é uma proteína pequena e de caráter básico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma não es-pecífica e de ancorar o nucleóide à membrana plasmática promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predição de desordem intrínseca in silico prévia, nós usamos um conjunto de técnicas complementares para caracterizar esta proteína, tais como determina-ção da estabilidade ao calor e a desnaturantes químicos, gel filtração, proteólise limitada e mobilidade eletroforética. Nossos resultados sugerem que a MDP2 é estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma proteína intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu à desnaturação induzida por temperatura de fervura e pela ação química do ácido tricloroacético (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sensível à proteólise realizada pela protei-nase K, em comparação às proteínas globulares.Nós também realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quaternária da proteína, como a gel filtração e o crosslinking por glutaraldeído. Estes dois experimentos mostraram que a proteína tem uma tendência a auto agregação, formando grandes aglomerados em solução. Também foi realizada a muta-gênese sítio-dirigida por troca alélica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a proteína MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns não é essencial para a sobrevivência da micobactéria. Combinado com resultados prévios de outros trabalhos relacionados à MDP2, nós especulamos que esta proteína usa sua região N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequências repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma não específica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma proteína promíscua dentro da célula, ligando-se a diferentes regiões do nucleóide pela for-mação de grandes aglomerados de proteína, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. Nós esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda é uma grande ameaça global.

Made available in DSpace on 2014-08-30T02:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460859-Texto+Completo-0.pdf: 2353123 bytes, checksum: dd594f361c31a6e6ca5c19cd19a8c488 (MD5) Previous issue date: 2014 / The Mycobacterium tuberculosis NADH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase (MtInhA) catalyzes hydride transfer to long-chain enoyl thioester substrates. MtInhA is a member of the mycobacterial type II dissociated fatty acid biosynthesis system, and is the bona fide target for isoniazid, the most prescribed drug for tuberculosis treatment. Here, a series of piperazine derivatives was synthesized and screened as MtInhA inhibitors, which resulted in the identification of compounds with IC50 values in the submicromolar range. A structure-activity relationship (SAR) evaluation indicated the importance of the chemical environment surrounding the carbonyl group for inhibition. In addition, the structure of one selected compound was supported by crystallographic studies, and experimental geometrical values were compared with semi-empirical quantum chemical calculations. Furthermore, the mode of inhibition and inhibitory dissociation constants were determined for the nine most active compounds. These findings suggest that these compounds interact with MtInhA at the enoyl thioester (2-trans-dodecenoyl-CoA) substrate binding site. Finally, two 9H-fluoren-9-yl-piperazine-containing compounds exhibited moderate antimycobacterial activity against the M. tuberculosis H37Rv strain. / A enzima 2-trans-enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis (MtInhA) catalisa a etapa enzimática final no ciclo de alongamento da via de biossíntese de ácidos graxos, convertendo 2-trans-enoil-ACP à acil-ACP em um mecanismo dependente de NADH. Essa enzima vem sendo descrita como alvo validado para a descoberta de fármacos. Nesse trabalho uma série de piperazinas foi sintetizada e avaliada quanto ao potencial inibitório da atividade enzimática da MtInhA, resultando em compostos com valores de IC50 na faixa de inibição de nanomolar. Avaliações de relação estrutura-atividade (SAR) indicam a importância do ambiente químico adjacente à carbonila para a inibição. Além disso, a estrutura de um composto foi confirmada por estudos cristalográficos e os valores geométricos experimentais foram comparados com valores obtidos através de cálculos semi-empíricos de obitais moleculares. Experimentos para determinação do modo de inibição e obtenção dos valores das constantes de dissociação foram realizados para os nove compostos mais ativos. Os resultados sugerem que esses compostos interagem com MtInhA no sítio de ligação dos substratos