Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gestação que se caracteriza por um estado de má adaptação da tolerância imunológica, identificado por estresse oxidativo e ativação anormal do sistema imune inato. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) tais como ácido úrico, que parecem contribuir para a patogênese dessa doença. As DAMPs podem ativar monócitos desviando-os para perfil proinflamatório M1. O desbalanço pró e anti-inflamatório na PE pode ser regulado através da administração de flavonóides com propriedades anti-inflamatórias como a silibinina. O presente trabalho tem por objetivo avaliar o efeito imunomodulador da silibinina sobre a expressão de marcadores de ativação e a via de sinalização do fator de transcrição nuclear NF-κB em monócitos de gestantes portadoras de PE. Monócitos de gestantes pré-eclâmpticas foram cultivados na presença ou ausência de silibinina e, a expressão de moléculas de superfície TLR4, CD64, CD163 e CD14, bem como dos fatores de transcrição IκB-α e NF-κBp65 intracelulares foi analisada por citometria de fluxo. A concentração das citocinas IL-6 e IL-8 no sobrenadante de cultura de monócitos foi determinada por cytometric bead array (CBA) e de IL-1β, IL-10, TNF-α, IL-12p70, IL-23 e TGF-β pela técnica de ELISA. Os resultados foram analisados por meio de testes paramétricos com nível de si... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

Em condições inflamatórias do sistema vascular, altas concentrações de mieloperoxidase somada à presença do ácido úrico, sugerem a formação local do oxidante hidroperóxido de urato. A ação desse peróxido já foi demonstrada sobre glutationa e peroxirredoxinas, tornando plausível a possibilidade de que outras proteínas tiólicas também pudessem ser alvo de oxidação. A proteína dissulfeto isomerase é uma ditiol-dissulfeto oxidoredutase e chaperona, localizada principalmente no retículo endoplasmático, onde participa do enovelamento de proteínas nascentes. Além disso, um pool dessas enzimas foi identificado na superfície da célula e no meio extracelular (secretada) e parece ser especialmente importante em eventos vasculares como ativação e agregação de plaquetas, trombose e remodelamento vascular. Primeiramente, foi investigado se o hidroperóxido de urato era capaz de oxidar a PDI. Pelo ensaio do DTNB foi verificado que os tióis livres da proteína eram consumidos após reação com o peróxido e, em seguida, por nLC-MS/MS os resíduos de cisteínas dos sítios catalíticos foram identificados como os principais alvos de oxidação. Embora não tenham sido verificadas outras modificações além de dissulfetos, foi observado que o tratamento com hidroperóxido promoveu agregação e inativação da proteína. Os estudos subsequentes envolveram uma linhagem de células endoteliais (HUVECs). Análises preliminares de citotoxicidade (detecção da atividade da enzima lactato desidrogenase no sobrenadante e incorporação de sondas fluorescentes ao DNA) mostraram que tratamentos com concentrações de até 400 µM de hidroperóxido de urato não são letais às células em cultura. Usando alquilantes impermeáveis à membrana celular foi mostrado que o hidroperóxido de urato oxida não só a proteína dissulfeto isomerase, mas também proteínas tiólicas totais expressas na superfície das HUVECs. Experimentos de wound healing foram feitos para avaliação da capacidade de migração das células mediante o tratamento com hidroperóxido de urato, mas nenhuma diferença foi observada. Contudo, a incubação das células com os agentes oxidantes hidroperóxido de urato e diamida, inibidores de PDI e integrina e um alquilante de tiol, resultaram, pelo menos nos trinta primeiros minutos, em menor capacidade de adesão das células à fibronectina. Além disso, as células tratadas com hidroperóxido de urato se tornaram mais sensíveis ao destacamento da placa de cultura e apresentaram alteração na morfologia. O tratamento com o peróxido também afetou a homeostase redox das HUVECs, observado pela diminuição da razão GSH/GSSG. Finalmente foram apresentadas evidênciasindiretas de que o ácido úrico é substrato da peroxidasina, uma heme peroxidase abundantemente expressa no sistema vascular. Primeiro, pelo ensaio do Amplex Red foi observado que a presença de ácido úrico na mistura reacional resultou em menor taxa de oxidação do reagente. Depois, por LC-MS/MS, também em amostra na qual o ácido úrico estava presente, foi identificado o hidroxiisourato, álcool resultante da decomposição do hidroperóxido de urato. Todo o conjunto de dados deverá contribuir para o maior entendimento da participação do hidroperóxido de urato em processos oxidativos vasculares − especialmente a oxidação de proteínas − que pode ser um dos mecanismos responsáveis pela alteração da função endotelial e da homeostase vascular. / During vascular inflammatory conditions, high amounts of myeloperoxidase added to the presence of uric acid, suggest the local formation of urate hydroperoxide. Its oxidative action has already been demonstrated on glutathione and peroxiredoxins, making plausible the possibility that other thiol proteins could also be a target for oxidation. The protein disulfide isomerase is a dithiol-disulfide oxidoreductase and chaperone, located mainly in the endoplasmic reticulum, where it is involved in the correct folding of nascent proteins. Also, a pool of these enzymes has been identified in cell surface and the extracellular (secreted) milieu and appears to be important in vascular events, such as platelet activation and aggregation, thrombosis and vascular remodeling. First, it was investigated whether urate hydroperoxide was capable of oxidizing PDI. By the DTNB assay, it was found that the free thiols of the protein were consumed after reaction with the peroxide and then, by nLC-MS / MS, the active redox cysteine residues were identified as the main oxidation targets. Although no modifications other than disulfides have been found, hydroperoxide treatment has been shown to promote protein aggregation and inactivation. Subsequent studies involved an endothelial cell line (HUVECs). Preliminary cytotoxicity analyzes (detection of lactate dehydrogenase enzyme activity in the supernatant and incorporation of fluorescent probes into DNA) have shown that treatments with concentrations up to 400 µM are not lethal to cells in culture. Then, using alkylating agents impermeable to the cell membrane, urate hydroperoxide was shown to oxidize not only PDI but also total thiol proteins expressed on HUVECs surface. Wound healing experiments were performed to evaluate cell migration after treatment with urate hydroperoxide, but no difference was observed. However, incubation of the cells with the oxidizing agents urate hydroperoxide and diamide, inhibitors of both PDI and integrin and a thiol alkylator, resulted, at least for the first thirty minutes, in reduced cell adhesion to fibronectin. In addition, cells treated with urate hydroperoxide became more sensitive to detachment from the culture dish and exhibited alterations in morphology. Treatment with the peroxide also affected the redox homeostasis of the HUVECs, observed by a decrease in the GSH / GSSG ratio. Finally, indirect evidence was presented that uric acid is a substrate of peroxidasin, a heme peroxidase abundantly expressed in the vascular system. First, with the Amplex Red assay it was observed that the presence of uric acid in the reaction mixture resulted in lower oxidation rates of the reagent. Then, by LC-MS / MS, hydroxyisourate, which is the alcohol derived from urate hydroperoxide decomposition, was also identified in samples containing uric acid. Taken together, the data presented should contribute to a better understanding of the involvement of urate hydroperoxide in vascular oxidative processes − especially protein oxidation − that may be one mechanism associated to disturbances in endothelial function and vascular homeostasis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Gout, or gouty arthritis, has been associated of a range of comorbidities as hypertension and kidney diseases. Some studies have indicated that certain antihypertensive drugs, such as angiotensin I-converting enzyme inhibitors (ACEi), increase the risk of gout. Notably, ACEi block the metabolism of several peptides, in particular bradykinin hydrolysis. Bradykinin is also a substrate for kininase I, which forms des-Arg-kinin B1R agonists. Therefore, ACE inhibition can activate the B1R pathway. Moreover, ACEi are allosteric enhancers of kinin receptors and B1R are linked to inflammatory cardiovascular diseases. However, despite the body of evidence demonstrating a clear contribution of the kinin system to the pathogenesis of some arthritic conditions, the role of the kinin B1 receptor in monosodium urate (MSU) crystals crystal-induced gout is currently unknown, especially in respect to ACEi. Thus, the aim of the present study was to verify the role of the bradykinin B1 receptors and the effect of ACEi on acute gout induced