Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311393.pdf: 785970 bytes, checksum: b628c8934069715d74f3a60fd9806c1d (MD5) / A tuberculose continua sendo um grave problema de saúde pública mundial e impõe desafios para o seu controle. Estudos têm sido realizados em diversos locais do mundo a fim de auxiliar no planejamento de estratégias calcadas nas particularidades de populações específicas com o objetivo de contribuir para a redução do problema. O objetivo do estudo foi conhecer o perfil epidemiológico dos casos notificados no Ambulatório de Tisiologia do Hospital Sanatório Partenon, no município de Porto Alegre (Rio Grande do Sul), Brasil, nos anos de 2007 e 2008, abrangendo aspectos demográficos, socioeconômicos, comportamentais, clínicos e laboratoriais. Foi realizada uma investigação retrospectiva de cunho descritivo, através de informações contidas nos prontuários dos pacientes em tratamento para tuberculose no local. O estudo mostrou o predomínio de homens com idade produtiva em tratamento no local. Verificou-se também o impacto do uso de álcool e/ou drogas ilícitas, das situações de retratamento e de coinfecção do HIV/AIDS no desfecho do tratamento da tuberculose. O estudo evidenciou a necessidade de criar estratégias de amplo alcance, com a participação de outras instâncias decisórias nos campos da política, da economia e da sociedade, a fim de reduzir situações de geram vulnerabilidades. / Tuberculosis remains a serious public health problem worldwide and poses serious challenges for its control. Everywhere, efforts have been made in order to generate strategies that take into account the characteristics of specific populations in order to help its control.. The object of this paper is to study the epidemiological profile of the reported cases in the MTB ambulatory of the Parthenon Sanatorium Hospital, in Porto Alegre, Southern Brazil, in the period 2007 - 2008, covering demographic, socioeconomic, behavioral, clinical and laboratorial aspects. To reach our objective, we carried out a descriptive and retrospective investigation on the information contained in the records of patients treated for tuberculosis at the hospital. The results show the higher proportion of men of working age, being treated at the hospital. The impact of alcohol and / or illicit drugs, the reincidence, and co-infection of HIV / AIDS in the outcome of tuberculosis treatment, is discussed. We highlight the need for wide-ranging strategies, with the participation of other decision-makers in the political, economic and socieal spheres in order to reduce the circumstances that generate vulnerability.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biolólogicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314078.pdf: 10245292 bytes, checksum: 7c929eea613abee45aaedc328628ac4e (MD5) / A S-nitrosilação de PtpA de Mycobacterium tuberculosis diminui sua atividade fosfatase. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da S-nitrosilação nos parâmetros cinéticos e na estabilidade térmica de PtpA. Por meio de ensaios de biotin switch observou-se que a substituição do resíduo Cys53 por um resíduo de alanina em mutantes resultou em proteínas incapazes de se ligar a biotina após tratamento com doador de NO. Observou-se também que a KM da PtpA nitrosilada foi semelhante à sua forma não modificada, mas a Vmax foi reduzida pela metade. Em contraste, a mutante C53A tratada com GSNO mostrou KM e Vmax semelhantes à forma não tratada. Na desnaturação térmica de PtpA S-nitrosilada, a TM diminuiu consideravelmente na proteína selvagem, C11A e C16A, porém as mutantes C53A, C11A/C53A e C16A/C53A não tiveram mudanças significativas. Esses resultados sugerem que a S-nitrosilação ocorre especificamente na C53 não catalítica, essa alteração não afeta a afinidade pelo substrato e a S-nitrosilação da Cys53 afeta a estabilidade térmica da proteína. Por outro lado, outras duas proteínas de M tuberculosis foram estudadas, PtkA e SapM. A tirosina cinase PtkA fosforila a PtpA em dois resíduos de tirosina situados no PDYY-loop e se autofosforila na Tyr262. Neste trabalho, a PtkA recombinante foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por IMAC. Ensaios de CD revelaram que a proteína apresenta 42% de ?-hélice e 7% de folha-?, o que sugere que a proteína recombinante está corretamente enovelada. Por pertencer a família de proteínas HAD, a PtkA requer Mg2+ para a hidrólise do ATP. Foi observado que a TM da proteína aumenta consideravelmente na presença do metal, de 31 °C para 43 °C. Assim pode-se dizer que a ligação do metal ao sítio ativo estabiliza a estrutura terciária da proteína. A PtkA também é S-nitrosilada, porém o efeito dessa modificação pós-traducional sobre a atividade e estrutura da proteína ainda é desconhecido. A sequência de DNA que codifica SapM também foi inserida no vetor de expressão pET-14b. Diversas condições de expressão foram testadas sendo que se obteve maior rendimento em bactérias E. coli BL21 (DE3) pLysS na temperatura e tempo de indução de 15 °C por 20 horas. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano, essa teve que ser solubilizada pela adição de ureia 8M e posteriormente purificada por IMAC. As condições para o correto re-enovelamento ainda devem ser otimizadas para dar sequência à caracterização de SapM.