acil-graxos. Finalmente, dois compostos, contendo na sua estrutura 9H-fluoren-9-il-piperazina exibiram moderada atividade antimicrobiana contra a cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Made available in DSpace on 2014-11-15T01:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462458-Texto+Completo-0.pdf: 2477430 bytes, checksum: d919c3c5fbc07113fb3a1d22bb1b9e59 (MD5) Previous issue date: 2014 / Tuberculosis (TB), a disease mainly caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (MTB), is considered a global public health problem. Infections caused by mycobacteria are generally difficult to treat because of its natural resistance to most antibiotics. This resistance is largely attributed to the formation of the cell wall. The InhA is part of the mycobacterial FAS II system which regulates the elongation of the fatty acid chain, which will compose the cell wall of the bacillus (mycolic acids). As the FAS II system is not present in mammals, this enzyme has been described as an important macromolecular target aiming the development of drugs with selective toxicity. The development of analytical techniques for studying proteins in solution by mass spectrometry combined with cross-linking has permitted access information about the primary, tertiary, and quaternary structure of the proteins. In this work, the technique of cross-linking combined with mass spectrometry was implemented for the characterization of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase (InhA) which catalyzes the final essential enzymatic step in fatty acid elongation in the FAS II pathway, converting 2-trans-enoyl-ACP to acyl-ACP via an NADH-dependent reaction. / A tuberculose (TB), doença causada principalmente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), é considerada um problema global de saúde pública. As infecções causadas pela micobactéria são, em geral, difíceis de tratar devido principalmente ao surgimento de cepas resistentes á maioria dos fármacos disponíveis e à co-infecção com a síndrome da imunodeficiênciaadquirida (SIDA). Nesse contexto, a caracterização de alvos moleculares para a proposição de novas estruturas químicas candidatas a fármacos anti-TB mostra-se de importância sumária. A enzima enoil-ACP-redutase (InhA) de MTB faz parte do sistema FAS II damicobactéria a qual regula o alongamento da cadeia dos ácidos graxos fornecendo os precursores que irão compor a parede celular do bacilo (ácidos micólicos). Como o sistema FAS II não esta presente em mamíferos esse fato torna essa enzima um importante alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos com toxicidade seletiva. O desenvolvimento de técnicas analíticas para estudar proteínas em solução utilizando a espectrometria de massas combinada com agentes de ligação cruzada vem possibilitandoa caracterização estrutural de proteínas conduzindo a informações sobre suas estruturas primárias, terciárias e quaternárias. No presente trabalho foi implementado a técnica de cross-linking combinada a espectrometria de massas para a caracterização em solução da enzima InhA de MTB.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467140-Texto+Completo-0.pdf: 2666780 bytes, checksum: 69d9316002f8596f9f09b6c05ceb6081 (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) is the leading cause of bacterial infectious disease mortality. The etiological agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is responsible for 1. 5 million deaths and 9 million people infected in 2013. The World Health Organization (WHO) estimates that one-third of the world´s population is infected with latent form of Mtb. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents. The shikimate pathway produces an important precursor of aromatic compounds in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites, chorismate. The pathway comprises seven enzymes, which convert erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate into chorismate, the precursor for the synthesis of aromatic amino acids, folic acid, ubiquinone, and many other aromatic compounds. This pathway is essential for growth of Mtb. The aroD gene, that codes for 3-dehydroquinate dehydratase (DHQase), catalyzes the reversible reaction of 3-dehydroquinate into 3-dehydroshikimate and the aroE gene, that codes for the NADP(H) dependent shikimate-5-dehydrogenase (SD), catalyzes the reduction of 3-dehydroshikimate into shikimate. The aim of the present study was to identify new dug-like molecules as inhibitors for MtbDHQase and MtbSD using structure-based modeling and virtual screening. The availability of the crystal structure bound with an inhibitor of MtbDHQase was explored