by MSU crystals in rodents. Painful (overt pain and allodynia) and inflammatory parameters (joint edema, leukocyte trafficking, interleukin-1β levels) of acute gout attacks were assessed several hours after intra-articular (IA) injection of MSU (1.25 or 0.5 mg/articulation) in the ankle of rats or mice, respectively. The role of B1R was investigated by pharmacological antagonism or gene deletion. In addition, B1R immunoreactivity on ankle tissue and sensory neurons, kininase I activity and des-Arg9-bradykinin synovial levels were also measured. Similar tools were used to investigate the effects of ACEi on low dose of MSU (0.0125 mg/articulation)-induced inflammation. Bouth, bradykinin B1R antagonism or gene deletion largely reduced all painful and inflammatory signs of gout. Furthermore, MSU increased not only the B1R expression in articular tissues, but also the content of the B1 agonist des-Arg9-bradykinin and the activity of the B1 agonist-forming enzyme kininase I. Finally, low dose of MSU crystals (which did not induced inflammation in control animals) was capable of causing signs of acute gout attacks in ACEi-treated animals, which was B1R-dependent. Concluding, bradykinin B1R activation contributes to acute gouty attacks, including the ones facilitated by ACEi. Thus, B1R is a potential therapeutic target for treatment and prophylaxis of gout, especially in patients taking ACEi. / A gota, ou artrite gotosa, está associada à ocorrência de diversas comorbidades como doenças renais e cardiovasculares. Alguns dos fármacos utilizados para o tratamento destas comorbidades podem ainda precipitar ataques agudos de gota. Um exemplo são os inibidores da enzima cininase II ou enzima conversora de angiotensina (iECA). Muitos dos efeitos cardioprotetores dos iECA são mediados pelos receptores B1 para cininas. Além disso, a inibição da ECA é capaz de bloquear a hidrólise da bradicinina, que por sua vez é também um substrato para a formação do agonista do receptor B1, des-Arg9-bradicinina, pela ação da enzima cininase I. Apesar dos estudos demonstrando o envolvimento do sistema das cininas na gota e do papel do receptor B1 na iniciação e manutenção da inflamação, não se conhece a relação do receptor B1 com a gota, especialmente durante a inibição da ECA. Assim, o presente estudo tem por objetivo verificar o papel do receptor B1 para cininas durante o ataque agudo de gota induzido por cristais de urato monossódico (MSU) em roedores, incluindo aqueles tratados com iECA. Para isso, a dor (alodínia ao toque e comportamento doloroso espontâneo) e alguns parâmetros inflamatórios (edema articular, concentração de proteínas, infiltração leucocitária, avaliação da cinética de leucócitos e níveis de interleucina-1β) causados pelo ataque agudo de gota foram avaliados em diferentes tempos após a injeção intra-articular (IA) de uma alta dose de MSU no tornozelo de roedores. O papel do receptor B1 foi investigado através de seu antagonismo farmacológico, pela utilização de roedores com deleção gênica do receptor e pela inibição da enzima cininase I. Ainda, a expressão do receptor B1 no tecido do tornozelo e neurônios sensoriais, atividade da enzima cininase I e os níveis de des-Arg9-bradicinina foram analisados no fluido sinovial dos roedores submetidos ao modelo de gota. Ferramentas semelhantes foram utilizadas para a investigação do envolvimento dos receptores B1 na inflamação causadas pela inibição da ECA em animais submetidos a injeção IA de uma baixa dose de MSU, que não apresentava efeito per se. Tanto o uso de antagonistas do receptor B1, como sua deleção gênica, foram capazes de reduzir a inflamação neste modelo de gota. Além disso, o MSU causou um aumento na expressão de receptores B1 na articulação, e também um aumento dos níveis do agonista B1, des-Arg9-bradicinina e da atividade da enzima cininase I. Por último, a baixa dose de MSU foi capaz de causar um ataque agudo de gota em animais pré-tratados com iECA, por um mecanismo que envolve a ativação de receptores B1. Concluímos que a ativação do receptor B1 contribui para o desenvolvimento do ataque agudo de gota, incluindo aqueles que são precipitados pelo tratamento com iECA. Assim, o B1 apresenta um potencial terapêutico para o tratamento e profilaxia da gota, especialmente em indivíduos que fazem uso de iECA.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

