Orientador: Antonio Eduardo Mauro / Banca: Roberto Santana da Silva / Banca: Victor Marcelo Deflon / Banca: Rose Maria Carlos / Banca: Heloisa de Oliveira Beraldo / Resumo: Este trabalho trata da síntese e caracterização de compostos de Pd(II) contendo ligantes piridínicos, e de suas atividades biológicas contra: células tumorais LM3, bacilos da tuberculose (TB) humana e protozoários causadores da doença de Chagas (T. cruzi) e da leishmaniose cutânea (L. amazonensis). Segundo os dados de IV, todas as piridinas para-substituídas se coordenaram via N-piridínico e as propostas moleculares estão condizentes com as análises elementares. Os compostos trans-[PdX2(isn)2], X= Cl (2), N3 (3), NCO (4), SCN (5), Br (6) e I (7), e ISN= isonicotinamida, foram obtidos a partir do trans-[PdCl2(CH3CN)2] (1), mediante reações de substituição de ligantes; 2-5 foram investigados por TG-DTA, sendo que 2, 3 e 5 apresentaram um perfil de degradação térmica gerando como resíduos Pd/PdO, já o 4 gerou Pd. A estabilidade térmica deles foi: 2 > 4 > 5 > 3. Experimentos de RMN 2D em solução indicaram para 6 também a ISN livre e uma espécie contendo Pd-dmso. Nos compostos [Pd2(N3)4(-teda)(isn)2]∙H2O (8), [Pd2(SCN)4(-teda)(isn)2] (9), [Pd2(N3)4(-bipy)(isn)2]∙H2O (10) e [Pd2(SCN)4(-bipy)(isn)2] (11), TEDA= trietilenodiamina e BIPY= 4,4'-bipiridina, derivados de 1, a coordenação dos pseudo-haletos foi terminal (N3 via N e SCN via S). Segundo as curvas TG-DTA para 9 e 11, resultaram como resíduos Pd (9) e Pd/PdO (11), sendo 9 > 11 em termos de estabilidade térmica. Os compostos [Pd(dmba)X(isn)], X= Cl (15), N3 (16), NCO (17), e DMBA= N,N-dimetilbenzilamina, foram obtidos de [Pd(dmba)(-Cl)]2 (12), [Pd(dmba)(-N3)]2·H2O (13) e [Pd(dmba)(-NCO)]2 (14), respectivamente. Dados de RMN em solução apontaram a integridade de 15, mas para 16 e 17 notou-se também a ISN livre e os respectivos precursores diméricos. Os compostos trans-[PdCl2L2], L= 4-cianopiridina, 4CNPY... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work deals with the synthesis and characterization of Pd(II) compounds containing pyridine ligands, and their biological activities against: LM3 tumor cells, bacilli of human tuberculosis (TB) and protozoan causing Chagas' disease (T. cruzi) and cutaneous leishmaniasis (L. amazonensis). According to IR data all para-substituted pyridines are coordinated via N-pyridine and molecular formulae are consistent with the elemental analyses data. The compounds trans-[PdX2(isn)2], X= Cl (2), N3 (3), NCO (4), SCN (5), Br (6), I (7), and ISN= isonicotinamide, were obtained from trans-[PdCl2(CH3CN)2] (1) through ligand replacement reactions. Compounds 2-5 were investigated by TG-DTA, with 2, 3 and 5 showing the same thermal degradation profile, generating Pd/PdO as final residues, while 4 generated Pd as final residue. The thermal stability order of these series was: 2 > 4 > 5 > 3. From 2D NMR experiments in solution for 6 it was also noted ISN free and a species containing DMSO coordinated to Pd(II). For compounds [Pd2(N3)4(-teda)(isn)2]∙H2O (8), [Pd2(SCN)4(-teda)(isn)2] (9), [Pd2(N3)4(-bipy)(isn)2]∙H2O (10) and [Pd2(SCN)4(-bipy)(isn)2] (11), TEDA= triethylenediamine and BIPY= 4,4'-bipyridine, the coordination of pseudohalides was terminal (N3 by N and SCN by the S atom). According to the TG-DTA curves of 9 and 11, Pd (9) and Pd/PdO (11) were obtained as final residues, and 9 > 11 in terms of thermal stability. Compounds [Pd(dmba)X(isn)], X= Cl, (15), N3 (16), NCO (17), and DMBA= N,N-dimethylbenzylamine, were obtained from [Pd(dmba)(-Cl)]2 (12), [Pd(dmba)(-N3)]2∙H2O (13) and [Pd(dmba)(-NCO)]2 (14), respectively. NMR data in solution indicated the integrity of 15, but for 16 and 17 it was also noted ISN free, and their dimeric precursors. The compounds... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paulo Inácio da Costa / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Resumo: A infecção produzida pelo HIV leva à debilidade do sistema imune e confere ao indivíduo infectado maior vulnerabilidade às infecções oportunistas. Neste aspecto a tuberculose e o HIV estão intimamente relacionados, uma vez que a infecção pelo vírus contribui significativamente para o aumento na incidência da tuberculose. Por outro lado, a co-infecção do HIV com outros patógenos é um importante fator exógeno que influencia a gravidade e a taxa de progressão da doença em indivíduos soro-positivos. O sistema imune pode reconhecer padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) através dos receptores toll-like, sendo que esta sinalização resulta na ativação de fatores de transcrição fundamentais para as respostas imune e inflamatória. A indução do HIV como conseqüência da ativação imunológica produzida por ligantes microbianos tem sido implicada como o mecanismo responsável pela elevada expressão viral observada em indivíduos co-infectados. Polimorfismos nos genes tlr, bem como nos vários componentes de seus caminhos de sinalização, têm grande importância na resposta imunológica do hospedeiro frente a vários patógenos. Neste estudo foi avaliado se a do hospedeiro infecção pelo Mycobacterium tuberculosis tem influência na replicação do HIV e na imunidade celular relacionada aos polimorfismos nos genes tlr2 e 4. Foram analisados 37 pacientes de ambos os sexos com média de idade de 41 anos. Os pacientes foram divididos em 2 grupos: grupo A (17 indivíduos portadores de HIV) e grupo B ( 20 indivíduos portadores de HIV co-infectados com M. tuberculosis); o grupo B foi subdividido em pacientes com histórico de infecção pregressa pelo M. tuberculosis (12 indivíduos designados por B') e aqueles que apresentavam manifestações clínicas da tuberculose durante as coletas (8 indivíduos designados por B'')...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The infection caused by the HIV virus lead to debility of the immune system and confers to the infected individual a greater vulnerability to opportunist infections. In this aspect the tuberculosis and the HIV are closely related, once that the infection by the virus significantly contribute for the increase of tuberculosis incidence. The co-infection with others pathogens is an important exogenous factor that influence the severity and the rate of progression of the disease at serum-positive patients. The Immune System can recognize pathogens associated molecular patterns (PAMPs) through the toll-like receptors, this signalization results in the activation of fundamental transcriptional factors to the immune and anti-inflammatory responses. The induction of HIV like a consequence of immunological activation produced by microbial ligands has been implicated as the responsible mechanism of the elevated viral expression observed at co-infected individuals. Polymorphisms at the tlr genes, as well as at various components of its signaling pathways, has a great importance on the immunological response of the host front various pathogens. In this study was evaluated the influence of the Mycobacterium tuberculosis at the replication of HIV and at cellular immunity related to polymorphisms at the genes tlr2 and 4. Thirty seven patients, from both sex and with age ratio of 41 years old, were analyzed. The patients were divided into two groups: group A (17 individuals HIV positive) and group B (20 coinfected HIV - M. tuberculosis individuals); the group B was divided into patients with historic of infection by M. tuberculosis (12 individuals designated by B') and those that was manifesting the symptoms of tuberculosis during the reaps (8 individuals designated by B''). The immunological profile was evaluated by the quantitative determination of phenotypes CD3+/CD4+ and CD3+/CD8+ of lymphocytes ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador : Fernando Rogério Pavan / Coorientador: Patricia Bento da Silva / Banca:Marlus Chorilli / Banca: Amauri Antonio Menegário / Resumo: A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa transmitida pelo ar, curável e afeta principalmente os pulmões. Nos últimos anos, a taxa de mortalidade vem reduzindo, entretanto, cepas resistentes e a co-infecção TB/HIV têm dificultado as tentativas de controle da doença, levando ao aumento da mortalidade. Outro fator preocupante é que um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis (MTB) em estado de latência, o qual serve como reservatório para TB ativa. No esforço de sanar esta falha, é crescente a importância da Química Bioinorgânica como um aliado na pesquisa de novos fármacos anti-TB. O Rutênio (Ru) é um elemento químico que apresenta capacidade de mimetizar o Ferro (Fe) em nosso organismo, apresentando baixa toxicidade e capaz de formar complexos estáveis, este elemento vem sendo estudado desde a década de 80 como possível substituto da Platina (Pt), metal central da estrutura da cisplatina utilizada em tratamentos antineoplásicos. Em estudos anteriores envolvendo