using pharmacophore models based on interaction energy and docking to yield diverse leads. For MtbSD, due the absence of crystal structure and reported inhibitors, the tridimensional structure was achieved by molecular modelling. Structure-based pharmacophore and virtual screening of the in house database containing 3000 unique molecules retrieved twelve hit compounds with good docking score and interaction pattern for MtbDHQase. For MtbSD, the commercially available database Asinex, with 500,000 molecules, were used and seventeen compounds were selected based in its docking score, interaction pattern with amino acids in the active site, number of hydrogen bonds and GOLD score. MtbDHQase inhibitors were tested and, after inhibition assay, series of chemical modifications were made in the lead compound. The top two derivate presented IC50 values of 17. 1 and 31. 5 μM as well as MIC values of 25 and 6. 25 μg/mL and cytotoxicity below 15% at 100 μM respectively. The MtbSD compounds selected as possible inhibitors will be tested for inhibition, MIC value and cytotoxicity. / A Tuberculose (TB) é a principal causa de mortalidade devido a infecções bacterianas. Seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi responsável por 1,5 milhões de mortes e por 9 milhões de pessoas infectadas em 2013. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que um terço da população mundial está infectada com a forma latente do Mtb. Assim, há uma contínua necessidade de buscar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-TB. A via do chiquimato produz um importante precursor de compostos aromáticos em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo Apicomplexa, o corismato. A via é composta por sete enzimas, as quais convertem eritrose-4-fosfato e fosfenolpiruvato em corismato, o precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos, ácido fólico, ubiquinonas e muitos outros compostos aromáticos. Esta via é essencial para o crescimento do Mtb.O gene aroD, que codifica a enzima 3-desidroquinato desidratase (DHQase), catalisa a reação reversível do 3-desidroquinato em 3-desidrochiquimato e o gene aroE, que codifica a enzima dependente de NADP(H) chiquimato-5-desidrogenase (SD), catalisa a redução do 3-desidrochiquimato em chiquimato. O objetivo do presente estudo foi identificar novas moléculas como inibidores para a MtbDHQase e MtbSD utilizando modelagem baseada em estrutura e triagem virtual. A disponibilidade da estrutura cristalográfica ligada a um inibidor da MtbDHQase foi explorada utilizando modelos farmacóforos baseados na energia de interação e docagem para gerar diversos protótipos. Para a MtbSD, devido à ausência de estrutura cristalográfica e de inibidores, foi realizado através de modelagem molecular, um modelo da estrutura. A abordagem do farmacofórico baseado na estrutura, juntamente com a triagem virtual da base de dados in house contendo 3000 estruturas inéditas geraram compostos escolhidos com bom valor de docagem e padrão de interação com aminoácidos do sítio ativo. Para a MtbSD, foi utilizada a base de dados Asinex, que contém 500000 moléculas. Dezessete compostos foram encontrados baseados nos seus valores de docagem, no padrão de interação com os aminoácidos do sítio ativo, no número de interações de hidrogênio e no valor de GOLD. Os inibidores da MtbDHQase foram testados e, após os ensaios de inibição, foram realizadas diversas derivações químicas no composto protótipo. Os dois melhores compostos derivados apresentaram um valor de IC50 de 17,1 e 31,5 μM, um valor de MIC de 25 e 6,25 μg/mL e citotoxicidade abaixo de 15% a 100μM, respectivamente. Os compostos selecionados como possíveis inibidores para a MtbSD serão futuramente testados quanto a sua inibição, valor de CIM e citotoxicidade.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400977-Texto+Completo-0.pdf: 4539357 bytes, checksum: a454d83262e33e9f70ab585e6cbbdd44 (MD5) Previous issue date: 2008 / The reemergence of tuberculosis is a current public health problem. The World Health Organization (WHO) reported in 2006 that 2 billion people, or one-third of the world’s total population, are infected with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (MTB), and in 2007 reported that 1. 