As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Carolina Campos (carolinacamposmaia@gmail.com) on 2009-11-16T20:11:21Z No. of bitstreams: 1 Sonia Maria Fernandes Batista.pdf: 1440584 bytes, checksum: 0c26d552e08a929f223d5d90ae31c621 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2009-11-25T16:18:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Sonia Maria Fernandes Batista.pdf: 1440584 bytes, checksum: 0c26d552e08a929f223d5d90ae31c621 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-25T16:18:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sonia Maria Fernandes Batista.pdf: 1440584 bytes, checksum: 0c26d552e08a929f223d5d90ae31c621 (MD5) Previous issue date: 2006 / A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) representa um risco ocupacional para os profissionais da área de saúde. Este estudo teve como objetivo determinar a soropositividade para o VHB, o índice de vacinação e o de resposta vacinal em cirurgiões-dentistas de Campo Grande (MS). Foram analisadas 474 amostras de sangue, visando à detecção dos marcadores sorológicos: HBsAg, anti-HBs e anti-HBc total. Nas amostras positivas para HBsAg foram pesquisados também os marcadores anti-HBc IgM, HBeAg e Anti-HBe. A metodologia utilizada foi o ensaio imunoenzimático usando-se kit comercial. A análise da soropositividade ao vírus da hepatite B mostrou que 51 (10,8%) profissionais já foram infectados, sendo que três (0,6%) deles foram positivos para os marcadores HBsAg/anti-HBc total/anti-HBe, cinco (1,1%) para o antiHBc total isolado e 43 (9,1%) para o anti-HBc total/anti-HBs. Pela metodologia da reação em cadeia pela polimerase, o DNA viral foi detectado em nove (17,6%) das 51 amostras positivas para o VHB. O índice de vacinação dentre os profissionais estudados foi de 96,6%, embora somente 73,1% desses tenham completado as três doses preconizadas. Excluindo-se 46 indivíduos soropositivos ao VHB dos 458 que relataram vacinação, 412 foram incluídos na análise do índice de resposta imune à vacina. Foi observado que 307 (74,5%) eram positivos para o anti-HBs, sendo que, para os profissionais com esquema vacinal completo, esse índice aumentou para 79,1%. Os resultados do presente estudo mostraram um alto índice de vacinação e um bom índice de resposta vacinal. Entretanto, a ocorrência do VHB nesse grupo populacional e o fato de muitos profissionais não completarem o esquema de três doses demonstram a necessidade de programas de educação continuada e de estratégias mais efetivas para a conscientização sobre as formas de controle e de prevenção da infecção. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Hepatitis B virus infection represents an occupational hazard for health care workers. This study investigated the seropositivity for hepatitis B virus (HBV), the vaccination index, and the vaccine response index in dentists from Campo Grande (MS). Blood samples from 474 dentists were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay to detect the serological markers: HBsAg, anti-HBs, and anti-HBc. The HBsAg positive samples were tested for anti-HBc IgM, HBeAg, and anti-HBe. A total of 51 (10.8%) dentists showed seropositivity for HBV. Three (0.6%) were HBsAg/anti-HBc/anti-HBe positive, 43 (9.1%) were anti-HBc/anti-HBs positive, and five (1.1%) were only anti-HBc positive. Viral DNA was detected by polymerase chain reaction in nine (17.6%) out of 51 HBV seropositive samples. A vaccination index of 96.6% was observed, although 73.1% completed the three-dose schedule. Excluding 46 HBV seropositive individuals from 458 who reported vaccination, 412 were analyzed for vaccine response index. It was observed that 74.5% were anti-HBs positive; this percentage increased to 79.1% when three doses were administrated. The results showed a high vaccination index and a good rate of vaccine response; however, the occurrence of HBV infection and the failure in completing the three-dose schedule demonstrate the need for continual education programs and for more effective prevention strategies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade UnB Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-01-10T14:05:16Z No. of bitstreams: 1 2013_IndianaraMariaGrando.pdf: 23698328 bytes, checksum: 0ea3a3745510011939ef435189024e7e (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2014-01-23T14:27:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IndianaraMariaGrando.pdf: 23698328 bytes, checksum: 