<br> / Abstract : The S-nitrosylation of Mycobacterium tuberculosis PtpA decreases its phosphatase activity. The aim of this work is to investigate the effect of S-nitrosylation in PtpA kinetic parameters and thermal stability. By biotin switch assays it was observed that the substitution of Cys53 residue by an alanine residue in mutants C53A, C53A/C11A, C53A/C16A and C53A/C11A/C16A resulted in proteins unable to bind biotin upon NO donor treatment. It was also observed that the KM of nitrosylated PtpA was similar to its unmodified form, but the Vmax was reduced to half. In contrast, C53A treated with GSNO showed KM and Vmax similar to the untreated form. Thermal denaturation of Snitrosylated PtpA was evaluated by CD spectroscopy. When GSNO was added to PtpA, the TM decreased in wild type, C11A and C16A, while significant differences in C53A, C11A/C53A and C16A/C53A mutants were not observed. These results suggest that S-nitrosylation occurs specifically in the non-catalytic Cys53, this modification does not affect substrate affinity, and S-nitrosylated Cys53 affects protein thermal stability. Moreover, two other M. tuberculosis proteins are studied, PtkA and SapM. Tyrosine kinase PtkA phosphorylates PtpA in two tyrosine residues located in PDYY-loop and autophosphorylates at Tyr262. In this work, recombinant PtkA was expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified by IMAC. CD experiments reveal that the protein has 42% á- helix and 7% â-sheet, which suggest that the recombinant protein is properly coiled. Like other proteins belonging to HAD family, PtkA requires Mg2+ for ATP hydrolysis. It was observed that the TM of this protein greatly increases in the presence of metal, from 31 °C to 43 °C. Thus, it can be said that the metal binding to the active site of this enzyme stabilizes the tertiary structure of the protein. It was observed that PtkA is also S-nitrosylated, but the effect of this post-translational modification on the structure and activity of the protein is still unknown. The DNA sequence encoding SapM was also inserted into the expression vector pET-14b. Various expression conditions were tested. The higher yield was obtained in E. coli BL21 (DE3) pLysS during 20 hours of induction at 15 °C. As the protein remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate, it had to be solubilized by addition of 8M urea, and further purified by IMAC. The conditions for proper refolding still have to be optimized in order to be able to continue SapM characterization

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317847.pdf: 108629463 bytes, checksum: 55e6d96e9fdf83641c9a74d98bb356b0 (MD5) Previous issue date: 2013 / A pesquisa racional de novos candidatos a antígenos vacinais ou imunodiagnóstico destinados ao controle da tuberculose bovina (bTB) requer o conhecimento básico da imunopatogênese da doença. No entanto, ainda há escassez de informações sobre os aspectos imunopatológicos da interação Mycobacterium bovis-hospedeiro durante a infecção natural de bovinos. Na análise de uma coorte de 349 bovinos positivos no teste tuberculínico (PPD), em 247 bovinos foi confirmada a infectação natural pelo M. bovis. Dos animais positivos para M. bovis, 92% (228/247) não apresentavam sinais sugestivos da doença, entretanto, apresentavam lesões de bTB graves e disseminadas. Além disso, a disseminação das lesões de bTB estava correlacionada positivamente com a gravidade da patologia da doença e carga bacteriana viável no tecido. Adicionalmente, o encapsulamento do granuloma foi correlacionado negativamente com o crescimento do M. bovis nos tecidos, bem como com a gravidade da patologia, sugerindo que o encapsulamento é um mecanismo dinâmico e pode ser eficaz para controlar a proliferação/disseminação micobacteriana intragranuloma durante a infecção natural. Além disso, a avaliação detalhada da resposta granulomatosa nos pulmões demonstrou que o número de células gigantes multinucleadas tipo Langhans correlaciona negativamente com a contagem micobacteriana. Em contraste, a população de neutrófilos na resposta granulomatosa tuberculosa foi associado com o aumento na proliferação do M. bovis intragranuloma. Os achados aqui apresentados sugerem que o encapsulamento e as células gigantes multinucleadas estão associados ao controle da infecção pelo M. bovis, enquanto que os neutrófilos podem servir como um biomarcador celular de proliferação bacteriana durante a infecção natural. Como prova de conceito de que a dinâmica celular incitada durante a infecção por M. bovis influencia o controle do crescimento micobacteriano, analisamos parâmetros imunopatológicos durante a co-infecção natural com o vírus da leucose enzoótica bovina (BLV), um patógeno que modula a resposta imune adaptativa. Bovinos coinfectados com M. bovis e BLV apresentaram maior carga micobacteriana intragranuloma e uma doença mais grave. Na análise histomorfológica das lesões granulomatosas, observamos uma diminuição significativa na população de linfócitos, seguido por um aumento no número de neutrófilos e menor deposição de tecido conjuntivo. Estes dados sugerem uma alteração no fluxo de células para o ambiente intragranuloma devido a defeitos linfocitários. Consistente com essa hipótese, observamos uma menor resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em animais com linfocitose persistente (LP-BLV+). Estas evidências indicam que a infecção pelo BLV está associada à perda da homeostase da resposta imune celular do hospedeiro e possivelmente ao aumento da suscetibilidade do hospedeiro a bTB. Em conjunto, nossos dados integram a resposta granulomatosa do hospedeiro com a carga infecciosa micobacteriana e revelam novos elementos para o entendimento da imunopatogênese da bTB que poderiam ser empregados na implementação de estratégias racionais de controle da tuberculose bovina.