O diagnóstico da tuberculose por métodos tradicionais é lento e laborioso. Por outro lado, os testes moleculares são rápidos, mas com custo elevado para países em desenvolvimento. Este projeto teve o objetivo de inserir no micobacteriófago D29 o gene que codifica a proteína verde fluorescente (eGFP) e estudar o fago recombinante na detecção rápida de bacilos da tuberculose. Para tanto, foi inserido o cassete Hsp60- eGFP no genoma do fago D29 por recombinação. Micobacteriófagos recombinantes purificados foram utilizados para infectar M. smegmatis mc2 155 e M. tuberculosis H37Rv durante um período de 1- 6h nas temperaturas de 30°C, 37°C e 42°C. Bactérias fluorescentes foram observadas em um período de 2h, mas em número reduzido, indicando que o micobacteriófago lisou às células rapidamente, dificultando a expressão da eGFP e visualização em microscópio de fluorescência. A deleção do gene LysA, foi efetuada a fim de aumentar o período de latência do fago. Não foi possível a purificação de fagos recombinantes, devido à baixa quantidade de recombinantes nos halos de inibição. Será necessário a redução da atividade o gene LysA e, provavelmente, de outros genes associados a lise celular a fim de aumentar a concentração de eGFP no interior da célula. / Classical biochemical methods for Mycobacterium tuberculosis identification are lengthy and time-consuming. On the other hand, molecular assays are rapid but expensive for developing countries. This project aimed to insert into the mycobacteriophage D29, the gene coding for the green fluorescent protein (eGFP) and use the recombineered phage to detect Mycobacterium tuberculosis rapidly and less costly. For that, the Hsp-eGFP cassette was inserted into D29 genome. Recombineered mycobacteriophages was purified and used to infect M. smegmatis mc2 155 and M. tuberculosis H37Rv from 1-6 hs at 30°C, 37°C and 42°C. Observation of fluorescent bacteria was difficult and only a small number of them were seen at 2 hs of infection. This indicated that recombineered bacteriophages were lysing cells rapidly. Deletion of LysA gene, was carried out to increase the time needed for bacterial lysing. it was not possible to purify mutant mycobacteriophages due to the low concentration of recombinant phages. We conclude that might be necessary the deletion of other genes such as LysB, a gene also involved in cell lysis and reduction LysA activity to increase the concentration of eGFP inside cells.

INTRODUÇÃO: A tuberculose (TB) é uma doença grave, porém curável em praticamente 100 por cento dos casos novos, desde que os princípios da quimioterapia sejam seguidos. Porém, ainda determina elevadas taxas de morbimortalidade no município de São Paulo. OBJETIVOS: Descrever os casos de óbito por tuberculose no município de São Paulo, segundo causas básicas nos anos censitários de 1980, 1991, 2000 e 2010. MÉTODOS: Estudo descritivo que analisou a mortalidade por TB como causa básica, utilizando os dados do PRO-AIM, e da Fundação SEADE. RESULTADOS: Houve redução inconstante do número e da taxa de mortalidade por TB ao longo do período estudado, de 5,9 em 1980 para 2,8 por 100 mil habitantes, em 2010. Foi observada redução acentuada da mortalidade de 1980 até 1985, quando houve reversão desta tendência tornando-se crescente até 1996, quando declina novamente. Houve predomínio três vezes superior dos óbitos masculinos. A faixa etária mais atingida pelos óbitos por tuberculose no MSP foi a dos 60 anos e + de idade. Quanto à forma clínica, predominaram os óbitos por TB pulmonar (83,9 por cento ) seguidos pela TB miliar (10,4 por cento ). Foi observada importante influência da ampla cobertura da vacina BCG no MSP na redução dos óbitos por TB meníngea nos menores de 4 anos de idade. A melhor evolução quanto à mortalidade por TB foi na Zona Norte do município, sendo a Zona Leste, a região que apresentou nos quatro anos estudados, aumento proporcional dos óbitos por tuberculose no MSP, apesar da redução dos coeficientes de mortalidade encontrados em todas as regiões do município. CONCLUSÃO: A terceira idade deve ser privilegiada quanto às ações do PCT no MSP. Identificar áreas com diferentes coeficientes de mortalidade por tuberculose no MSP permite ao PCT priorizar estas diferentes regiões, dando especial atenção à região Leste. Dada a conhecida associação entre TB/HIV, a influência da epidemia de Aids reflete indiretamente nas tendências de mortalidade de tuberculose / INTRODUCTION: Tuberculosis (TB) is a serious disease, is curable in virtually 100 per cent of new cases, provided that the principles of chemotherapy are followed. However, still determines high rates of morbidity and mortality in São Paulo city (SPC). METHODS: Descriptive study of tuberculosis as underlying cause of death based on secondary data from the São Paulo City Information Mortality System (PRO-AIM), and