0ea3a3745510011939ef435189024e7e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-23T14:27:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IndianaraMariaGrando.pdf: 23698328 bytes, checksum: 0ea3a3745510011939ef435189024e7e (MD5) / As doenças causadas por Streptococcus pneumoniae, incluindo pneumonia, meningite e sepse, são importantes contribuintes para a mortalidade infantil. O desenvolvimento de vacinas eficazes contra a doença pneumocócica demonstra a sua importância como a principal causa de mortes infantis evitáveis por vacina. Entre a doença pneumocócica, meningite é a síndrome clínica com as maiores taxas de letalidade e mortalidade, especialmente entre crianças. Entre as etiologias da meningite bacteriana, a doença pneumocócica tem a maior taxa de sequela grave e morte. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) sobre as taxas de morbidade e mortalidade devido à meningite pneumocócica entre crianças brasileiras com idade ≤ 2 anos de 2007-2012. Trata-se de um estudo exploratório descritivo dos casos confirmados de meningite pneumocócica notificados ao Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN). Para a análise estatística, foram definidos os períodos pré-vacinação (2007-2009) e pós-vacinal (2011-2012), com exceção de 2010 como o ano da introdução da vacina. Para avaliar o impacto da PCV10, foram comparadas as taxas de incidência e mortalidade durante os períodos pré e pós - PCV10. Foram identificados 1.580 casos de meningite pneumocócica e 430 óbitos em crianças ≤ 2 anos, durante o período de estudo. A incidência de meningite pneumocócica diminuiu 46% (p <0,05) de 3,41 por 100.000 durante o período pré-vacina para 1,84 por 100.000 após a vacinação, enquanto que as taxas de mortalidade declinaram 60% (p< 0,05) de 1,17 par 0,40/100.000 crianças ≤ 2 anos. As maiores reduções foram observadas entre as crianças de 6 a 11 meses idade, com uma redução de 76 % na incidência e de 84 % na mortalidade em 2012, apesar de 33% da média de letalidade entre os casos notificados em todo o período. Esta análise identificou os grupos etários com as mais altas taxas de notificação de meningite pneumocócica e compara a incidência relativa e taxas de mortalidade antes e após a introdução da vacina, fornecendo evidências preliminares de impacto da PCV10 sobre a síndrome de meningite pneumocócica dentro de dois anos da sua utilização para a vacinação de rotina na infância. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diseases caused by Streptococcus pneumoniae, including pneumonia, meningitis and sepsis, are important contributors to child mortality. The development of efficacious vaccines against pneumococcal disease have demonstrated its importance as the leading vaccine-preventable cause of infant mortality. Among pneumococcal disease, meningitis is the clinical syndrome with the highest case-fatality and mortality rates, especially in children. Among etiologies of bacterial meningitis, pneumococcal disease has the highest rate of severe sequella and fatality. The objective of this study was to assess the impact of 10-valent pneumococcal conjugate vaccines (PCV10) on the rates of morbidity and mortality due to pneumococcal meningitis among Brazilian children aged ≤ 2 years from 2007 to 2012. We conducted an exploratory descriptive analysis of the confirmed cases of pneumococcal meningitis reported to the Information System for Notifiable Diseases (SINAN). For statistical analysis, we defined pre-vaccine (2007-2009) and post-vaccine (2011-2012) periods, excluding 2010 as the year of vaccine introduction. To assess the impact of PCV10, we compared incidence and mortality rates during pre- and post-PCV10 periods. We identified 1580 cases of pneumococcal meningitis and 430 deaths of children ≤ 2 years during the study period. Incidence of pneumococcal meningitis decreased 46% (p< 0.05) from 3.41 per 100,000 during the pre-vaccine period to 1.84 per 100,000 after vaccination, while mortality rates declined 60% (p<0.05) from 1.17 to 0.40 per 100,000 children ≤ 2 years. The greatest reductions were observed in children from 6 to 11 month old, with a 76% reduction in incidence and 84% in mortality in 2012, despite average case-fatality rate (33%) of the reported cases throughout the period. This analysis identified the age band with highest pneumococcal meningitis notification rates and compares incidence and mortality rates before and after vaccine introduction, providing preliminary evidence of PCV10 impact on the syndrome of pneumococcal meningitis within two years of its use for routine childhood immunization.