<br. / Abstract : Rational discovery of novel immunodiagnostic and vaccine candidateantigens to control bovine tuberculosis (bTB) requires knowledge ofdisease immunopathogenesis. However, there remains a paucity ofinformation on the Mycobacterium bovis-host immune interactionsduring the natural infection. Analysis of 247 naturally tuberculinic testpositive (PPD) M. bovis-infected cattle revealed that 92% of theseanimals were found to display no clinical signs, but presenteddisseminated bTB-lesions positively correlated with both pathologyseverity score and viable tissue bacterial loads. Additionally, granulomaencapsulation negatively correlated with M. bovis growth as well aspathology severity, suggesting that encapsulation is an effectivemechanism to control bacterial proliferation during natural infection.Moreover, multinucleated giant cell numbers were found to negativelycorrelate with bacterial counts in lung granulomas. In contrast,neutrophil numbers in the granuloma were associated with increased M.bovis proliferation. To better understand the role of the granulomatousresponse for the control of mycobacterial growth during infection by M.bovis, immunopathological parameters during co-infection with naturalbovine leukemia virus (BLV), a pathogen that modulates the adaptiveimmune response, were analyzed. Cattle co-infected with M. bovis andBLV had higher mycobacterial intragranuloma load and more severedisease. In the histomorphological analysis of granulomatous lesions,we observed a significant decrease in the lymphocyte populationfollowed by an increase in neutrophils and a reduction in connectivetissue deposition. These data suggest an alteration in the cell flow for theintragranuloma environment due to defective lymphocytes. Consistentwith this hypothesis, we observed a lower delayed-type hypersensitivity(DTH) response in animals with persistent lymphocytosis (LP-BLV+).This evidence indicate that BLV infection is associated with a loss ofhomeostasis of the host cellular immune response and possiblyincreased susceptibility of the host to bTB. Together, our data integratethe host granulomatous response with the mycobacterial infectious loadand reveal new elements for understanding the immunopathogenesis ofbTB which can be used in the implementation of rational strategies tocontrol bovine tuberculosis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Enfermagem, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:15:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325149.pdf: 1246489 bytes, checksum: 9ed1f4b3767cb43a8696dfdb48f96ff9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Trata-se de uma pesquisa com abordagem qualitativa, do tipo exploratório-descritiva, com o objetivo de compreender as representações sociais das pessoas com tuberculose e dos profissionais de saúde sobre o abandono de tratamento, num Programa de Controle da Tuberculose, a partir do referencial teórico da teoria de representações sociais. Foi realizada em quatro Centros de Saúde, em Lima, Peru, com 20 sujeitos, dos quais 12 profissionais da saúde e 8 pessoas com tuberculose. A coleta de dados foi através de entrevistas semiestruturadas, realizadas de junho a novembro de 2012. A análise de dados orientou-se pela análise de conteúdo do tipo categorial temática. Os resultados originaram três manuscritos abordando: representações sociais dos profissionais da saúde sobre o abandono do tratamento, representações sociais das pessoas com tuberculose sobre o abandono do tratamento e as relações entre as representações desses dois atores. Nos resultados do primeiro manuscrito, constam três categorias relacionadas ao abandono de tratamento da tuberculose: "ser pobre dificulta a adesão ao tratamento", "abandono de tratamento da tuberculose é fracasso pela falta de informação e biossegurança", "os efeitos colaterais levam ao abandono do tratamento". A maneira de pensar, sentir e agir dos profissionais de saúde sobre o abandono de tratamento da tuberculose está relacionado às precárias condições socioeconômicas, com baixos níveis de educação e informação aos pacientes e dificuldade de controle dos efeitos adversos dos medicamentos. Dos resultados do segundo manuscrito emergiram quatro categorias: "tomar medicamentos é uma experiência ruim pelos seus efeitos colaterais", "o abandono de tratamento causa/leva à morte", "o abandono do tratamento dá-se pela falta de apoio social" que leva à construção da representação social de que "a doença e o tratamento trazem sofrimento". Nos resultados da relação entre as representações sociais dos profissionais da saúde e das pessoas com tuberculose sobre o abandono do tratamento, os conteúdos das representações sociais dos profissionais da saúde não apresentam relação direta com as representações das pessoas com tuberculose, diante de seus contextos de vida. Entretanto, ambos os grupos representaram que "o tratamento da tuberculose gera sofrimento", "a tuberculose é contagiosa e afasta as pessoas", sendo que a "falta de conhecimento gera abandono de tratamento". Essas diferenças nos conteúdos das representações entre atores podem dificultar os comportamentos de cuidado, contribuindo para o abandono do tratamento da tuberculose. Conclui-se que o conhecimento dessas representações sociais contribui para que os profissionais adotem modelos de cuidado e pesquisas de intervenções num enfoque psicossocial, com valoração do ser humano como ser que pensa, age e sente em relação com o meio ambiente. Ressalta-se, ainda, um maior aprofundamento e reflexão nas dimensões do construto da adesão, sendo primordial a relação de vínculo entre os profissionais e a pessoa com tuberculose nas ações de cuidado e de educação, favorecendo a terapêutica e sua eficácia, de maneira que se possa contribuir na adesão ao tratamento e na qualidade do cuidado dispensado às pessoas com tuberculose.<br> / Abstract : This is a qualitative research, exploratory and descriptive, in order to understand the social representations of people with tuberculosis, and health professionals on the treatment dropout in a Tuberculosis Control Program, from the theory of social representations. Was conducted in four health centers in Lima, Peru, with 20 subjects, 12 health professionals and 8 people with tuberculosis. Data collection was through semi-structured interviews, conducted from June to November 2012. The data analysis was guided by content analysis of categorical theme. The results led to three manuscripts addressing social representations of health professionals about the noncompliance treatment, social representations of people with tuberculosis on treatment dropout and the relationship between the representations of these two actors. The results of the first manuscript were three categories related to the abandonment of tuberculosis treatment: "to be poor hampers adherence to treatment", "abandonment of tuberculosis treatment is failure by the lack of information and biosafety", "side effects lead to abandonment of treatment. The way of thinking, feeling and acting of health professionals about the abandonment of treatment of tuberculosis is related to poor socioeconomic conditions, with low levels of education and information to people with TB and the difficulty to control the adverse effects of medications. The results of the second manuscript, four categories emerged: "taking drugs is a bad experience for its side effects", " the abandonment treatment causes / leads to death", "the abandonment of treatment is the lack of social support" that leads to the construction social representation that "the disease and treatment bring suffering." The results of the relationship between social representations of health professionals and people with tuberculosis on treatment dropout, the contents of social representations of health professionals have no direct relation to the representations of people with tuberculosis in their life contexts. However, both groups represented that "the treatment of tuberculosis originates suffering", "TB is contagious and isolates people", being the lack of knowledge generates treatment dropout. These differences in the contents of representations between actors may hinder the conduct of care, contributing to the abandonment of tuberculosis treatment. In conclusion the knowledge of these social representations helps the professionals to adopt models of care and research focus on psychosocial interventions,12with valuation of the human being who thinks, acts and feels in relation to the environment. We also emphasize a greater deepening and reflection the dimensions of the construct of adhesion and the primary bonding relationship between the professional and the person with TB actions in care and education, favoring the therapy and its effectiveness, so that they can contribute adherence to treatment and quality of care people with tuberculosis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-04-18T04:11:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344470.pdf: 4039587 bytes, checksum: ca5e269c5e05ad34c4515affe7133117 (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução: A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa considerada um problema global de saúde pública. A terapia em longo prazo, somada aos efeitos adversos dos medicamentos, contribui para a não adesão do paciente, o que resulta em falência do tratamento e seleção de linhagens de Mycobacterium tuberculosis resistentes. Por isso, a pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, que permitam a redução do tempo de tratamento e sejam uma alternativa para o tratamento de cepas resistentes, são considerados urgentes. Produtos naturais representam importantes fontes para o desenvolvimento de novos fármacos. A atividade antimicobacteriana já foi relatada para diversos compostos pertencentes a diferentes classes químicas, isolados de plantas, fungos e organismos marinhos, o que estimula a pesquisa de novos fármacos para o tratamento da TB provenientes de fontes naturais. Objetivos: Avaliar atividade antimicobacteriana in vitro de extratos e compostos naturais isolados de Calea uniflora e Calea pinnatifida e investigar seu mecanismo de ação. Métodos: Inicialmente, foi realizada uma triagem de 10 extratos e 11 compostos isolados obtidos das plantas Calea uniflora e Calea pinnatifida quanto à atividade antimicobacteriana in vitro frente a cepas referência de M. tuberculosis, Mycobacterium avium e Mycobacterium fortuitum, em concentrações entre 1,56 µg/mL e 100 µg/mL. Sete lactonas sesquiterpênicas (LS) apresentaram os melhores resultados e foram escolhidas para seguimento dos estudos da atividade antimicobacteriana in vitro, além da realização de análises in silico e estudo do seu mecanismo de ação, por meio da avaliação do perfil transcricional de M. tuberculosis após o tratamento com os compostos. Resultados: As LS (LS01 a LS07) apresentaram atividade antimicobacteriana frente a M. tuberculosis em fase exponencial de crescimento, de modo tempo e dose dependentes, com concentração inibitória mínima (MIC) variando de 6,25 µg/mL a 25 µg/mL. LS06 e LS07 também apresentaram atividade frente a M. tuberculosis em estado não-replicativo, em concentrações correspondentes a 4xMIC e 8xMIC, respectivamente. Nenhum dos compostos apresentou atividade frente a M. avium e M. fortuitum. Quando testados frente a isolados clínicos resistentes aos fármacos, os compostos apresentaram MIC semelhante às obtidas com os isolados sensíveis. Quando em combinação com isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), os compostos não apresentaram sinergismo nem antagonismo. Os índices de seletividade variaram entre 1,77 a 11,88 em células de linhagem pulmonar MRC5. LS01, L06 e LS07 também apresentaram atividade frente a bacilos intracelulares, em modelo de infecção de macrófagos e demonstraram capacidade de proteção às células infectadas em concentrações correspondentes à MIC. Já quando em concentrações superiores, apresentaram citotoxicidade. Quando testada em estrutura granuloma-like, LS01 foi capaz de reduzir a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) na concentração 100 µM. As predições in silico indicaram que as LS estudadas neste trabalho podem apresentam boa biodisponibilidade por via oral, entretanto, podem sofrer intenso metabolismo de primeira passagem e apresentar altas taxas de ligação a proteínas plasmáticas. A análise do perfil transcricional de M. tuberculosis após o tratamento com LS01, LS06 e LS07 sugere que sua resposta pode estar relacionada à geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que foi confirmado posteriormente, pela detecção de H2O2 em culturas de M. tuberculosis tratadas com os compostos. Este perfil também pode estar associado à habilidade das LS de se ligar aos resíduos de cisteína presentes em proteínas e no micotiol. Conclusão: Os compostos LS01-LS07 apresentaram boa atividade antimicobacteriana in vitro e parecem ter um novo mecanismo de ação quando comparadas aos fármacos utilizados atualmente no tratamento da TB e àqueles que se encontram em estudo clínico.<br> / Abstract : Background: Tuberculosis (TB) is a serious public health problem worldwide with one-third of the world´s population estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis. TB treatment requires the use of multiple drugs for at least 6 months. This lengthy drug therapy and adverse reactions to the drugs contribute to patient non-compliance, resulting in treatment failure and emergence of M. tuberculosis drug-resistant strains. There is an urgent need for new drugs to treat TB and natural products represent an important source for drug discovery. Several chemical classes of compounds isolated from plants, fungi and marine organisms have been described as potential antitubercular drugs, stimulating the search for new antimycobacterial agents isolated from natural sources. Aims: To evaluate the in vitro antimycobacterial activity of plant extracts and isolated plant-derived compounds from Calea uniflora and Calea pinnatifida and investigate their mode of action. Methods: A primary screening was conducted with 10 extracts from C. uniflora and C. pinnatifida and 12 purified compounds against M. tuberculosis, Mycobacterium avium and Mycobacterium fortuitum at concentrations ranging from 1.56 to 100 µg/mL. Seven sesquiterpene lactones (LS) showed the best results and were chosen for following studies on the in vitro antimycobacterial activity and also for in silico tests and transcriptional profiling analysis, in order to investigate their mode of action. Results: The LS (LS01-LS07) showed antimicrobial activity against log phase M. tuberculosis in a time- and concentration- dependent manner, with minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 6.25 to 25 µg/mL. LS06 and LS07 were also active against non-replicating M. tuberculosis at 4xMIC and 8xMIC, respectively. None of the compounds were active against M. avium and M. fortuitum. When tested against MDR M. tuberculosis clinical isolates, the compounds showed similar MIC compared to the sensitive isolates. They did not show synergism nor antagonism in combination with isoniazid or rifampicin. The selectivity index ranged from 1.77 to 11.88 in MRC5 lung cell line.LS01, LS06 and LS07 were also active against intracellular M. tuberculosis and were able to protect the infected cells at their MIC. Higher concentrations were found to be cytotoxic. When tested in a granuloma-like structure, LS01 reduced de colony forming units (CFU) counting at 100 µM. In silico studies indicate that these compounds may have good oral bioavailability, but intense first pass metabolism and high rates of plasma proteins binding. The transcriptional profiling analysis showed the response to LS01, LS06 and LS07 may be related to reactive oxygen species (ROS) generation, which was confirmed by the detection of H2O2 in M. tuberculosis cultures treated with the compounds. This response also may be related to the ability of the LS to bind to cysteine residues present in proteins and mycothiol. Conclusion: The LS 01-07 showed good in vitro antimycobacterial activity and seem to have a novel mode of action compared to the drugs currently used for the TB treatment and compared to the TB pipeline, which made them promising molecules for further studies.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-08. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:53Z : No. of bitstreams: 1 000844405_20151231.pdf: 590060 bytes, checksum: cc5b0a59d26777dd45d62d9077d94ade (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:36Z: 000844405_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:28Z : No. of bitstreams: 1 000844405.pdf: 5414366 bytes, checksum: b02494fdb2d981c078e2a3d145e297dd (MD5) / A tuberculose é considerada um problema prioritário de saúde pública. Há cada vez mais evidências de que, a variação das cepas de M. tuberculosis tem um papel importante no resultado da infecção por tuberculose. No presente estudo, além de descrever os aspectos sociodemográficos, clínico-epidemiológicos e bacteriológicos da tuberculose e relacionar com a distribuição de resistência aos fármacos antituberculose, também objetivou-se avaliar a diversidade dos genótipos de isolados de Mycobacterium tuberculosis utilizando as técnicas de Spoligotipyng (Spacer Oligonucleotide Typing) e MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-variable-number tandem repeats). Com relação à resistência aos fármacos, as culturas de MT e os testes de sensibilidade mostram que cepas de pessoas que fizeram tratamento de TB anterior ou infectados pelo HIV apresentaram mais resistência os fármacos quando comparados aos que não apresentavam essas características (p<0,05). Os casos resistentes, em sua maioria, são de origem pulmonar e apresentam baciloscopia positiva. A análise molecular mostrou que das 377 amostras com perfis completos para 14 loci MIRU-VNTR, os loci 10, 16, 23, 26, 27, 31, 39 e 40 tiveram um alto poder discriminatório (0.6), os loci 2, ETRB e Mtub21 foram moderadamente discriminatórios (0.3) e loci 4, 20 e 24, baixo poder discriminatório (0.3). Dos 250 isolados de M. tuberculosis analisados por spoligotyping, 92 diferentes padrões foram observados e diferentes famílias foram identificadas: Haarlem (H), Latin American and Mediterraneam (LAM), T Family, undesignated (U), S lineage e X Family. Significativa variabilidade genética foi observada nos isolados de M. tuberculosis circulantes na região Noroeste Paulista quando analisados por spoligotyping e MIRU-VNTR / Tuberculosis is considered a high priority public health problem. There is increasing evidence that the variation in Mycobacterium tuberculosis strains play an important role in the outcome of infections by tuberculosis. Apart from describing sociodemographic, clinical, epidemiological and bacteriological aspects of tuberculosis (TB) and correlating the distribution of resistance to antituberculosis drugs, one