the Foundation System State Information from São Paulo Brazil (SEADE). RESULTS: An fluctuating reduction of tuberculosis death numbers and mortality rates during the study period, from 5,9 in 1980 to 2,8 per 100,000 inhabitants in 2010, was observed. An accelerated reduction in mortality trend was seen from 1980 until 1985, when there was a reversal of the trend that became increasingly growing and so staying until 1996, when it declines again. Three fold male deaths predominated during the period. The 60 years old and above age group was the most affected by TB deaths in the MSP. Regarding the clinical form, the deaths by pulmonary TB (83.9 per cent ) followed by miliary TB (10.4 per cent ) predominated. A significant influence of coverage of BCG vaccine in São Paulo city in reducing deaths due to TB meningitis in children under 4 years old was observed. The best evolution in terms of TB mortality was seen in northern SPC. The eastern presented a proportional increase in tuberculosis deaths in SPC in the four years studied, despite the reduction of mortality rates found in all regions of the city. CONCLUSIONS: The elderly group should be favored by the actions of the SPC Tuberculosis Control Program. The identification of areas with different TB mortality rates in the city of São Paulo allows the TBCT to prioritize these different regions. Given the well-known association between TB/HIV co-infection, the impact of Aids epidemic indirectly affects TB mortality trends

A tuberculose continua se apresentando como um dos mais importantes problemas de saúde pública em todo o mundo, mesmo em países mais desenvolvidos, especialmente após a década de 80 do século passado, com o surgimento da infecção e doença pelo HIV. Atualmente, a eficácia dos fármacos disponíveis para o tratamento da doença é excelente, desde que disponíveis e usadas de modo correto, regular. O número de vezes em que ocorrem falhas em sua administração, entretanto, e até mesmo abandono do tratamento, com conseqüentes prejuízos para a cura dos pacientes, não é desprezível. Na cidade de Porto Alegre-RS (Brasil) a taxa de abandono do tratamento da tuberculose vinha se mantendo estável até meados dos anos 80, mostrando-se mais elevada a partir de então. No presente estudo procurou-se identificar os fatores atualmente operantes, preditores de abandono, pretendendo com isto contribuir com alguma parcela para esclarecer o que ocorre, para que medidas possam ser tomadas no sentido de melhorar a adesão à terapêutica. O trabalho foi realizado nas seis Unidades de Saúde de referência para tratamento da tuberculose na Cidade de Porto Alegre-RS, tendo sido revisados os prontuários de todos os casos de abandono por parte de pacientes bacilíferos, virgens de tratamento (VT), nos anos 2004,2005 e 2006, com pareamento de 1:1 com casos de cura nas mesmas condições e período. As associações mais significantes (P<0,001) para ocorrência do abandono do tratamento, de acordo com a modelagem da análise multivariada para as variáveis estudadas, foram etilismo com ou sem a concomitância de uso de drogas ilícitas, presença do HIV, moradia não familiar e menor nível de escolaridade. Na análise univariada, indivíduos mais jovens, raça não caucasiana também se revelaram significativos. Sexo e efeitos adversos da medicação não mostraram relação com o abandono, no presente estudo. / Tuberculosis follows as one of the most important problems of public health worldwide, mainly after the years 80 of the past century, with the emergence of either HIV infection or disease. Actually, effectiveness of the available drugs for treatment of the disease is excellent, if properly used. However, flaws may occur, including the abandon of the medication, with consequent damage to the treatment program. In the city of Porto Alegre - RS (Brazil) the abandon rate of tuberculosis treatment remained stable until 1990’s when it began to rise. The present study looked for to identify the factors today operating as predictors of the abandon, offering that as a contribution to measures for better adhesion to the treatment. The study was performed in six Basic Health Unities, reference for management of tuberculosis patients in the city. Between 2004 and 2006 the charts of all cases diagnosed as tuberculosis whose patients abandoned the treatment were reviewed, in parallel with a same number of cases of cure without abandon. According to the multivariate model analysis used, alcoholism with or without other drug addiction, HIV presence, and no familiar home, and lower level of education were the most significant associations (P<0.001) with the treatment abandon. On univariate analysis, younger or no caucasian individuals, were also significant. It was not observed relation of the abandon with adverse effects of medication.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.

Objetivos: Avaliar o desempenho e o custo-efetividade de duas técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction) in house: PCR dot-blot e o PCR utilizando a eletroforese em gel de agarose (PCR-AG) no diagnóstico de Tuberculose Pulmonar em pacientes infectados ou não pelo HIV . Material e Métodos: Um estudo prospectivo foi conduzido (de Maio de 2003 a Maio de 2004) em um Hospital de Referência para TB/HIV. Escarros de 277 indivíduos com suspeita de Tuberculose Pulmonar (PTB) foram testados pelas técnicas de microscopia direta pela coloração de Ziehl-Neelsen (ZN), cultura e pelas metodologias de PCR in house (PCR dot-blot e PCR-AG). A acurácia dos testes foi avaliada de acordo com o status de HIV, com o status de tratamento prévio ou não, e com a estimativa de probabilidade pré-teste feita pelos pneumologistas. O padrão ouro utilizado foi a cultura positiva combinada com a definição clínica de PTB (usando sintomas, fatores de risco e Raios-X). O custo efetividade foi expresso por: a) custo por correto caso diagnosticado de Tuberculose; b) custo por correto caso diagnosticado de Tuberculose e tratado incluindo tratamento de casos falsamente diagnosticados; c) custo por casos incorretamente diagnosticados e não tratados. Resultados: Prevalência de PTB foi 46,2% (128/277); em HIV soropositivo (HIV+) foi de 54% (40/74). Em pacientes com baciloscopias negativas foi de 28,4% (43/151) e nos grupos com probabilidades pré-teste alta, intermediária e baixa foi de 67,4% (31/46); 24% (6/25) e 7,5% (6/80). A sensibilidade e a especificidade do PCR dot-blot foi 74% (CI 95%; 66,1%-81,2%) e 85% (CI 95%; 78,8%-90,3%); do PCR-AG foi 43% (CI 95%; 34,5%-51,6%) e 76% (CI 95%; 69,2%-82,8%), respectivamente. Sensibilidades do PCR dot-blot (72% vs 75%; p=0,46) e PCR-AG (42% vs 43%; p=0,54) foi similar para HIV+ and HIV seronegativo (HIV-). Em relação ao efeito da suspeita clínica no desempenho do PCR em pacientes com PTB e com a baciloscopia negativa, o PCR dot-blot combinado com alta probabilidade pré-teste de TB mostrou uma sensibilidade, Valor Preditivo Negativo (VPN) e Razão de Verossimilhança negativa (RV-) de 93%, 96% e 0,1, respectivamente. Usando a estratégia de associar ZN a Cultura, a PCR-AG e PCR dot-blot. A ZN associada à Cultura mostrou o melhor desempenho com sensibilidade de 94% e VPN de 99%, e RV- de 0,07, seguida da ZN associado ao PCR dot-blot com sensibilidade de 90%, com VPN de 99% e uma RV- de 0,12. Não houve diferença significativa no desempenho do PCR em relação ao status de HIV. Na análise de custo-efetividade os custos por correto caso diagnosticado de Tuberculose foram U$1.462,00 , U$1.296,00 e U$1.136,00; os custos por correto caso diagnosticado de Tuberculose e tratado, incluindo tratamento de casos falsamente diagnosticados, foram de US$1.608,00 para a estratégia do ZN associado ao PCR-dotblot e de US$2.359,00 para a estratégia de ZN associado a Cultura. Os custos por casos não diagnosticados que retornam aos serviços de saúde foram de US$3.735,00 para a estratégia de ZN associado ao PCR-dot-blot e de US$2.329,00 para a estratégia de ZN associada à Cultura. Conclusão: Este estudo mostra que