Disponibiliza??o do trabalho em conte?do parcial, conforme Termo de Autoriza??o. / Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2017-03-27T19:34:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) fernanda_souza_paula_parcial.pdf: 515579 bytes, checksum: f72e2289acf5068c063e2bd00f0fefc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-04-24T16:35:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) fernanda_souza_paula_parcial.pdf: 515579 bytes, checksum: f72e2289acf5068c063e2bd00f0fefc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T16:35:34Z (GMT). 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O poli(4-AMS) obtido por VC e CA mostrou dois pares redox, os quais est?o relacionados a eletroatividade do filme polim?rico, na regi?o de potencial de +0,50/+0,40 V. Contudo, maiores valores de Ipa e Ipc foram obtidos para os eletrodos modificados por VC, sugerindo que estes filmes s?o mais eletroativos. A deposi??o do azul da Pr?ssia (AP), mediador da rea??o de per?xido, foi investigada sobre os EG, com posterior modifica??o com poli(4-AMS). Notou-se que a presen?a do AP n?o altera o perfil voltam?trico da eletropolimeriza??o do 4-AMS. Contudo, quando comparada com a eletropolimeriza??o somente nos EG, obteve-se filmes mais resistivos e com menor eletroatividade. Analisando as propriedades eletroqu?micas e morfol?gicas, por VC conseguiuse filmes mais uniformes, com maior quantidade de material depositado e maior eletroatividade. A eletropolimeriza??o foi realizada tamb?m sobre eletrodos impressos de grafite contendo azul da Pr?ssia (EI/AP), onde posteriormente imobilizou-se 5 U da UOx, e o biossensor foi acoplado a uma c?lula de fluxo num sistema de an?lise por inje??o em fluxo (FIA) de linha ?nica. A vaz?o e o volume da al?a de amostragem foram otimizados em 2,10 mL/min e 200 ?L, repectivamente. O valor de pH da solu??o do analito foi otimizado em 8,27. Medidas de reprodutibilidade mostraram desvio padr?o de 2,15% (n=10). O biossensor respondeu linearmente para AU na faixa de 1,0 x 10-5 a 2,0 x 10-4 M, com limite de detec??o de 3,0 ?M. Amostras de urina foram dilu?das (1:10) e injetadas diretamente no biossensor. A reposta foi reprodut?vel mostrando baixo desvio padr?o para as medidas, e valores encontrados dentro da faixa esperada para o analito em amostras de urina. Testes de adi??o e recupera??o mostraram valores de 97,35% (?2,43). O biossensor mostrou-se bastante promissor para a proposta do trabalho, apresentando resultados muito satisfat?rios para as an?lises e par?metros investigados. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / This work investigates the use of electrochemical platforms containing polymeric films derived from 4-aminosalicylic acid (4-ASA) modified with the enzyme Urate oxidase (UOx) for quantification of uric acid (UA) in urine samples. The electrodeposition of 4-ASA was investigated through Cyclic Voltammetry (CV) and Chronoamperometry (CA) on graphite electrodes (GE). 100 cycles were performed in the range of -0.25 to 1.25 V at 50 mV/s in 2.50 mM monomer solution prepared in 0.50 M H2SO4. Using CA, the deposition was performed at a potential of +0.928 V for 5600 s in the same CV reaction medium. The poly(4-ASA) showed two redox pairs related to the electroactivity of the polymeric film in the potential range of + 0.50 /+ 0.40 V. However, higher values of Ipa and Ipc were obtained for the electrodes modified through CV, suggesting that these films are more electroactive. The deposition of Prussian blue (PB), mediator of the peroxide reaction, was investigated on the GE with subsequent modification with poly (4-ASA). It was observed that the presence of PB does not alter the voltammetric profile of 4-ASA electropolymerization. However, when compared with the electropolymerization in bare GE, more resistive films were obtained with lower electroactivity. Analyzing the electrochemical and morphological properties through CV, more uniform films were obtained, with more material deposited and greater electroactivity. The electropolymerization of poly(4-ASA) was also conducted on screen printed electrodes containing Prussian Blue (SPE/PB), with subsequent immobilization of 5U of Uox. This biosensor was coupled to a flow cell in a Flow Injection Analysis (FIA) system of single line. The flow rate and the sampling loop volume were optimized at 2.10 mL/min and 200 ?L, respectively. The pH value of the analyte solution was optimized at 8.27. Reproducibility measures showed a standard deviation of 2.15% (n = 10). The biosensor responded linearly to UA in the range of 1.0 x 10-5 to 2.0 x 10-4 M, with a detection limit of 3.0 ?M. Urine samples were diluted (1:10) and directly injected over the biosensor. The response was reproducible with low standard deviation and values found within the range expected for the analyte in urine samples. Addition and recovery tests showed values of 97.35% (?2.43). The biosensor is very promising for the work proposal, presenting very satisfactory results for the analyzes and investigated parameters.