6 million people died from TB in 2005. Multidrug-resistant TB (MDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB) are forms of TB that does not respond to the standard drug treatment. Isoniazid (INH, isonicotinic acid hydrazide) is one of oldest synthetic antitubercular drugs. The mechanism of action of INH is complex, as mutations in at least five different genes (katG, inhA, ahpC, kasA, and ndh) have been found to correlate with INH resistance. Pentacyano(isoniazid)ferrate II (PIF) is a rational drug design effort to find alternative drugs capable of inhibiting InhA. It was found that PIF inhibit both wild type and isoniazid-resistant I21V mutants of InhA and this inactivation does not require activation by KatG. In this work we report the results of two molecular dynamics simulations of PIF-InhA interaction considering all atoms of this complex in aqueous solution. The results demonstrated that PIF strongly interacts with InhA and these interactions cause macromolecular instabilities due to substrate binding site perturbation. These instabilities are reflected in the long time necessary for trajectory convergence. Besides this, we observed that the residues Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 and Thr196 of InhA are responsible for the PIF-InhA association. So, we conclude that PIF competes directly for the NADH binding site and indirectly with the substrate binding site. / A re-emergência da tuberculose é um problema de saúde pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em 2006, cerca de 2 bilhões de pessoas, ou um terço da população mundial, foram infectadas com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), e em 2007 relata que 1,6 milhões de pessoas morreram de tuberculose (TB) no ano de 2005. O surgimento das formas de TB resistente a múltiplas drogas (MDR-TB) e extensivamente resistente a drogas (XDR-TB), as quais não respondem ao tratamento convencional, colaboram para este crescimento. A Isoniazida (INH, hidrazida do ácido isonicotínico) é uma das drogas sintéticas mais antigas, e seu mecanismo de ação é complexo. Mutações em pelo menos cinco genes diferentes (katG, inhA, ahpC, kasA, e ndh) foram correlacionadas com a resistência a INH. O complexo inorgânico Isoniazida-pentacianoferrato (IPF) é o resultado do desenho racional de drogas na tentativa de achar uma alternativa capaz de inibir a InhA. O IPF é capaz de inibir os tipos selvagem e o mutante I21V da InhA, resistente à INH, e esta inativação não requer ativação por KatG. Neste trabalho, realizamos duas simulações por dinâmica molecular do complexo IPF-InhA, utilizando todos os átomos em solução aquosa, com o objetivo de investigar os eventos moleculares relacionados ao modo de interação droga-alvo e suas afinidades. Observamos que o IPF interage fortemente com a InhA e estas interações causam instabilidades na macromolécula devido a perturbação no sítio de ligação do substrato. Estas instabilidades se refletem no longo tempo necessário para a convergência da trajetória. Observamos também que os resíduos Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 e Thr196 são os responsáveis por intermediar a associação IPF-InhA. Concluímos então que o IPF compete diretamente com o NADH pelo seu sítio de ligação e indiretamente com o substrato através da desestabilização do seu sítio de ligação.

Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-01-14T13:24:37Z No. of bitstreams: 1 2013_PatriciaBartholomayOliveira.pdf: 3470808 bytes, checksum: dbcbef9a2c49e838146c31b7c2451bb9 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2014-01-23T14:36:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PatriciaBartholomayOliveira.pdf: 3470808 bytes, checksum: dbcbef9a2c49e838146c31b7c2451bb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-23T14:36:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PatriciaBartholomayOliveira.pdf: 3470808 bytes, checksum: dbcbef9a2c49e838146c31b7c2451bb9 (MD5) / Em 2011, o Brasil notificou 73.778 casos novos de tuberculose (TB), correspondendo a taxa de incidência de 38,4/100.000 habitantes. Mesmo com todas as ações desenvolvidas os percentuais de cura para os casos novos de TB mantiveram-se entre 72% e 74% e os percentuais de abandono em torno de 9%. Em doenças com tratamento longo, como a TB, a baixa adesão é um problema frequente. A TB é curável em praticamente 100% dos casos que são sensíveis aos medicamentos recomendados para o tratamento. No Brasil, o tratamento é gratuito e garantido a toda a população pelo Sistema Único de Saúde (SUS). O objetivo desse trabalho foi analisar os fatores relacionados ao abandono de tratamento de TB. Dois estudos foram realizados: o primeiro, estudo seccional de abrangência nacional, para analisar a qualidade das informações sobre TB disponibilizadas pelo Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan) e o segundo, coorte histórica com análise multinível, para analisar os fatores relacionados ao abandono de tratamento a partir de variáveis individuais e do contexto dos municípios considerados prioritários para o controle da TB no Brasil. No primeiro estudo foi realizada a vinculação de registros utilizando o linkage entre os registros do Sinan do Brasil, 2008 e 2009, com o objetivo de excluir as notificações não removidas pela rotina do Sinan de vinculação de registros realizada por estados e municípios. As bases de dados utilizadas foram construídas de acordo com o desfecho dos casos. O linkage entre Sinan e Sistema de Informações de Mortalidade (SIM) também foi realizado para qualificar as informações do Sinan. Foi utilizada a base de dados resultado da vinculação de registros e os registros do SIM que mencionaram TB como causa básica ou associada, entre 2008 e 2010, no Brasil. A vinculação de registros diminuiu o percentual de casos novos com encerramento por transferência, com variação de 34,8% em 2008 e 35,5% em 2009. Após o linkage entre Sinan e SIM, o percentual de óbito por TB entre os casos novos variou 16,4% em 2008 e 14,1% em 2009. Os resultados descrevem uma situação de alerta no que se refere à qualidade dos dados de desfecho de tratamento de TB. A partir da base de dados qualificada foi realizado o segundo estudo. As variáveis do nível 1 (individuais) analisadas foram as disponíveis no Sinan. Para compor os dados do nível 2 (contexto do município de residência dos casos) foram coletadas as variáveis disponibilizadas pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) e pelo Departamento de Informática do SUS (Datasus). A base de dados do Sinan também foi utilizada para construir variáveis contextuais Em relação ao indivíduo foram considerados fatores de risco para o abandono: sexo masculino, idade entre 15 a 49 anos, raça/cor negra, forma clínica pulmonar e presença de alcoolismo. Diabetes e TDO foram considerados fatores protetores. Controlando por variáveis individuais, foram associadas ao abandono piores condições dos Programas de Controle da TB e a densidade 2 2demográfica entre 2.501hab/km e 5.000hab/km. Características dos programas de TB influenciam no desfecho dos casos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In 2011, Brazil reported 73,778 new tuberculosis (TB) cases, corresponding an incidence rate of 38.4/100,000 inhabitants. Even with all actions developed, the cure rates for new TB cases remained between 72% and 74% and the default rate around 9%. In diseases of long treatment such as TB, the poor adherence is often a problem. TB is a curable disease in almost 100% of the sensitive to drugs cases. In Brazil, the treatment is for free and guaranteed to all people by the Unified Health System (SUS). The aim of this study is to analyze the factors related with TB treatment default. Two studies were conducted: the first one was a nationwide sectional to analyze the quality of information provided by the Reportable Disease Information System (Sinan) and the second one was a historical cohort with multi-level analysis to analyze the factors associated with treatment default using individual variables and context variables in priority municipalities for TB control in Brazil. In the first study, a record linkage was conducted using TB cases notified in Sinan Brazil, between 2008 and 2009 aiming to exclude notifications not removed by Sinan routine carried out by states and municipalities. The databases used were constructed in accordance with the cases outcome. The linkage between Sinan and the Mortality Information System (SIM) was also performed to qualify the Sinan information. The database result of the first record linkage and SIM data that mentioned TB as basic or associated cause between 2008 and 2010 in Brazil was used. Record linkage decreased the percentage of new cases with transferred outcome, ranging from 34.8% in 2008 and 35.5% in 2009. After the linkage between Sinan and SIM, the percentage of TB deaths among new cases ranged 16.4% in 2008 and 14.1% in 2009. The results describe an alert situation in relation to data quality TB outcome in Sinan. Using the qualified database it was possible to conduct the second study. The level 1 variables (individual) used were available in Sinan. To compose level 2 data (municipality residence context) variables provided by IBGE and Datasus were collected. Regarding the individual analysis, was considered risk factors for default: male gender, age from 15 to 49 years, black race, pulmonary clinical form and presence of alcoholism. Diabetes and direct observed treatment were considered protective factors. When controlling for individual variables, default was associated with negative situations of TB control programmes and 2 2population density per km between 2501.00 and 5000.00 inhabitants/km. TB programs characteristics influence the cases outcome.

O objetivo desta pesquisa foi descrever e analisar as ações de controle dos comunicantes de doentes de tuberculose em relação à área física, recursos materiais, recursos humanos e à rede laboratorial para a investigação da doença. Foram coletados dados das seguintes variáveis: as relacionadas às características dos casos-índice de tuberculose quanto a sexo, faixa etária e forma clínica; os comunicantes registrados e os examinados em relação a sexo, faixa etária, tipo de parentesco com o caso-índice; tipos de exames realizados e a incidência da doença. A população do estudo constitui-se de 166 comunicantes registrados e examinados na unidade de saúde e 7 profissionais que desenvolvem as ações do Programa de Controle da Tuberculose. Os instrumentos de coleta de dados foram: análise documental, entrevistas semi-estruturadas e registros das observações livres por meio de um diário de campo. Os resultados apontam que à área física não satisfaz as exigências das normas do Ministério da Saúde; são utilizados todos os manuais do Ministério da Saúde para o Programa de Controle da Tuberculose. Dos profissionais que atuam no Programa, 85 % são do sexo feminino e 15%, do masculino; sua faixa etária vai de 32 a 67 anos; o tempo de formatura dos profissionais vai de 10 a 42 anos e o período de exercício nesta atividade varia de 8 meses a 18 anos. Dos 112 casos de tuberculose notificados, 77 (68,8%) eram da forma pulmonar e 35 (31,2%) das formas extra-pulmonares, predominando o sexo masculino com 62 casos (80,5%); 15 casos (9,5%) para o feminino e 33 (29,5%) eram co-infectados TB/HIV. Nos comunicantes de doentes de tuberculose foram identificados 263 registrados pelo serviço, referente aos 112 casos-índice. Dos 263 comunicantes registrados, verificamos que 166 (63,1%) foram avaliados, pois encontramos anotações em seus prontuários; 147 (88,5%) foram avaliados pelo Programa de Controle da Tuberculose no Núcleo Gestão Assistencial 60, sendo que 19 (12%) deles, por serem menores de 12 anos, foram avaliados em outros serviços de saúde da cidade; os outros 97 (36,9%) não foram avaliados ou foram avaliados, e esta informação não foi registrada nos prontuários, sendo 82 (49,4%) do sexo masculino e 84 (50,6%), do feminino; 42 (25,3%) estão entre 0 e 19 anos , 73 (44%) entre 20 e 49 anos e 44 (25,5%) têm 50 anos ou mais. Dos exames diagnósticos nos comunicantes, 95,8% foram realizados através de raio X de tórax, 12% por baciloscopia de escarro, 7,2% mediante teste tuberculínico e 0,6% por meio de cultura; 3 (1,8%) desenvolveram a doença, perfazendo 2,7% do total dos casos diagnosticados. Os resultados também apontam para a necessidade de que o Programa de Controle da Tuberculose seja revisto, valorizando a vigilância e o monitoramento dos comunicantes, desenvolvendo estratégias através de protocolos sistematizados para os profissionais de saúde e que garantam a continuidade no atendimento desse serviço de forma humanizada e integral com ênfase em ações preventivas. / This is aimed to describe and analyze the control actions of the communicants of tuberculous people in relation to the physical area, material and human resources, and to the laboratorial net for the investigation of the disease. Data of the following variables were collected: those related to the characteristics of the tuberculous index cases as for sex, age, and clinical form, registered communicants, and those examined as for sex, age, kind of kinship with the index case, types of exams performed and disease incidence. The study population is constituted by 166 communicants registered and examined in the health unity and 7 professionals who develop the actions of the Tuberculosis Control Program. The data collecting tools were: documental analysis, semi-structured interviews and registers of the free observations by means of a field diary. The results indicate that the physical area does not fulfill the regulations of the Health Ministry; all the Health Ministry handbooks for the Tuberculosis Control Program were used. Of the professionals acting in the program, 85% were female and 15%, male; their age range from 32 to 67; the professionals' time from graduation range from 10 to 42 years, and their working time in this activity, from 8 months to 18 years. Of the 112 cases of tuberculosis notified, 77 (68.8 %) were of the pulmonar kind and 35 (31,2 %), of the extra-pulmonar kinds, the male prevailing in 62 cases (80.5 %) over 15 (19.5%) female; 33 (29.5%) were co-infected with TB/HIV. In the communicants of tuberculous people, 263 were identified and registered by the service, as related to 112 index cases. It was verified that, of the 263 registered communicants, 166 (63.1 %) were evaluated as annotations were found in their files; 147 (88.5%) were evaluated by the Tuberculosis Control Program in the Assistance Administration Nucleus 60, 19 (12%) of which, for being under 12, were evaluated in other city health services; the other 97 (36.9%) were either evaluated or not, and this information was not registered in their files, 82 (49.4%) being male and 84 (50.6%), female; as for age, 42 (25.3%) range from 0 to 19, 73 (44%), from 20 to 49, and 44 (22.5%) are 50 or older. Of the diagnostic exams in the communicants, 95.8% performed through thorax X-ray, 12% through mucus bacilloscopy, 7.2 % through tuberculinic test, and 6 % through culture; 3 (1.8 %) developed the disease, completing 2.7 % of the total diagnosed cases. The results also indicate the necessity of revising the Tuberculosis Control Program, emphasizing the surveillance and monitoring of the communicants, developing strategies through systematized protocols for the health professionals to assure the continuity of this assisting service in an integral and human form with emphasis on preventive actions.