as técnicas de PCR in house podem oferecer uma melhora para o diagnóstico de exclusão de TB em pacientes com suspeita de TB atendidos em hospitais com alta prevalência de TB e HIV. / Objective: To evaluate the performance and cost-effectiveness of two in house PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques: PCR dot-blot methodology (PCR dot-blot) and PCR agarose gel electrophoresis (PCR-AG) for the diagnosis of Pulmonary Tuberculosis (PTB) in patients with or without HIV. Methods: A prospective study was conducted (from May 2003 to May 2004) in a TB/HIV reference hospital. First sputum from 277 PTB patients suspects was tested by Ziehl-Neelsen direct microscopy staining (ZN), culture and in house PCR assays (PCR dot-blot and PCR-AG). The accuracy of tests was evaluated in according to HIV status, previous treatment and the estimative of pretest probability (PP) of PTB performed by chest physicians. Gold standard was the culture positive combined with the definition of clinical PTB (based on symptoms, risk factors and chest X- Ray). The cost effectiveness was expressed as: a) cost per correctly diagnosed case of PTB; b) cost per case correctly diagnosed and treated, including treatment of falsely diagnosed cases; c) cost per case incorrectly diagnosed and non treated. Results: The prevalence of PTB was 46% (128/277); in HIV Seropositive (HIV+) was 54% (40/74). In patients ZN negative was 28.% (43/151) and in the groups with high, intermediary and low PP was 67.4% (31/46); 24% (6/25) and 7.5% (6/80). The Sensitivity and Specificity of PCR dot-blot were 74% (CI 95%; 66.1%-81.2%) and 85% (CI 95%; 78.8%-90.3%); of PCR-AG were 43% (CI 95%; 34.5%-51.6%) and 76% (CI 95%; 69.2%-82.8%), respectively. Sensitivities of PCR dot-blot (72% vs 75%; p=0.46) and PCR-AG (42% vs 43%; p=0.54) were similar for HIV+ and HIV Seronegative (HIV-). In relation to the effect of clinical suspicion on the performance of PCR in patients with PTB and ZN negative, the PCR dot-blot associate to high pretest probability of PTB showed sensitivity, Negative Predictive Value (NPV) and negative likelihood ratio (LR-) of 93%, 96% and 0.1, respectively. Using the strategy of associate ZN with Culture and PCR methods (PCR-AG and PCR dot-blot), the ZN plus Culture had the highest performance: Sensitivity of 94%, VPN of 99% and LR- of 0.07. ZN plus PCR dot-blot also had a good performance with sensitivity of 90%, VPN of 99% and LR- of 0.12.There was not statistical difference on the performance of PCR in relation to HIV status. Costs per correctly diagnosed case were U$1,462, U$1,296 and U$1,136 for ZN plus culture, ZN plus PCR-AG and ZN plus PCR dot-blot, respectively. The cost per case correctly diagnosed and treated, including treatment of falsely diagnosed cases, was US$1,608 for ZN plus PCR dot-blot and US$2,359 for ZN plus culture. Cost of the return of all false negatives to health service was US$3,735 for ZN plus PCR dot-blot and US$2,329 for ZN plus Culture. Conclusion: This study shows that in house PCR may offer an improvement for ruling out TB diagnosis for PTB suspects assisted at hospitals with a high prevalence of TB and HIV.

Para auxiliar no controle da tuberculose são necessários novos métodos de detecção de Mycobacterium tuberculosis que sejam rápidos, específicos e de aplicabilidade em laboratórios de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento. Vários métodos moleculares de detecção e identificação de micobactérias em amostras clínicas têm sido desenvolvidos. Com o objetivo de padronizar e aplicar essas metodologias em laboratório foi desenvolvido um protocolo baseado na amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) e na detecção colorimétrica em microplacas. Uma região interna do elemento de inserção IS6110, específico do complexo M. tuberculosis, foi selecionada como alvo para amplificação por PCR com primers biotinilados. Uma sonda complementar a uma região interna do fragmento foi fixada em microplacas onde, posteriormente, foi hibridizado o produto amplificado. A detecção através de hibridização foi feita utilizando um conjugado estreptavidina peroxidase. A eficácia da técnica foi testada em amostras clínicas pulmonares de pacientes com suspeita de infecção e sem tratamento prévio para tuberculose. O padrão ouro no diagnóstico de infecção por M. tuberculosis foi a associação da baciloscopia com a cultura a partir da amostra clínica dos pacientes selecionados. Foram testadas 303 amostras de escarro induzido de 303 pacientes com suspeita de TB pulmonar, dos quais 69 apresentaram resultado positivo e 234 negativo para TB. A sensibilidade e especificidade obtidas foram 88% e 98% e os Valores Preditivos Positivo (VPP) e Negativo (VPN) foram 92% e 97%, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que a técnica desenvolvida no presente estudo pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de tuberculose e poderia ser utilizada como um teste complementar no diagnóstico da doença. / New methods to detect Mycobacterium tuberculosis rapidly, accurately and that are feasible to apply in laboratories of developing countries are necessaries. Several methods for direct detection and identification of mycobacteria in clinical samples have been developed. With the aim to standardize the application of such methods in laboratory, we developed a molecular method for DNA extraction and PCR detection using a microwell plate hybridization assay. An internal region of the repetitive element, specific of M. tuberculosis complex, called IS6110 was selected as a target for amplification using specific biotinylated primers. The detection of amplified fragments was performed using microwell plates. An aminated DNA fragment complementary to an internal region of the amplified fragment was used as a probe. The biotinylated amplified products were added to the plate and identified with the use of streptavidin conjugated to horseradish peroxidase. The efficacy of the method was tested to detect pulmonary tuberculosis in patients suspected of TB infection with no previous treatment. As gold standard, the bacteriological criteria was used. Three hundred and three induced sputum samples from 303 pulmonary TB suspects were evaluated, of which 69 showed positive result and 224 negative for TB. The sensitivity and specificity obtained were 88% and 98% and Positive and Negative Predictive Values were 92% and 98%, respectively. The obtained results demonstrated that the PCR detection using a microwell plate hybridization assay may be an important tool for the diagnosis of tuberculosis and suggest that it could be used as a complementary diagnostic method.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-11T19:06:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Daniela Silva de Aquino.pdf: 2755688 bytes, checksum: 229a89e86e566bb18d5d2b11c8b58eba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T19:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Daniela Silva de Aquino.pdf: 2755688 bytes, checksum: 229a89e86e566bb18d5d2b11c8b58eba (MD5) Previous issue date: 2014-10-29 / A tuberculose (TB) é uma das causas mais comuns de morbidade e a principal causa de mortalidade entre os pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). A Organização Mundial de Saúde (OMS) propõe o tratamento para a infecção tuberculosa latente (TBLi) para pacientes vivendo com HIV/Aids (PVHA) com isoniazida (INH) como forma de evitar o aparecimento da TB ativa. Apesar da demonstração em diversos estudos sobre a efetividade da INH na prevenção de TB, a não adesão ao tratamento tem sido comum. O objeto de investigação deste estudo foi a indicação, o início e a adesão ao tratamento preventivo para TB em PVHA atendidos em dois Serviços de Referência para HIV/Aids em Pernambuco no período de Novembro de 2007 a Dezembro de 2012, e para isso, foram realizados dois