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Gout attack is characterized severe joint pain and inflammation with concomitant accumulation of monosodium urate (MSU) crystals. However, gout and the mechanisms responsible for the acute attacks are poorly understood, leading to improper treatment of the patient and reducing the quality of life. Polyamines (putrescine, spermidine and spermine) are involved in inflammatory nociceptive processes and have not been investigated to date. Therefore, the aim of the present study was to investigate the involvement of polyamines in the development of acute gout attack. Arthritis score, a compound measure of joint compromise that considers edema formation, erythema and paw position, mechanical hyperalgesia and inflammatory parameters were measured in an acute gout attack model in male mice induced by intra-articular (i.a.) injection of MSU, H2O2, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), L-ornithine or polyamines (putrescine, spermidine, spermine). All these algogenic agents increased arthritis score in a dose-dependent manner with ED50 of 0.73 (0.4-1.1) mg/site for MSU, 2.3 (1.5-3.5) μmol/site for H2O2, 3.5 (2.1-5.6) nmol/site for PMA, 0.6 (0.3-1.1) μmol/site for L-ornithine, 0.8 (0.4-1.7) μmol/site for putrescine, 3.6 (2.6-5.1) μmol/site for spermidine and 0.1 (0.06-0.2) μmol/site for spermine. All tested algogenic agents caused joint edema and nociception, except putrescine, which increased only arthritis score. α-Difluoromethylornithine (DFMO; ornithine decarboxylase ODC - inhibitor, i.a.) prevented MSU-, H2O2-, PMA-, L-ornithine-induced nociception, but not edema. On the other hand, DFMO did not prevent spermine-induced edema and nociception. DFMO prevented MSU-induced increase of ODC activity. Our results indicate that polyamines contribute to acute gout attacks, suggesting that inhibitors of polyamine synthesis may be potential therapeutic agents for the treatment and prophylaxis of gout. / O ataque agudo de gota é caracterizado por dor intensa e inflamação combinados com o acúmulo de cristais de urato monossódico (MSU). No entanto, a gota e os mecanismos responsáveis pelos ataques agudos ainda estão mal compreendidos, levando ao tratamento inadequado dos pacientes e reduzindo a qualidade de vida. As poliaminas (putrescina, espermidina e espermina) estão envolvidas em processos nociceptivos inflamatórios, e não foram investigadas até o momento, por conseguinte, o objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento das poliaminas no desenvolvimento do ataque de gota aguda em camundongos. Para isso, o escore de artrite (conjunto de somatórios de medidas que considera a formação de edema, eritema e posição da pata tratada do animal), hiperalgesia mecânica e parâmetros inflamatórios foram medidos em um modelo de ataque agudo de gota em camundongos machos, induzidos por uma injeção intra-articular de (i.a.) MSU, H2O2, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), L-ornitina ou poliaminas (putrescina, espermidina, espermina). Todos os agentes algogênicos aumentaram o escore de artrite de um modo dose dependente com um DE50 de 0,73 (0,4-1,1) mg/sitio de MSU, 2,3 (1,5-3,5) μmol/sitio de H2O2, 3,5 (2,1-5,6) nmol/sitio para PMA, 0,6 (0,3-1,1) μmol/sitio para a L-ornitina, 0,8 (0,4-1,7) μmol/sitio para a putrescina, 3,6 (2,6-5,1) μmol/sitio para a espermidina e 0,1 (0,06-0,2) μmol/sitio para espermina. Todos os agentes algogênicos testados causaram edema articular e nocicepção, exceto a putrescina, que aumentou apenas o escore de artrite. α-Difluorometilornitina (DFMO; inibidor da ornitina descarboxilase - ODC) preveniu a nocicepção induzida por: MSU, H2O2, PMA, L-ornitina, mas não o edema. Por outro lado, DFMO não preveniu a nocicepção e o edema induzido por espermina. DFMO preveniu o aumento da atividade da ODC induzido por MSU. Os nossos resultados indicam que as poliaminas estão envolvidas no ataque agudo de gota, sugerindo que os inibidores da síntese de poliaminas podem ser potenciais agentes terapêuticos para o tratamento e profilaxia da gota.