objective of this study was to evaluate the diversity of the genotypes of M. tuberculosis isolates using the Spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) and MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units variable-number tandem repeats) techniques. With respect to drug resistance, cultures of M. tuberculosis and susceptibility tests showed that strains from people previously submitted to TB treatment or infected with HIV have more resistance to drugs compared to those without these characteristics (p <0.05 ). Resistant cases are mostly pulmonary M. tuberculosis, and have positive smear test results. Molecular analysis showed that of the 377 samples, 14 MIRU-VNTR loci had complete profiles; the 10, 16, 23, 26, 27, 31, 39 and 40 loci had high discriminatory power (0.6) the 2, ETRB and Mtub21 loci were moderately discriminatory (0.3) and 4, 20 and 24 loci had low discriminatory power (0.3). Ninety-two different patterns were observed in the 250 M. tuberculosis isolates analyzed by spoligotyping and different families were identified as Haarlem (H), Latin American and Mediterranean (LAM), T Family, undesignated (U), S lineage and X Family. Significant genetic variability was observed in M. tuberculosis isolates circulating in the northwestern region of Sao Paulo State when analyzed by spoligotyping and MIRU-VNTR

Submitted by Leonardo Biancolino Marino null (leobmarino@hotmail.com) on 2016-03-24T13:21:31Z No. of bitstreams: 1 Tese Leonardo Biancolino Marino versão final.pdf: 7165900 bytes, checksum: b52d4eb1bb81181de6acee83becaa5f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-24T18:55:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marino_lb_dr_arafcf.pdf: 7165900 bytes, checksum: b52d4eb1bb81181de6acee83becaa5f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-24T18:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marino_lb_dr_arafcf.pdf: 7165900 bytes, checksum: b52d4eb1bb81181de6acee83becaa5f9 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tuberculose (TB), com principal agente etiológico o bacilo Mycobacterium tuberculosis, é uma doença infecciosa passível de cura. Entretanto, é detentora de uma estatística mundial preocupante, e em 2014 apresentou 9,5 milhões de novos casos e 1,5 milhão de mortes. Além dos altos índices estatísticos, a TB aparece ainda associada a dois fatores agravantes: a co-infecção com HIV (“Human Immunodeficiency Virus”) e a crescente emergência de linhagens resistentes aos quimioterápicos como “multi-drug resistant” (MDR) e “extensively drug resistant” (XDR), que dificultam sobremaneira o tratamento, indicando premência na pesquisa de novos fármacos. A resistência do bacilo manifesta-se a partir de eventos adquiridos (como aquisição de mutações cromossomais em genes específicos relacionados ao metabolismo de fármacos) ou intrínsecos, como uma parede celular altamente hidrofóbica (devido à grande quantidade de ácidos micólicos). Estes mecanismos de resistência são discutidos amplamente na literatura. Por outro lado, pouco se sabe a respeito da resistência devido as alterações na expressão dos genes das bombas de efluxo, responsáveis pela exclusão de fármacos, bem como dos mecanismos de resistência relacionados a halotolerância bacteriana. Neste sentido, três assuntos de relevância no combate à tuberculose foram abordados nesta tese. Como primeira frente, avaliou-se inicialmente a expressão de 5 genes codificadores de bombas de efluxo pela técnica de RT-qPCR em 12 isolados clínicos frente ao tratamento com rifampicina, principal fármaco do regime terapêutico da TB. Resultados indicaram que essas proteínas auxiliam na emergência da resistência, sendo indicados pela superexpressão dos genes frente ao tratamento. Como segunda frente avaliou-se a atividade de 15 compostos inéditos de furoxânicos e benzofuroxânicos quanto à capacidade inibitória frente ao M. tuberculosis, citotoxicidade em células VERO, além de ensaios para avaliar seus mecanismos de ação (acumulação de brometo de etídio / inibição de efluxo, liberação de óxido nítrico e microarray). Resultados indicaram que a classe de compostos é promissora para o tratamento, com boa atividade inibitória contra o bacilo e considerado grau de seletividade. Ensaios de mecanismo de ação, indicaram atividade independente da inibição do efluxo, da subunidade de isoniazida ou da liberação de óxido nítrico. Microarray apontou para alteração em grande quantidade de proteínas ribossomais, semelhante ao que ocorre com aminoglicosídeos. Por fim, na terceira frente do estudo avaliou-se os efeitos da halotolerância na emergência de bacilos resistentes a fármacos, tendo como base as diferentes concentrações de cloreto de sódio a que o bacilo é submetido durante o seu ciclo de vida. Os resultados apontaram para aumento da resistência bacteriana com consequente aumento nas concentrações inibitórias de vários fármacos usados para a terapia da TB, quando o bacilo é submetido à concentração de cloreto de sódio encontrada no interior dos macrófagos, indicando uma necessidade de reflexão sobre as novas diretrizes para testes de novos fármacos contra TB. / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis bacillus, presenting 9.5 million of new cases and 1.5 million of deaths in 2014. Two aggravating factors are associated with these high statistical indexes: a co-infection with HIV ("Human Immunodeficiency Virus") and the increasing emergence of resistant strains represented by MDR ("multi-drug resistant") and XDR ("extreme drug resistant") strains. The bacillus resistance manifests from acquired events (such as acquisition of chromosomal mutations in specific genes related to drug metabolism) or intrinsic, as a highly hydrophobic cell wall (due to the large amount of mycolic acids) and the action of efflux pumps (responsible for drug extrusion). Thus, the thesis project evaluated the expression of five genes encoding efflux pumps by RT-qPCR technique in 12 clinical isolates against rifampicin, the main anti-TB drug used in the