os complexos heterolepticos de rutênio: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) e [Ru(pic)(dppe)(phen)] PF6 (SCAR7), foi observada excelente atividade anti-TB, uma moderada toxicidade celular e a falta de biodisponibilidade oral em modelo in vivo desses complexos, desse modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a toxicidade e biodisponibilidade oral desses complexos nanoencapsulados. Estes sistemas nanoestruturados foram desenvolvidos utilizando diferentes proporções de tensoativo (fosfatidilcolina de soja, Emulgin® e oleato de sódio), fase aquosa (tampão fosfato pH 7,4) e oleosa (colesterol), afim de se obter um sistema para incorporação dos compostos de rutênio. O sistema foi caracterizado através das análises de reologia, tamanho de partículas e potencial zeta. A atividade... / Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious airborne disease, curable and mainly affects the lungs. In recent years, the death rate has been decreasing, however, resistant strains and co-infection TB / HIV have hampered the disease control efforts, leading to increased mortality. Another troubling factor is that one third of the world's population is infected with Mycobacterium tuberculosis (MTB) in a state of latency, which serves as a reservoir for active TB. In an effort to remedy this failure, it is increasing the importance of bioinorganic chemistry as an ally in the new anti-TB drug research. The Ruthenium (Ru) is a chemical element that has the capacity to mimic the iron (Fe) in our body, with low toxicity and able to form stable complexes, this element has been studied since the 80's as a possible substitute for platinum (Pt ), the central metal structure of cisplatin used in anticancer treatments. In previous studies involving heteroleptic ruthenium complexes: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) and [Ru(pic)(dppe)(phen)]PF6 (SCAR7), we observed an excellent anti-TB activity, moderate cell toxicity and lack of oral bioavailability in vivo model of these complexes thus the main objective of this study was to evaluate the toxicity and oral bioavailability of those nano-coated complexes. These nanostructured systems have been developed using different ratios of surfactant (soybean phosphatidylcholine, Emulgin® and sodium oleate), aqueous phase (phosphate buffer pH 7.4) and oil (cholesterol) in order to obtain a system for incorporating the compounds of ruthenium. The system was characterized by analyzes rheology, particle size and zeta potential. The anti-TB activity of the compounds was determined by the microdilution assay with Resazurin (REMA) compared to strains of M. tuberculosis H37Rv and clinical isolates... / Mestre

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Coorientador: Ana Carla Pereira / Coorientador: Edward A. Gravis / Banca: Lenice do Rosário Souza / Banca: Ida Maria Foschiani Dias Baptista / Banca: Fátima Regina Vilani Moreno / Banca: Ana Cláudia Pelizon / Resumo: Não disponível / Abstract: It is estimated that one-third of the total world population is latently infected with M. tuberculosis and only 5-10% of the infected individuals will develop active TB disease during their life-time. The reason why some infected individuals develop active disease, while others do not is not yet entirely understood. Given the central role of TLR-2 in the incitement of inflammation, polymorphisms in its gene might be involved in both infectious and inflammatory diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of TLR2 - 16934A/T and GT repeat polymorphisms on the immune response of PTB patients undergoing anti-TB treatment at different time points of anti-tuberculosis treatment: T1 (beginning), T2 (3 months) and T3 (end). For this we genotyped TLR2 -16934 and (GT)n repeats polymorphisms and evaluated the immune response of pulmonary tuberculosis patients during the time of anti-tuberculosis treatment. The present study suggests that TLR2 - 16934A/T and GT repeats polymorphisms can influence differential TLR-2, NF-κB and cytokine levels during anti-TB treatment. We also suggest that PTB patients with TLR2 - 16934 AA genotype may have a worst outcome of the disease, since they have a lower IFN-γ, cytokine essential to initiate the protective immunity to active TB. This association could not be made in our study due to the low number of patients evaluated. Since TLR-2 play a major role in initiating immune response against M. tuberculosis other polymorphisms in TLR2 would be crucial to better understand protective immune responses and may serve as biomarkers of protection or susceptibility to TB / Doutor