estudos. O primeiro artigo trata-se de um estudo de coorte prospectivo com pacientes que tinham indicação para realizar o tratamento da TBLi. O objetivo desse estudo foi analisar a efetividade da INH 300mg/dia, por seis meses, e os fatores associados ao não início do tratamento. Dos 232 pacientes com indicação para realizar o tratamento, 162 (69,8%) iniciaram o tratamento para TBLi. Seis pacientes tiveram TB até o final do estudo e a taxa de incidência para aqueles que não iniciaram o tratamento para a TBLi foi três vezes maior do que para aqueles que iniciaram. Na análise multivariada estiveram associadas ao não início do tratamento as variáveis uso de drogas ilícitas e serviço de atendimento. O segundo artigo relata também um estudo de coorte prospectivo com 54 pacientes que iniciaram o tratamento para TBLi acompanhados em apenas um dos serviços de saúde no período de 2009 a 2012. A frequência da adesão ao tratamento da TBLi pelo auto-relato foi de 31,5% e pelo teste de urina, 22,2%. Do total de 324 consultas programadas, foram analisados 177 (54,6%) momentos em que os pacientes retornaram ao serviço para realização do monitoramento do tratamento da TBLi. Após a comparação dos métodos, verificou-se concordância em 142 momentos (coeficiente Kappa = 0,38). Percebe-se que ainda há resistência para iniciar e concluir o tratamento da TBLi em PVHA. Assim, é necessário treinar os profissionais de saúde responsáveis pelo cuidado de PVHA, a fim de realizar o tratamento preventivo da TB. Em relação às medidas de adesão, independentemente do método utilizado, é necessário mais compromisso de profissionais de saúde e pacientes para reduzir o número de mortes por TB.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T15:11:48Z No. of bitstreams: 2 TESE Gabriela Guedes.pdf: 1658990 bytes, checksum: d74ac5823949c1e44d7efd506322f238 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T15:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Gabriela Guedes.pdf: 1658990 bytes, checksum: d74ac5823949c1e44d7efd506322f238 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / A imunossupressão, causada por diversos fatores tais como desnutrição, doença auto-imune, infecção pelo HIV ou uso de drogas imunossupressoras tem contribuído com o aumento da incidência da tuberculose (TB) no mundo. O requisito essencial para o controle da TB é a identificação rápida e precisa dos indivíduos infectados. Os métodos convencionais (baciloscopia, cultura, histopatológico, radiografia de tórax e teste tuberculínico-TT) para diagnóstico da TB têm as suas limitações de especificidade, rapidez e sensibilidade. Ainda é uma tarefa desafiadora diferenciar pacientes com tuberculose ativa daqueles com lesões quiescentes, vacinação prévia com BCG ou outras doenças com sintomas semelhantes ao da TB. Portanto, o trabalho teve como objetivo principal avaliar o desempenho dos testes QuantiFERON®-TB Gold (QFT-GIT) e PCR único tubo (STNPCR) no diagnóstico da TB em pacientes imunodeprimidos. Foram selecionados 100 pacientes, que foram divididos em dois grupos: imunodeprimidos (n = 88) e controle (n = 12). As amostras biológicas (sangue, urina, LCR e escarro) de todos os indivíduos envolvidos foram submetidas aos testes QFT-GIT e STNPCR. A sensibilidade e especificidade do QFT-GIT, da STNPCR e do TT foram 57,4% e 95,3%; 64,3% e 91,4%; 69,2% e 98,1%, respectivamente. Os testes QFT-GIT e TT demonstraram uma concordância moderada (κ = 0,41). Dez pacientes apresentaram resultado indeterminado ao QFT-GIT e apenas 1 foi reagente ao TT. A maior frequência de TT reatores ocorreu nos indivíduos com contagem de T CD4+ >350 céls/μL. Entre os pacientes com TT reator, 60% possuíam vacina BCG, confirmada através da cicatriz vacinal e 46,7% relataram história prévia de TB. Apenas 20% dos pacientes com TB confirmada apresentaram cultura bacteriana positiva nas amostras (urina, LCR ou escarro). Os testes QFT-GIT e STNPCR não demonstraram utilidade na rotina dignóstica em pacientes imunodeprimidos. Portanto, o TT deverá continuar a ser usado para a triagem inicial de pacientes imunodeprimidos com suspeita de TB.