standard treatment. Results indicated that these proteins contribute to the emergence of resistance, indicated by overexpression of these genes after treatment. The second part of the study evaluated the activity of 15 furoxan and benzofuroxan derivative compounds for inhibitory capacity against the M. tuberculosis, cytotoxicity in VERO cells, as well as ethidium bromide accumulation and efflux assays. Aiming evaluate their mechanism of action, microarray and assays of nitric oxide release were also done, as they are supposed nitric oxide donors and may present an action by oxidative stress and/or the activity efflux pumps inhibition. Results indicated that the class of compounds is promising for the treatment, with good inhibitory activity against bacillus and substantial degree of selectivity. Mechanism of action assays indicated activity independent of efflux inhibition, of isoniazid subunit’ or nitric oxide release. Microarray pointed to changes in expression of ribosomal proteins, similar to what occurs with aminoglycosides. Finally, the third part of the study demonstrated that the halotolerance developed by M. tuberculosis might cause the emergence of drug resistant bacilli, based on the different concentrations of sodium chloride that the bacillus faces during its cycle. The results indicate a need for reflection on the new guidelines for testing new TB drugs. The results pointed to an increase in the minimal inhibitory concentrations of various anti-TB drugs, when the bacillus was subjected to the sodium chloride concentration found in macrophages, indicating a need for reflection on the guidelines for discovery of new anti-TB drugs. / CNPq: 140079/2013-0 / FAPESP: 2011/21232-1 / CAPES PDSE: 99999.003125/2014-09

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-30Bitstream added on 2014-06-13T19:41:20Z : No. of bitstreams: 1 peresi_e_dr_botfm.pdf: 1052630 bytes, checksum: e59a57f6f635bf2f461011c84b7d7f71 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / It is estimated that one-third of the total world population is latently infected with M. tuberculosis and only 5-10% of the infected individuals will develop active TB disease during their life-time. The reason why some infected individuals develop active disease, while others do not is not yet entirely understood. Given the central role of TLR-2 in the incitement of inflammation, polymorphisms in its gene might be involved in both infectious and inflammatory diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of TLR2 - 16934A/T and GT repeat polymorphisms on the immune response of PTB patients undergoing anti-TB treatment at different time points of anti-tuberculosis treatment: T1 (beginning), T2 (3 months) and T3 (end). For this we genotyped TLR2 -16934 and (GT)n repeats polymorphisms and evaluated the immune response of pulmonary tuberculosis patients during the time of anti-tuberculosis treatment. The present study suggests that TLR2 - 16934A/T and GT repeats polymorphisms can influence differential TLR-2, NF-κB and cytokine levels during anti-TB treatment. We also suggest that PTB patients with TLR2 - 16934 AA genotype may have a worst outcome of the disease, since they have a lower IFN-γ, cytokine essential to initiate the protective immunity to active TB. This association could not be made in our study due to the low number of patients evaluated. Since TLR-2 play a major role in initiating immune response against M. tuberculosis other polymorphisms in TLR2 would be crucial to better understand protective immune responses and may serve as biomarkers of protection or susceptibility to TB

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-28Bitstream added on 2014-06-13T20:46:04Z : No. of bitstreams: 1 souza_ra_dr_araiq_parcial.pdf: 1768137 bytes, checksum: f8b664210ec3050e53bbcdfbcf5b9ca5 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:36Z: souza_ra_dr_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:04Z : No. of bitstreams: 1 000721600_20150715.pdf: 1677171 bytes, checksum: 819f8cea3f554e9f62a811ad1802980f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:10Z: 000721600_20150715.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:22Z : No. of bitstreams: 1 000721600.pdf: 7263737 bytes, checksum: f97c3d135597fd6a65fd091eed6bf858 (MD5) / Este trabalho trata da síntese e caracterização de compostos de Pd(II) contendo ligantes piridínicos, e de suas atividades biológicas contra: células tumorais LM3, bacilos da tuberculose (TB) humana e protozoários causadores da doença de Chagas (T. cruzi) e da leishmaniose cutânea (L. amazonensis). Segundo os dados de IV, todas as piridinas para-substituídas se coordenaram via N-piridínico e as propostas moleculares estão condizentes com as análises elementares. Os compostos trans-[PdX2(isn)2], X= Cl (2), N3 (3), NCO (4), SCN (5), Br (6) e I (7), e ISN= isonicotinamida, foram obtidos a partir do trans-[PdCl2(CH3CN)2] (1), mediante reações de substituição de ligantes; 2-5 foram investigados por TG-DTA, sendo que 2, 3 e 5 apresentaram um perfil de degradação térmica gerando como resíduos Pd/PdO, já o 4 gerou Pd. A estabilidade térmica deles foi: 2 > 4 > 5 > 3. Experimentos de RMN 2D em solução indicaram para 6 também a ISN livre e uma espécie contendo Pd–dmso. Nos compostos [Pd2(N3)4(-teda)(isn)2]∙H2O (8), [Pd2(SCN)4(-teda)(isn)2] (9), [Pd2(N3)4(-bipy)(isn)2]∙H2O (10) e [Pd2(SCN)4(-bipy)(isn)2] (11), TEDA= trietilenodiamina e BIPY= 4,4’-bipiridina, derivados de 1, a coordenação dos pseudo-haletos foi terminal (N3 via N e SCN via S). Segundo as curvas TG-DTA para 9 e 11, resultaram como resíduos Pd (9) e Pd/PdO (11), sendo 9 > 11 em termos de estabilidade térmica. Os compostos [Pd(dmba)X(isn)], X= Cl (15), N3 (16), NCO (17), e DMBA= N,N-dimetilbenzilamina, foram obtidos de [Pd(dmba)(-Cl)]2 (12), [Pd(dmba)(-N3)]2·H2O (13) e [Pd(dmba)(-NCO)]2 (14), respectivamente. Dados de RMN em solução apontaram a integridade de 15, mas para 16 e 17 notou-se também a ISN livre e os respectivos precursores diméricos. Os compostos trans-[PdCl2L2], L= 4-cianopiridina, 4CNPY... / This work deals with the synthesis and characterization of Pd(II) compounds containing pyridine ligands, and their biological activities against: LM3 tumor cells, bacilli of human tuberculosis (TB) and protozoan causing Chagas’ disease (T. cruzi) and cutaneous leishmaniasis (L. amazonensis). According to IR data all para-substituted pyridines are coordinated via N-pyridine and molecular formulae are consistent with the elemental analyses data. The compounds trans-[PdX2(isn)2], X= Cl (2), N3 (3), NCO (4), SCN (5), Br (6), I (7), and ISN= isonicotinamide, were obtained from trans-[PdCl2(CH3CN)2] (1) through ligand replacement reactions. Compounds 2-5 were investigated by TG-DTA, with 2, 3 and 5 showing the same thermal degradation profile, generating Pd/PdO as final residues, while 4 generated Pd as final residue. The thermal stability order of these series was: 2 > 4 > 5 > 3. From 2D NMR experiments in solution for 6 it was also noted ISN free and a species containing DMSO coordinated to Pd(II). For compounds [Pd2(N3)4(-teda)(isn)2]∙H2O (8), [Pd2(SCN)4(-teda)(isn)2] (9), [Pd2(N3)4(-bipy)(isn)2]∙H2O (10) and [Pd2(SCN)4(-bipy)(isn)2] (11), TEDA= triethylenediamine and BIPY= 4,4’-bipyridine, the coordination of pseudohalides was terminal (N3 by N and SCN by the S atom). According to the TG-DTA curves of 9 and 11, Pd (9) and Pd/PdO (11) were obtained as final residues, and 9 > 11 in terms of thermal stability. Compounds [Pd(dmba)X(isn)], X= Cl, (15), N3 (16), NCO (17), and DMBA= N,N-dimethylbenzylamine, were obtained from [Pd(dmba)(-Cl)]2 (12), [Pd(dmba)(-N3)]2∙H2O (13) and [Pd(dmba)(-NCO)]2 (14), respectively. NMR data in solution indicated the integrity of 15, but for 16 and 17 it was also noted ISN free, and their dimeric precursors. The compounds... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-06Bitstream added on 2014-11-10T11:57:26Z : No. of bitstreams: 1 000779449_20150106.pdf: 956149 bytes, checksum: c893e21c17da578d54f227f0f3a50bb4 (MD5) / Apesar de não ser um elemento biológico essencial, a prata metálica e seus derivados (ex. AgNO3 e complexos) têm apresentado várias aplicações medicinais como na purificação da água, tratamento de ferimentos, recobrimentos anti-infecção de instrumentos médicos, no tratamento de queimaduras pois possuem propriedades anti-microbianas potentes com baixa toxicidade em seres humanos. Sua utilização como agente antimicrobiano nos remete ao inicio da história humana, sendo muito utilizada na preservação de água potável durante anos, recurso primordial em conflitos militares. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados novos complexos de prata(I) do tipo Ag(NN)(tu)X, onde NN = 2,2'-bipiridina (bpy), 1,10-fenantrolina (phen), dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina (dppz) e 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phd); tu = tiouréia e X = NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - e SO4 2-. Os complexos foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia na região do IV, ressonância magnética nuclear (1H), análise elementar e espectrometria de massas. As estruturas moleculares dos complexos [{Ag(bpy)(μ-tu)}2](NO3)2 (A1) e [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) foram determinadas por difração de raios-X de monocristal, indicando um sistema binuclear com os centros de prata(I) conectados em ponte pelo atomo de enxofre da molécula de tiouréia. A atividade biológica in vitro dos compostos [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) foram estudadas frente a fungos (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bactérias (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis e formas amastigota e promastigota da L. amazonensis. Mesmo sendo um estudo bastante reduzido, tendo em vista a quantidade de microorganismos e de compostos estudados, foi possível averiguar algumas varições no comportamente biológico com a alteração tanto do ligante quelante NN quanto do contra-íon. Com resultados promissores, os estudos de... / Even Ag0, and its derivates, being not an essential element, they have presented medicinal applications such as water purification, injuries treatment, antiinfection recovery of medical instruments, burn treatment as they have powerful antimicrobial properties and low human toxicity. Silver compounds have been used as antimicrobial agent since the beginning of human history when it was added to potable water for preservation as a primary resource in military conflicts. In the present work novel silver complexes (I) of Ag(NN)(tu)X type in which X = 2,2-bipiridine (bpy), 1,10-phenantroline (phen), dipirido[3,2-a:2’,3’-c]phenazine (dppz) and 1,10- phenantroline-5,6-dione (phd); tu= thiourea and X=NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - and SO4 2- have been synthesized and characterized. The complexes had been characterised by infrared spectroscopy, 1H nuclear magnetic resonance, elementary analysis and mass spectroscopy techniques. The crystal structures of [{Ag(bpy)(μ- tu)}2](NO3)2 (A1) and [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) were determined by single crystal X-ray diffraction indicating a binuclear system with silver(I) centers bridgebonded by sulphur atoms of thiourea molecule. The in vitro biological activity of [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) compounds had been studied for fungi (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bacteria (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis and amastigote and promastigote forms of L. amazonensis. Although a reduced study has been performed in view of the microorganisms and compounds quantities it was possible to evaluate some changes on biological behavior by both chelant ligand NN and counterion modification. Promising results were obtained on the antileishmanial activity for B2 compound which have showed a selectivity index (SI) of 13,8-15,5 values much higher than the observed for AmpB, the standard drug (5,5-5,83).