Orientador: Jussara Marcondes Machado / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Maria Foschiani Dias Baptista / Resumo: A tuberculose é uma doença ainda em expansão, que foi declarada pela Organização Mundial da Saúde, em 1995, emergência sanitária mundial. Dificultam seu controle a longa duração do tratamento e ausência de marcadores para medir o sucesso ou a falha deste tratamento. Na patogenia da tuberculose, citocinas como IFN-γ e TNF-α tem papel fundamental, pois são responsáveis pela interação do linfócito T com o macrófago infectado, fator central da imunidade protetora contra o M. tuberculosis, sendo também produzidas durante essa interação. Como as citocinas pró-inflamatórias... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is still increasing and was declared a worldwide sanitary emergency by the WHO in 1995. Its control is difficult due to long treatment duration and lack of markers of treatment success or failure. Cytokines such as IFN-y and TNF-a., a central factor in immune response against M. tuberculosis, are responsible for the interaction between T Iymphocytes and the infected macrophage, and are also produced during this interaction. As proinflammatory cytokines have a close relationship with micobacteria clearance, in fact even preceding it, they could be used as markers for inflammatory activity and response to treatment. Proinflammatory cytokines act in the liver and stimulate a strong local and systemic acute phase response (APR) as a result of homeostatic and physiological responses also induced by them. Acute phase proteins produced by cytokine activity are useful diagnostic markers that could also be used to monitor treatment response as they can be serially quantified. The objective of this study was to evaluate IFN-y, TNF-a, IL-10, and TGF-13 production in supernatant of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and monocytes (MO) cultures, and the serum acute phase response through total protein, albumin, globulins, C-reactive protein (CRP), a-1-acid glycoprotein (AGP), and erythrocyte sedimentation rate (ESR) as regression markers of inflammatory response during pulmonary tuberculosis treatment. Twenty blood donors (G1) from the Blood Bank at Botucatu School of Medicine's University Hospital (HC-FMB) were evaluated once and 28 (G2) pulmonary tuberculosis patients: 13 from HC-FMB and 15 from the Bauru State Health Secretary. Patients were evaluated at three moments of treatment: before (M1), at three months (M2), and at the end (M3). Cytokines were determined in 20mL of peripheral blood (ELlSA), with or without activation: LPS for MO culture and PHA for PBMC culture... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto / Co-orientador: Regina Celia Galvao Frem / Banca: Vania Martins Nogueira / Banca: Antonio Eduardo Mauro / Banca: Alexandre Cuin / Banca: Adriano Bof de Oliveira / Resumo: Apesar de não ser um elemento biológico essencial, a prata metálica e seus derivados (ex. AgNO3 e complexos) têm apresentado várias aplicações medicinais como na purificação da água, tratamento de ferimentos, recobrimentos anti-infecção de instrumentos médicos, no tratamento de queimaduras pois possuem propriedades anti-microbianas potentes com baixa toxicidade em seres humanos. Sua utilização como agente antimicrobiano nos remete ao inicio da história humana, sendo muito utilizada na preservação de água potável durante anos, recurso primordial em conflitos militares. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados novos complexos de prata(I) do tipo Ag(NN)(tu)X, onde NN = 2,2'-bipiridina (bpy), 1,10-fenantrolina (phen), dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina (dppz) e 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phd); tu = tiouréia e X = NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - e SO4 2-. Os complexos foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia na região do IV, ressonância magnética nuclear (1H), análise elementar e espectrometria de massas. As estruturas moleculares dos complexos [{Ag(bpy)(μ-tu)}2](NO3)2 (A1) e [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) foram determinadas por difração de raios-X de monocristal, indicando um sistema binuclear com os centros de prata(I) conectados em ponte pelo atomo de enxofre da molécula de tiouréia. A atividade biológica in vitro dos compostos [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) foram estudadas frente a fungos (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bactérias (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis e formas amastigota e promastigota da L. amazonensis. Mesmo sendo um estudo bastante reduzido, tendo em vista a quantidade de microorganismos e de compostos estudados, foi possível averiguar algumas varições no comportamente biológico com a alteração tanto do ligante quelante NN quanto do contra-íon. Com resultados promissores, os estudos de... / Abstract: Even Ag0, and its derivates, being not an essential element, they have presented medicinal applications such as water purification, injuries treatment, antiinfection recovery of medical instruments, burn treatment as they have powerful antimicrobial properties and low human toxicity. Silver compounds have been used as antimicrobial agent since the beginning of human history when it was added to potable water for preservation as a primary resource in military conflicts. In the present work novel silver complexes (I) of Ag(NN)(tu)X type in which X = 2,2-bipiridine (bpy), 1,10-phenantroline (phen), dipirido[3,2-a:2',3'-c]phenazine (dppz) and 1,10- phenantroline-5,6-dione (phd); tu= thiourea and X=NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - and SO4 2- have been synthesized and characterized. The complexes had been characterised by infrared spectroscopy, 1H nuclear magnetic resonance, elementary analysis and mass spectroscopy techniques. The crystal structures of [{Ag(bpy)(μ- tu)}2](NO3)2 (A1) and [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) were determined by single crystal X-ray diffraction indicating a binuclear system with silver(I) centers bridgebonded by sulphur atoms of thiourea molecule. The in vitro biological activity of [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) compounds had been studied for fungi (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bacteria (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis and amastigote and promastigote forms of L. amazonensis. Although a reduced study has been performed in view of the microorganisms and compounds quantities it was possible to evaluate some changes on biological behavior by both chelant ligand NN and counterion modification. Promising results were obtained on the antileishmanial activity for B2 compound which have showed a selectivity index (SI) of 13,8-15,5 values much higher than the observed for AmpB, the standard drug (5,5-5,83). / Doutor

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450558-Texto+Completo-0.pdf: 2693787 bytes, checksum: e4ffe9234a98b2ddfc9bc350c708c01c (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB), one of the oldest recorded human afflictions, is still one of the biggest killers among the infectious diseases. The HIV co-infection and the emergence of multidrug resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. The modern approach to the development of new chemical compounds against complex diseases, especially the neglected endemic ones, such as TB, is based on the use of defined molecular targets. Enzymes from the pyrimidine biosynthesis pathway have been considered potential targets for identification or development of novel anti-mycobacterial agents since in bacteria, pyrimidine nucleotide interconvertion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. Cytidine 5'-monophosphate kinase from Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) catalyzes the ATP-dependent phosphoryl group transfer preferentially to CMP and dCMP. Here, initial velocity studies and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) measurements showed that MtCMK follows a random-order kinetic mechanism of substrate binding, and an ordered mechanism for product release. The thermodynamic signatures of CMP and CDP binding to MtCMK showed favorable enthalpy and unfavorable entropy, and ATP binding was characterized by favorable changes in enthalpy and entropy. The contribution of linked protonation events to the energetics of MtCMK:phosphoryl group acceptor binary complex formation suggested a net gain of protons. Values for the pKa of a likely chemical group involved in proton exchange and for the intrinsic binding enthalpy were calculated. The Asp187 side chain of MtCMK is suggested as the likely candidate for the protonation event. Data on thermodynamics of binary complex formation were collected to evaluate the contribution of 2'-OH group to intermolecular interactions. The data are discussed in light of functional and structural comparisons among CMP/dCMP kinases and UMP/CMP ones. / A tuberculose (TB), uma das doenças mais antigas da humanidade, ainda é uma das principais causas de morte entre as doenças infecciosas. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Novas abordagens para o desenvolvimento de compostos contra doenças complexas, especialmente doenças endêmicas negligenciadas, são baseadas no uso de alvos moleculares definidos. Enzimas envolvidas no metabolismo de pirimidinas tornam-se alvos moleculares interessantes para compostos inibidores, uma vez que em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biossíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. A citidina 5'-monofosfato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) em estudo, catalisa a transferência reversível de um grupamento fosforil a partir de ATP, preferencialmente para CMP e dCMP. Neste trabalho, os estudos de velocidade inicial e experimentos de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) demonstraram que a adição dos substratos (CMP e ATP) à MtCMK segue um mecanismo cinético sequencial aleatório, e que a liberação dos produtos ocorre de forma ordenada, onde o ADP é o primeiro produto a ser liberado. As assinaturas termodinâmicas da ligação do CMP e do CDP à MtCMK mostraram variações favoráveis da entalpia e desfavoráveis da entropia, e, a ligação do ATP foi caracterizada por mudanças favoráveis da entalpia e da entropia. As contribuições energéticas oriundas dos eventos de protonação, associados à formação do complexo binário MtCMK:receptor do grupamento fosforil, sugerem um ganho líquido de prótons. Além disso, foram calculados os valores de pKa de um provável grupo envolvido na troca de prótons, e da entalpia de ligação intrínseca. A cadeia lateral do Asp187 da MtCMK é sugerido como provável candidato para o evento de protonação. As medidas termodinâmicas da formação do complexo binário foram coletados a fim de avaliar a contribuição do grupo 2'-OH da pentose nas interações intermoleculares. Os dados obtidos foram discutidos comparando-se as características estrutural e funcional entre as CMKs já estudadas e a UMP/CMP quinase humana.

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450257-Texto+Completo-0.pdf: 1851494 bytes, checksum: 45b94fe1b9cb73399670961f3d6d6798 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8. 7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. / A tuberculose humana (TB) é uma doença infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de saúde. Estima-se que 8,7 milhões de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infecção ocorrem devido à sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservatório da doença. Adicionalmente, a emergência de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfecção TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de ação. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) está envolvida em ambas as vias de biossíntese de purinas. Neste trabalho, nós descrevemos a amplificação, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e expressão em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com análises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homogênea. Foi demonstrado através de cromatografia de exclusão por tamanho que a proteína é um homotetrâmero em solução. Ensaios de cinética no estado estacionário revelaram que a MtASL exibe um modelo de cinética hiperbólica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catalítico ácido-básico e, tais estudos, combinados ao alinhamento múltiplo de sequências, permitiram propor os resíduos de aminoácidos envolvidos na reação. Adicionalmente, estudos de inibição pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titulação isotérmica da ligação dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cinético da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identificação de análogos de nucleotídeos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451400-Texto+Completo-0.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451791-Texto+Completo-0.pdf: 11131527 bytes, checksum: 73b1d535d96f83c30dd5fb46e7f2af5d (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.