O comportamento biológico de uma amostra de vírus recém-isolada de eqüino (M82-02), procedente de uma região próxima de São Paulo, foi estudado em camundongos, inoculados pelas vias intracerebral e intramuscular, avaliando-se as características relacionadas com a infectividade, patogenicidade, período de incubação, período do curso clínico e capacidade invasiva do vírus para outros tecidos não-nervosos. A amostra, com uma passagem em cérebro de camundongos, foi tipificada antigenicamente, utilizando um conjunto de anticorpos monoclonais (MABs), desenvolvido pela \"Canadian Food and Inspection Agency\", de Ottawa, Canadá, correspondendo ao perfil de morcego hematófago Desmodus rotundus. Após ser submetida à extração do material genético, a amostra foi caracterizada geneticamente no \"National Institute of Infectious Diseases\", de Tóquio, Japão, confirmando pertencer ao genótipo 1 do gênero Lyssavirus, com característica próxima a do \"Vampire -bat related virus-VRRV\", comuns entre as amostras brasileiras isoladas de herbívoros e morcegos hematófagos. As sucessivas passagens da amostra em camundongos, por via intracerebral e intramuscular, provocaram ligeiro aumento no título do vírus e estabilização do período de incubação, quando então foi utilizado como antígeno para a prova de soroneutralização, para avaliar o comportamento deste vírus frente aos soros de eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus PV inativado. Os soros de eqüinos vacinados foram titulados em paralelo com o antígeno viral constituído de vírus CVS. Com o uso da amostra M82-02 como antígeno para a prova de soroneutralização não foi possível demonstrar diferença significativa, quando comparado com o antígeno fixo de vírus CVS, no entanto, alguns soros de eqüinos vacinados foram encontrados com níveis de anticorpos acima de 0,5UI/mL. Pela prova de imunofluorescência direta (IFD), a presença do antígeno do vírus da raiva foi evidenciada no pulmão e nos rins de animais inoculados por via IM, notadamente nos materiais de passagem mais elevada. No teste de avaliação da vacina comercial, pelo método do CDC de Atlanta, o resultado do desafio com a amostra M82-02 foi inferior ao do vírus fixo CVS, no entanto, este método ainda necessita ser melhorado para sua utilização na rotina. / The biologic behavior of a rabies virus recently isolated from an equine raised at a region neighbor to São Paulo, Southeast Brazil, the isolate M82-02, was studied in mice by inoculating through intracerebral and intramuscular route, for evaluation of characteristics related to its infectivity, pathogenicity, incubation period and course of clinical illness and also the virus capacity to invade other non-nervous tissues. The first intracerebrally passaged mouse brain was submitted for antigenic typing by using a set of monoclonal antibodies (MABs) prepared at the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and it was found to be a variant of vampire-bat related rabies virus. After extraction of genetic material, the sample was characterized genetically at the National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan, ant the isolate belonged to genotype 1 of the Lyssavirus gene, closely related to the Vampire-bat related virus group-VRRV, common among the Brazilian rabies virus isolates from herbivores and vampire bat Desmodus rotundus. The successive intracerebral and intramuscular passages in mice provoked a slight increase in the virus titer, and the stabilization of the incubation period. In its 10th passage, the isolate was used as the antigen in mouse serum neutralization test, for the assessment of equine sera which had been vaccinated with a commercial PV rabies inactivated virus vaccine, the equine sera were tested in parallel with the CVS strain and some sera were found with neutralizing titer >0.5 IU/mL. Using the isolate M82-02 of rabies virus as an antigen in the neutralization test, no significant difference could be detected, when the results were compared to that of the CVS strain. By means of direct fluorescent antibody (dFA) test, the presence of rabies virus antigen was detected in tissues of brain, lung and kidneys of mice inoculated by intramuscular route, especially in serially passaged materials. The CDC-potency test for evaluation of a commercial vaccine using the field isolate M82-02 as a challenge virus showed a poorer result than the challenge with the fixed CVS strain, however, this method needs further modifications for the routine use.