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-05-13T17:24:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE - CAROLLINE DE ARAÚJO MARIZ- PPGMEDTROP - versão digital.pdf: 13913765 bytes, checksum: 807dfe50740ff1ef8b1debe42632853e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-13T17:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE - CAROLLINE DE ARAÚJO MARIZ- PPGMEDTROP - versão digital.pdf: 13913765 bytes, checksum: 807dfe50740ff1ef8b1debe42632853e (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Pessoas vivendo com HIV/Aids (PVHA), diagnosticadas com tuberculose (TB) ativa, apresentam uma maior probabilidade em desenvolver reações adversas devido à reconhecida toxicidade hepática tanto dos antirretrovirais quanto dos tuberculostáticos. Esta tese resultou em três artigos originais e teve como principal objetivo estimar a incidência e identificar fatores associados ao desenvolvimento de hepatotoxicidade, verificar a ocorrência dos marcadores sorológicos dos vírus das hepatites B e C e fatores associados, além de verificar a associação entre polimorfismos e haplótipos do gene NAT2 e a ocorrência de hepatotoxicidade após o início do tratamento da TB em PVHA. Uma coorte de 173 indivíduos com infecção pelo HIV foi monitorada no Hospital Correia Picanço, durante o período de outubro de 2007 a agosto de 2012. Todos os pacientes tiveram as enzimas aminotransferases dosadas antes do início do tratamento para TB e 30 e 60 dias depois. Realizou-se análise de regressão logística bivariada e multivariada, e a magnitude das associações foi expressa pelo Odds Ratio (OR) como uma estimativa do risco relativo com intervalo de confiança de 95%. A incidência de hepatotoxicidade durante o tratamento para TB em PVHA foi 30,6% e foi demonstrada no primeiro artigo. O uso de fluconazol, a desnutrição e ser classificado fenotipicamente como acetilador lento para o gene NAT2 foram fatores associados de forma independente à hepatotoxicidade. No segundo artigo, entre os 173 pacientes avaliados antes do início do tratamento para TB, 166 (95,9%) foram investigados quanto à presença de marcadores sorológicos HBV e HCV, cuja prevalência na população foi de, respectivamente, 36,7% e 6,6%. Os homens com 40 anos ou mais apresentaram um risco maior de infecção pelo HBV. O terceiro artigo evidencia a associação da presença do alelo variante nos loci polimórficos C282T e G590A do gene NAT2 à hepatotoxicidade após o início de drogas antituberculose em PVHA. Indivíduos portadores de haplótipos GT/GT e GT/AC apresentam um risco de até 4,4 vezes, para desenvolver hepatotoxicidade (p < 0,005). Acredita-se que pesquisas sobre este tema possam contribuir para tornar o tratamento da TB individualizado principalmente em PVHA, por meio da adaptação das drogas e suas dosagens, de acordo com o perfil genético baseado em haplótipos funcionais do Gene NAT2. Recomenda-se que o uso de fluconazol deve ser evitado em PVHA durante o tratamento da tuberculose. / People living with HIV/AIDS (PLWHA), diagnosed with active tuberculosis (TB), are more likely to develop adverse reactions due to liver toxicity both of the antiretroviral as of tuberculosis treatment. This thesis resulted in three original articles that aimed to estimate the incidence and risk factors associated with the development of hepatotoxicity, to verify the occurrence of serological markers of hepatitis B and C and related factors, and the association between polymorphisms and haplotypes the NAT2 gene and the occurrence of hepatotoxicity after initiation of treatment for TB in PLWHA. A cohort of 173 individuals with HIV infection was followed up in Correia Picanço Hospital, during the period from October 2007 to August 2012. All patients had aminotransferase enzymes dosed prior to the start of treatment for TB and 30 and 60 days after. We conducted a bivariate and multivariate logistic regression analysis and the magnitude of the associations was expressed by odds ratio (OR) as an estimate of relative risk with 95% confidence interval. The first article showed the incidence of hepatotoxicity in PLWHA during treatment for TB, that was 30.6%. The use of fluconazole, malnutrition and be classified phenotypically as slow acetylator for NAT2 gene have been the independent factors associated of hepatotoxicity. In the second article, among the 173 patients evaluated before the initiation of treatment for TB, 166 (95.9%) were investigated for the presence of serological markers HBV and HCV, whose prevalence in the population was, respectively, 36.7% and 6.6%. Men aged 40 years and older had a higher risk of HBV infection. The third article highlights the association between the presence of the variant allele in the polymorphic loci C282T and G590A of NAT2 gene and the occurrence of hepatotoxicity after initiation of antituberculosis drugs for PLWHA. Individuals with haplotypes GT/GT and GT/AC present a risk of up to 4.4 times for developing hepatotoxicity (p <0.005). We believe that research on this topic, can contribute to make individualized treatment of tuberculosis, mainly in PLWHA, through the adaptation of drugs and their dosages, according to the genetic profile based on functional gene NAT2 haplotypes. We recommend that the use of fluconazole should be avoided in PLWHA during tuberculosis treatment.