A doença de Marek (MD), causada por um alfaherpesvírus, é uma enfermidade linfoproliferativa que acomete principalmente galinhas. Como não existe tratamento, a melhor forma de prevenção e controle da MD é através do uso de vacinas atenuadas, que vêm sendo usadas desde 1970. Este trabalho descreve a análise de vacinas vivas congeladas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de Marek (herpesvírus de peru – HVT) por PCR em tempo real (qPCR) e por cultivo em células de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas (cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. As análises da homogeneidade inter e intra-lote apresentaram, respectivamente, média ± desvio padrão de 2,6 ± 1,7%, 2,1 ± 1,1% e 1,2 ± 0,1% e média ± desvio padrão de 1,5 ± 0,1%, 1,2 ± 0,8% e 1,0 ± 0,3% para A, B e C, respectivamente. A qPCR subestimou os títulos das vacinas concentradas 4x e superestimou os títulos das vacinas diluídas 8x, enquanto o cultivo celular superestimou os títulos das vacinas concentradas. As vacinas apresentaram quantidades diferentes de células/dose e unidade formadoras de placa/dose. Conseqüentemente, a relação PFU/célula também foi diferente, o que demonstra a necessidade de construção de curvas diferentes, para cada fabricante, para a titulação por qPCR.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Resumo não disponível.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Fernando Rosado Spilki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarciaMercesAparecidaBianchidos_D.pdf: 3376725 bytes, checksum: 4e17791ec1d7e56265e067f2ce1f62bf (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Metapneumovirus aviário (aMPV) pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. O vírus, relatado pela primeira vez no Brasil em 1995, é o agente etiológico da Rinotraqueíte em perus (TRT) e está associado também à Síndrome da Cabeça Inchada (SHS) em frangos e poedeiras comerciais. O presente estudo foi dividido em três partes. Na primeira foi avaliada a suscetibilidades de oito sistemas celulares para a propagação de amostras virais do aMPV subtipos A e B. As células chicken embryo related (CER), Vero e baby hamster kidney cells (BHK-21) demonstraram ser as mais apropriadas para a multiplicação de ambos os subtipos. Além disso, cultivo de anel de traquéia (TOC) e cultivo primário de embrião de galinha (CEF) foram permissíveis à infecção por aMPV após terem sido isolados e propagados em CER. As curvas da cinética viral foram realizadas nas três linhagens celulares e ambos os subtipos tiveram títulos mais altos em CER durante as primeiras 30 horas após a infecção. Não foram observadas diferenças significativas entre os títulos obtidos em células CER e Vero, demonstrando que as células CER são tão adequadas à propagação do aMPV quanto as células Vero. A segunda parte do trabalho consistiu em analisar a virulência de uma amostra de aMPV subtipo B após sofrer passagens seriadas em células CER. Cinco variantes provenientes das passagens em CER foram inoculadas em galinhas e a excreção viral foi analisada. Os resultados obtidos com as amostras de traquéia demonstram que a virulência do aMPV diminui gradualmente enquanto o título viral aumenta com o número de passagens. Em contrapartida, nas amostras de seio nasal foi observado aumento da carga viral, demonstrando que não houve diminuição no fitness viral para este órgão. As seqüências do gene G das amostras utilizadas para desafio foram obtidas, porém este gene parece não ser afetado pela propagação em células CER. Na terceira e última parte deste estudo, foi avaliada a proteção viral conferida por uma vacina comercial contra isolados brasileiros do aMPV subtipos A e B em frangos de corte. Para tanto, uma amostra de cada subtipo foi avaliada quanto à sua virulência. O isolado do subtipo B foi detectado em um período mais longo e em maiores quantidades quando comparado ao subtipo A. Os resultados da analise da proteção demonstram que algumas aves imunizadas receberam proteção viral completa contra o vírus virulento heterólogo. Porém, a mesma vacina forneceu proteção viral parcial quando as aves foram desafiadas com o vírus virulento homologo ao vacinal / Abstract: Avian metapneumovirus (aMPV) belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. The virus, first described in Brazil in 1995, is responsible for an acute rhinotracheitis in turkeys (TRT) and is associated with swollen head syndrome in broiler chickens and layer hens. The present study is divided in three parts. In the first part, eight cell culture systems were evaluate for the propagation of aMPV subtypes A and B. The chicken embryo related (CER) cells, Vero and baby hamster kidney cells (BHK-21) cells were shown to be the most appropriate for propagation of both subtypes of aMPV. In addition, propagation of aMPV in chicken embryo fibroblasts (CEF) and tracheal organ culture (TOC) remained efficient after the primary isolation and several passages of viruses in the CER cell line. The growth curves were created using CER, Vero and BHK-21 cell lines. Compared with growth, both yielded higher titres in CER cells during the first 30 hours after infection, but no significant difference was observed in the results obtained from CER and Vero cells. This data show that CER cell are adequate for aMPV propagation, giving similar results to Vero cells. The second part of this study was conducted to analyze the virulence of an aMPV subtype B strain after serial passage in CER cells. To accomplish this, chickens were infected with 5 different variants derived from serial passage and the amount of viral shedding was determined. The results of tracheal samples showed that the virulence decreases gradually with passage, while in vitro viral titre increases. However, an increase in viral shedding was observed in sinusal samples, demonstrating no decrease in fitness for this organ. The G gene sequences of challenge samples were analyzed, however this gene appears to not be affected when aMPV is propagated in CER cells. Finally, the last part of this study aimed to examine a commercially available vaccine in broiler chickens in terms of it ability to provide virological protection against aMPV subtypes A and B. To accomplish this, the virulence of each virulent strain was analyzed. The results demonstrate that the subtype B virulent strain could be observed longer and in larger quantities compared to subtype A. A complete heterologous virological protection was provided by the subtype B vaccine; however, a lack of complete homologous virological protection was observed when chickens were challenged with the homologous subtype B strain / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular