Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-03T18:29:13Z No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Reatividade de Linfócitos T de indivíduos infectados pelo HIV-1 contra epitopos GAG e NEF de diferentes subtipos HIV-1. Dissertação Mestrado - CPqGM - 2008.pdf: 883674 bytes, checksum: e99dbac32085a623e129289408e7f7d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-03T18:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Reatividade de Linfócitos T de indivíduos infectados pelo HIV-1 contra epitopos GAG e NEF de diferentes subtipos HIV-1. Dissertação Mestrado - CPqGM - 2008.pdf: 883674 bytes, checksum: e99dbac32085a623e129289408e7f7d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O Vírus da imunodeficiência humana é o agente causador da AIDS. Apesar de existir tratamento para a infecção do HIV-1, este não leva a cura dos pacientes. A identificação de epitopos de proteínas virais do HIV-1 reconhecidos por linfócitos T pode ser eficiente para o desenvolvimento de uma vacina. Neste trabalho foi avaliado o padrão da resposta imune de indivíduos infectados pelo HIV -1 frente às proteínas GAG e NEF de diferentes subtipos do HIV-1. Foi utilizado PBMC de pacientes infectados pelo HIV-1 sob o uso de terapia antiretroviral. Foram utilizados 23 pools de peptídeos do HIV-1 na concentração de 2μg/mL derivados dos subtipos brasileiros BBR, C, F e do isolado de referencia B (HXB2), em ensaio de ELISPOT. Todos os pacientes responderam a pelo menos um dos pools de peptídeos. Destes, 41% responderam para os pools de proteínas do isolado HXB2 e 49% para os pools de proteínas do subtipo brasileiro BBR, C e F. Isoladamente, as maiores freqüências de respondedores foram para os pools de proteínas do isolado HXB2 NEF 3 (68%) e HXB2 NEF 2 (63%). Da mesma forma, os pools de peptídeos das seqüências brasileiras BBR, C e F que apresentaram as maiores freqüências de respondedores foram NEF F (87%), NEF C (62%), GAG F1 (62%). A magnitude da resposta foi em média de 2174 SFCX106 PBMC para os pools do isolado HXB2 e de 1331 SFCX106 PBMC para os pools dos subtipos brasileiros. O pool que apresentou a maior magnitude da resposta foi GAG p24-1 do isolado HXB2 com 3290 SFCX106 PBMC. Estes resultados demonstram que os pacientes infectados pelo HIV-1 respondem aos pools de peptídeos das proteínas GAG e NEF do isolado HXB2 e dos subtipos brasileiros BBR, C e F. / The human immunodeficiency virus is the etiological agent of AIDS. The antiretroviral treatment is efficient, however the cure is not reach. The identification of T cell epitopes from HIV-1 proteins could be an efficient approach for development of an HIV-1 vaccine. In this work, we evaluated the immune responses of HIV-1 infected individuals to GAG and NEF HIV-1 proteins from different virus subtypes. Pools of peptides of proteins from Brazilians HIV-1 subtypes BBR, C, F sequences and from HIV-1 subtype B isolate (HXB2) were tested by ELISPOT assay. All tested pools were recognized. PBMC of 41% of patients recognized subtype HXB2 pools and 49% recognized the pools from Brazilians subtypes. The most frequently recognized pools were NEF3 (68%) and NEF2 (63%) from HXB2 isolated. The most frequently recognized pool from Brazilians subtypes were NEF F (87%), NEF C (62%), GAG F1 (62%). On average, the magnitude of responses to HXB2 isolate pools were 2174 SFCX106 PBMC and 1331 SFCX106 PBMC for Brazilians pools. The highest magnitude of response was directed to GAG p24-1 from HXB2 subtype with 3290 SFCX106 PBMC. These results indicated that peptides from NEF and GAG proteins from HXB2 isolated or Brazilians subtypes BBR, C and F sequences are recognized by HIV-1 infected patients and may have the potential for inclusion in a vaccine against HIV-1.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:35:56Z No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus vivo atenuado de Febre Amarela (FA) YF 17D é uma das vacinas virais mais seguras e eficazes já administradas a humanos, a qual induz uma resposta imune polivalente. Estas características tornam este vírus vacinal umaplataforma tecnológica para o desenvolvimento de novas vacinas. Através da tecnologia do clone infeccioso, nós utilizamos o arcabouço de YF 17D para expressar epítopo indutor de linfócitos T CD8 + , TEWETGQI e um fragmento imunogênico, ambos provenientes da proteína de superfície de amastigota 2 (ASP-2) de Trypanosoma cruzi, parasita causador da Doença de Chagas. Este estudo objetivou evidenciar o potencial deste vírus em expressar antígenos heterólogos. O epítopo TEWETGQI foi clonado e expresso baseando-se em doissítios distintos do genoma: na alça fgda proteína de Envelope (E) (YF17D/E200/Tc) e no sítio de clivagem proteolítico entre NS2B e NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). Uma terceira estratégia envolveu a montagem de um cassete heterólogo expressando um fragmento imunogênico de 120 aminoácidos de ASP-2 entre as proteínas E e NS1 (YF17D/ENS1/Tc). Nós investigamos se o sítio de expressão poderia influenciar a imunogenicidade do antígeno heterólogo. Assim, foram gerados vírus que se replicaram em cultura de células similar ao YF 17DD e permaneceram estáveis geneticamente após algumas passagens seriadas em célula Vero. A expressão dos antígenos heterólogos pelos vírus recombinantes revelou distintos padrões de detecção em diferentes regiões da célula. Outros estudos de caracterizaçãomostraram que os vírus YF17D/E200/Tc e YF17D/NS2B3/Tc são mais atenuados do que YF 17DD, quando inoculados via intracerebral em camundongos, sendo YF17D/E200/Tc o mais atenuado. Estudos de imunogenicidade revelaram que todos os vírus foram capazes de induzir anticorpos neutralizantes para Febre Amarela e o vírus YF17D/ENS1/Tc induziu anticorpos que reagem especificamente com amastigotas. Além disso, os vírus recombinantes induziram em camundongos imunizados uma resposta celular T produtora de interferon-gama(IFN-γ) antígeno-específica, além de uma resposta balanceada T CD4 + e T CD8 + para Febre Amarela. A vacinação de uma linhagem murina altamente suscetível à infecção por T. cruzicom um regime de dose-reforço homólogo que utilizou uma formulação de vírus YF 17D recombinantes induziu células T CD8 + TEWETGQI específicas após uma única dose, a qual poderia explicar o maior grau de proteção após desafio com T. cruzi. Assim, concluímos que a plataforma de YF 17D é útil para expressar antígenos de protozoários (T. cruzi) em regiões funcionais distintas do genoma com um impacto mínimo na viabilidade viral. Além disso, o uso de novas formulações contendo diferentes vírus YF 17D recombinantes parece ser uma estratégia promissora, a qual será explorada para outros patógenos. / The attenuated Yellow Fever (YF) 17D vaccine virus is one of the safest and most effective viral vaccines administered to humans, inwhich it elicits a polyvalent immune response. These characteristics make this vaccine virus a technological platform to the development of new vaccines. Herein, through the infectious clone technology, we used the YF 17D backbone to express a CD8 + T cell epitope, TEWETGQI and an immunogenic fragment, both originated from the Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease) Amastigote Surface Protein 2 (ASP-2). This study aimed to provide further evidence for the potential of this virus to express foreign epitopes. The TEWETGQI epitope was cloned and expressed in two different genomic insertion sites:the fg loop of the viral Envelope protein (E) (YF17D/E200/Tc) and the protease cleavage site between the NS2B and NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). A third strategy involved the construction of a heterologous cassette expressing an immunogenic ASP-2 fragment between E and NS1 (YF17D/ENS1/Tc). We investigated whether the site of expression had any influence on foreign antigen immunogenicity. In this sense, we generated virus that replicated similarly to vaccine virus YF 17DD in cell culture and remained genetically stable after some serial passages in Vero cells. The expression of the heterologous antigens by the recombinant viruses revealed distinct patterns of detection regarding different regions of the cell. Other characterization studies showed that YF17D/E200/Tc and YF17D/NS2B3/Tc were more attenuated than YF 17DD, when inoculated intracerebrally in mice, YF17D/E200/Tc being the most attenuated. Immunogenicity studies revealed that all viruses elicited neutralizing antibodies to YF virus and YF17D/ENS1/Tc virus induced antibodies that react specifically to amastigotes. Moreover, recombinant viruses generated an antigen specificgamma interferon (IFN-γ) mediated T-cell response in immunized mice as well as a balanced YF T CD4 + and T CD8 + response. Vaccination of a mouse lineage highly susceptible to infection by T. cruziwith a homologous prime-boost regimen of a YF 17D recombinant formulation elicited TEWETGQI specific CD8 + T cells after only one dose which could explain the higher degree of protection after T. cruzichallenge. We conclude that the YF 17D platform is useful to express Protozoan (T. cruzi) antigens at different functional regions of its genome with minimal reduction in vector viability. Besides, the use of new viral formulations composed of different YF 17D recombinant viruses seem to be a promising strategythat will be explored to other pathogens.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 145.pdf: 1867505 bytes, checksum: 87dab03551d06be6de32b042de770c29 (MD5) Previous issue date: 2005 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O presente estudo incluiu 235 cepas, procedentes dos estados de Santa Catarina (SC), Rio de Janeiro (RJ) e Pemambuco (PE). Verificamos que o Hib antes da vacinação predominava em mais de 90 por cento dos casos, sendo os outros tipos sorológicos raros. Após a vacinação, cai o tipo,b, crescem os tipos não b, em meningites, septicemias e infecções respiratórias. Os biotipos I e II foram os mais isolados. Houve variação da sensibilidade aos antimicrobianos testados (ampicilina, amoxicilina-ácido clavulânico, ceftriaxona, rifampicina, cloranfenicol e sulfametoxazol-trimetoprim), sobretudo na associação SMX- TMP cuja resistência dos Hi aumentou de 32,6 por cento para 65,8 por cento entre os dois períodos; enquanto se mantiveram taxas semelhantes de resistência para a ampicilina (17,5 por cento e 15,8 por cento) e a presença de cepas produtoras de p-lactamase; a sensibilidade à amoxicilina-ácido clavulânico e ceftriaxona foi de 100 por cento. Alteração na resistência ao cloranfenicol de 19,4 para 12,5 por cento e da rifampicina de 8,2 para 9,7 por cento.A tipagem sorológica realizada pelo método da SAL, teve bons resultados (96,2 por cento) e a molecular, pela PCR, diferenciou as cepas NT das capsuladas b -.Embora a estrutura populacional dos Hi tenha sido inicialmente descrita como clonal, os resultados obtidos através da técnica de ERIC- PCR, revelaram diversidade genética nas cepas estudadas. As do sorotipo b, revelaram 4 clones com diferentes características epidemiológicas. A diversidade genética foi maior nas Hinb e HiNT. Dos estados estudados, PE teve a mais alta diversidade genética (6 clones em 15 cepas) seguido do RJ (3 clones em 23 cepas) e SC (2 clones em 13 cepas). Concluímos, portanto, que há necessidade do monitoramento das cepas circulantes de Hi no país observando as possíveis alterações na prevalência dos sorotipos atuais e a real estimativa do impacto da vacina contra o Hib atualmente utilizada no Brasil. / The bacterial genus Haemophilus is included in the family Pasteurellaceae and the mostimportant specie causing infectious diseases in humans is the Hi. It shows capsularserotypes (a-f) as well as NT strains. A great number of different acute infectious diseasesare caused by this organism, especially affecting the CNS, as well as RD, occurringfrequently in children, especially with the Hib. Since 1988 disease associated with Hib hasbeen vaccine-preventable, by means of the first conjugate vaccine showing great efficacy.The vaccine is composed by the PRP and a carrier protein. However, the Hib is stillconsidered one of the most important human pathogens, which leaded us to developdifferent research lines, with isolates from different source of infections, after theintroduction of the conjugate vaccine against Hib by PNI/MS in 1999. We used in ourstudy 235 Hi isolates, from the brazilian states of Santa Catarina, Rio de Janeiro andPernambuco. Our results, show that the rate of type b infections before vaccination wasmore than 90%, whereas other serological types were rare. After the advent of the vaccine,we observe a decrease of type b and an increase of non-b isolation. Biotypes I and II arestill the most frequently isolated. The antimicrobial susceptibility found against ampicillin,amoxicillin-clavulanate, ceftriaxone, rifampicin, chloranphenicol and TMP-SMX, showed arecent increasing resistance against antibiotics commonly used to treat RD, especiallyamong the ones administrated by oral route, showing a resistance rate from 32.6% to 65.8%between the two periods studied. Ampicillin, showed resistance rates of 17.5% and 15.8%in the two periods studied and the presence of â-lactamase producing strains. Strainsevaluated against amoxicillin/clavulanate and ceftriaxone, were 100% sensible.Chloranphenicol showed a decrease in the resistance rates of the strains isolated during thepost-vaccination period, while rifampicin, showed an increase in the resistance rate from8.2 to 9.7%. The seroaglutination method used for capsular typing, showed good results,however, mutant b capsulated strains (b-), were only detected by the PCR, using specificprimers for the capsule region. The population structure of Hi which has been described asclonal, revealed a great genetic diversity by ERIC-PCR. Therefore we can conclude thatthere is a need of systematic tracking of circulating Hi strains in the country, continuouslywatching possible epidemiological changes and the evaluation of the impact of the vaccineagainst Hib used in Brazil to date.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:41:55Z No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:42:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:42:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:42:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO), atualmente 200 milhões de pessoas estão infectadas por espécies do gênero Schistosoma, uma vacina, administrada sozinha ou em combinação com drogas anti-helmínticas, seria importante para o controle da esquistossomose. Recentemente, nosso grupo demonstrou que uma preparação do tegumento de esquistossômulo do S. mansoni (Smteg) é capaz de elicitar uma diminuição estatisticamente significativa na carga parasitária quando formulado com adjuvante de Freund. Neste trabalho nós avaliamos a imunoproteção induzida em camundongos pelo Smteg sem adjuvante ou Smteg associado ao Alum ou Alum + CpG. Na ausência de adjuvante não houve diminuição estatisticamente significativa da carga parasitária. Apesar disso, o Smteg foi capaz de ativar a resposta imune produzindo níveis significativos de anticorpos específicos, aumentando a porcentagem de células TCD4+IFN-γ+ e de células TCD4+IL-10+ no baço e aumentando a produção das citocinas IFN-γ e IL-10 pelas células esplênicas e IL-10 por células dendríticas,. Ao contrário, a associação Smteg/alum/CpG-ODN foi capaz de induzir uma redução parcial na carga parasitária (43,1%) além de uma reduzir significativamente o número de ovos eliminados nas fezes. Esta resposta protetora foi associada com um perfil predominantemente do tipo Th1, com o aumento na produção de IgG2c, IFN-γ e TNF-α. O papel dos anticorpos na eliminação do parasito em animais imunizados com o Smteg também foi avaliado, e demonstramos que anticorpos específicos estão envolvidos na eliminação do parasito. Uma vez observada a importância dos anticorpos na imunidade protetora, realizamos análises proteômicas e sorológicas pela técnica de Western-blotting bidimensional (2D-WB) para identificar candidatos vacinais. Uma das proteínas identificadas, a ciclofilina do S. mansoni (SmCyp), foi utilizada como antígeno em um protocolo de imunização gênica, porém não observamos redução significativa da carga parasitária e do número de ovos nas fezes e no intestino e fígado de camundongos imunizados, apesar da imunização diminuir significativamente a área dos granulomas hepáticos em animais imunizados. Nossos resultados demonstram a importância do tegumento do esquistossômulo do S. mansoni como fonte de antígenos vacinais para a esquistossomose mansoni; a importância dos anticorpos na eliminação do parasito e identifica proteínas candidatas a serem utilizadas em formulações vacinais, abrindo novas possibilidades de estudos avaliando as mesmas em diferentes formulações e estratégias vacinais em ensaios pré-clinicos / According to the World Health Organization (WHO), currently 200 million people are infected by Schistosoma species, the vaccine, administered alone or in association with antihelminthic drugs, would be important to control schistosomiasis. Recently, our group demonstrated that the schistosomula tegument preparation from S. mansoni (Smteg) is able to induce a significant reduction in worm burden when formulated to Freund adjuvant. In this work we evaluated the protection induced by Smteg without adjuvant or Smteg with Alum or Alum + CpG. Without adjuvant any significant reduction in parasite burden was observed. However, Smteg immunization activate immune response inducing significant production of specific antibody; increased percentage of TCD4+IFN-γ+ and TCD4+IL-10+ cells in spleen and increased production of IFN-γ and IL-10 cytokines by spleen cell and IL-10 by dendritic cells. On the other hand Smteg/alum/CpG-ODN formulation was able to induce partial reduction in worm burden (43.1%) and also a significant reduction in the number of eggs eliminated in the feces. This protective response was associated with a predominant Th1 type of immune response, with increased production of specific IgG2c, IFN-γ and TNF-α. The role of antibodies in the elimination of parasites in animals immunized with Smteg was also evaluated and we have demonstrated that specific antibodies are involved in the elimination of the parasite. Once we have observed the importance of antibodies in protective immunity, we performed proteomic and serological analyzes by two-dimensional Western blotting (WB 2D) technique to identify vaccine candidates. One of the identified proteins, the S. mansoni cyclophilin (SmCyp), was used as antigen in a genetic immunization protocol, although no significant reduction in parasite burden and the number of eggs in the feces and intestine and liver of immunized mice was observed, immunization significantly decrease the area of hepatic granulomas in immunized animals. Our results demonstrate the importance of S. mansoni schistosomula tegument as a source of vaccine targets for schistosomiasis; the importance of antibodies in parasite elimination and also identify proteins to be used in vaccine formulations, opening new studies possibilities in the evaluation of these candidates in different formulations and vaccination strategies in preclinical trials.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 501.pdf: 2806630 bytes, checksum: 5dbcbb44377fbc1620ff4879d96a08d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 536.pdf: 12060845 bytes, checksum: 5af1c56abad31cc9c82bc99e14652b56 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é um problema de Saúde Pública em termos de morbidade e mortalidade, sendo reconhecida em mais de 100 países. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina encontra sua dificuldade na imunopatogênese da doença, fazendo-se necessária a construção de uma vacina tetravalente que seja capaz de imunizar contra os quatro sorotipos do vírus, em diferentes faixas etárias, sem elicitar o efeito deletério da febre hemorrágica do dengue. Para isto, novas tecnologias têm sido utilizadas no lugar dos sistemas de atenuação e inativação viral. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver duas novas estratégias vacinais contra o vírus dengue, utilizando as seguintes abordagens: a primeira consistiu no desenvolvimento de uma vacina de DNA que expressava epítopos definidos de células B e T, do DENV-3, associados ao sinal de tráfego celular da proteína de membrana do lisossomo- LAMP. A segunda consistiu na expressão in tandem dos domínios III da proteína do envelope dos quatro sorotipos, fusionados ao replicon do vírus da febre amarela 17D. Foram utilizadas técnicas padrão de clonagem e de recombinação homóloga em levedura para a construção das diferentes abordagens. A expressão da vacina de DNA e a replicação autônoma dos replicons foram confirmadas pelo ensaio de imunofluorescência indireta de células transfectadas. Os resultados para a vacina de DNA mostraram com sucesso a expressão do LAMP-1 humano fusionado aos epítopos, no entanto, a construção não foi capaz de gerar resposta imune por anticorpos neutralizantes. A vacina baseada em replicons mostrou que é possível utilizar com sucesso os replicons como vetores vacinais e que estes permitem a expressão de genes heterólogos alvos. Nossos estudos representam uma etapa inicial para o desenvolvimento de novas formulações vacinais que podem constituir um importante avanço para o desenvolvimento de vacinas de última geração para o dengue

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 17.pdf: 1549058 bytes, checksum: d1d338fb698a95bb0d0ea23528f8cf74 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A doença meningocócica permanece como um problema de saúde pública, estando relacionada a altas taxas de morbidade e mortalidade, principalmente em crianças e lactentes. A rápida evolução da doença requer uma intervenção terapêutica específica e precoce, e enfatiza a necessidade de disponibilizar vacinas que possam ser utilizadas na prevenção dessa doença. Estratégias utilizando proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis como antígeno estão sendo desenvolvidas para a produção de uma vacina universal contra o sorogrupo B, que pode, inclusive, conferir proteção contra outros sorogrupos. Duas vacinas se encontram atualmente em ensaios clínicos. A vacina recombinante rfHbp possui duas variantes da proteína fHbp (V1 e V2) como antígeno, e a vacina 4CMenB é uma vacina multicomponente que inclui três proteínas (fHbp, NHBA e NadA) combinadas com OMVs da cepa epidêmica da Nova Zelândia. Embora estes antígenos sejam relativamente conservados, os mesmos já demonstraram variabilidade em diferentes regiões. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência e diversidade genética destes antígenos em isolados clínicos de N. meningitidis sorogrupos B e C circulantes no Brasil. A caracterização dos isolados pelo MLST revelou seis complexos clonais principais (CCS ST-41/44, ST-1136, ST-32/ET-15, ST-8/A4, ST-11/ET-37 E ST 103). Todos os isolados apresentaram o gene de fHbp, onde a variante 1 foi predominante para sorogrupo B e a variante 2 para o sorogrupo C. O gene NHBA também foi identificado em todos os isolados. Apenas 29,73% dos isolados apresentaram o gene nadA. Nenhuma das cepas analisadas apresentou o mesmo subtipo de PorA presente na OMV que compõe a vacina, não sendo interessante a inclusão desta vesícula em uma possível vacina brasileira. Apenas três variantes de VR3 de PorA foram identificadas, demonstrando a baixa variabilidade desta região da proteína e a possível aplicação em uma vacina. / Meningococcal disease remains a public health problem causing high case-fatality rates worldwide, especially among young children and young adults. The rapid evolution of the disease requires specific and fast therapeutic actions and the use of prophylaxis through vaccination is the best choice to halt the spread of the disease. New vaccine approaches using surface exposed proteins from Neisseria meningitidis have been developed for the design of a universal vaccine against serogroup B, which could also elicit protection against other serogroups. Two vaccines using this strategy are currently through clinical trials. The recombinant vaccine rfHbp with two fHbp antigenic variants (V1 and V2) and the multicomponent vaccine 4CMenB including three proteins (fHbp, NHBA and NadA) combined with an OMV from the New Zealand vaccine strain. Although these are highly conserved antigens, some genetic variation has been already observed within their genes. The main objective of this study was to evaluate the prevalence and genetic diversity of these antigens among N. meningitidis serogroup B and C isolates circulating in Brazil. The characterization of such isolates by MLST analysis, revealed the presence of six main clonal complexes (CCS ST-41/44, ST-1136, ST-32/ET-15, ST-8/A4, ST-11/ET-37 E ST 103). The gene fHbp was amplified from all isolates and Variant 1 was predominant among serogroup B and Variant 2 among serogroup C. Gene NHBA was also amplified from all isolates. Gene nadA was only amplified form 29.73% of all isolates. We didn´t find any strain matching the same PorA subtype of the OMV used in the 4CMenB vaccine, thus the inclusion of such bacterial structure in a future vaccine to be used in Brazil would be useless. Only three PorA VR3 variants were detected showing the low diversity of this protein region and the possible inclusion of this structure on a future vaccine. We have detected a possible indication of capsule “switching” among some isolates which shows the need of a wide surveillance of meningococcal strains that can escape the protection of serogroup C conjugate vaccines. The rfHbp vaccine suggested that it could show a higher efficiency when compared with 4CMenB, but it is important to cover possible scape mechanisms showed by several strains.

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 5.pdf: 1093384 bytes, checksum: 9432b61bcb4cfac37f05a1600b8f2fae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Haemophilus influenzae pode ser encontrado, normalmente, na microbiota do trato respiratório, do trato gênito-urinário e da cavidade oral. Porém, essa espécie inclui um dos mais importantes patógenos bacterianos em infecções principalmente pediátricas. As cepas de Hi podem ser capsuladas, variando de a-f, ou não capsuladas (não tipáveis - NT). O tipo capsular b foi o mais frequente em infecções graves infantis até a utilização da vacina conjugada contra Hib, sendo ainda considerado patogênico. No Brasil, essa vacina foi introduzida no Programa Nacional de Imunização do Ministério da Saúde em agosto de 1999, e como em outros países, promoveu uma acentuada diminuição em doenças causadas por esse agente. No entanto, estudos realizados na era pós-vacinal têm mostrado que a incidência de doenças invasivas causadas por H. influenzae não b e NT têm aumentado, inclusive no Brasil. O objetivo desse trabalho foi obter informações sobre as cepas de Hi circulantes no município do Rio de Janeiro. Utilizou-se 96 amostras de quadros infeciosos (46 invasivas e 50 não invasivas), isoladas no período pós-vacinal (2000-2012). Em relação à idade, dos 54 pacientes que tiveram esse dado, 32 tiveram doenças invasivas e 22 não invasivas. Em doenças invasivas, houve o predomínio de crianças < 5 anos. Enquanto que nas não invasivas os adultos > 70 anos predominaram. Entre as cepas obtidas, 15 foram capsuladas e 81 não capsuladas. A maioria das cepas capsuladas foi proveniente de sítios invasivos, cuja faixa etária predominante foi de < 5 anos. O tipo capsular mais isolado foi o b, seguido do a e f. As cepas Hib, predominaram no início do período de estudo, enquanto os outros sorotipos predominaram no final. No presente trabalho, não encontramos cepas mutantes deficientes de cápsula tanto Hib-, quanto Hia- / Haemophilus influenzae can be found usually in the microbiota of the respiratory tract, genitourinary tract and oral cavity. However, this species includes one of the most important bacterial pathogens mainly in pediatric infections. The strains can be capsulated Hi, (serotypes a-f), or not capsulated (nontypeable - NT). The type b capsular was the most frequent serious infection in children until the use of conjugate vaccine against Hib and is still considered pathogenic. In Brazil, this vaccine was introduced in the National Immunization Program of the Ministry of Health in August 1999, and as in other countries, promoted a significant decrease of disease caused by this agent. However, studies during the post-vaccine period have shown that the incidence of invasive disease caused by H. influenzae b and NT have increased, including in Brazil. The aim of this study was to obtain information on the Hi strains circulating in the municipality of Rio de Janeiro. We used 96 samples (46 invasive and 50 noninvasive), isolated during the post-vaccination period (2000-2012). Concerning the age of the 54 patients who had this data, 32 had invasive and 22 noninvasive disease. In invasive disease, there was a predominance of children <5 years. While in the noninvasive group, adults > 70 years predominated. Among the strains obtained, 15 were capsulated and 81 non-capsulated. Most capsulated strains originated from invasive sites whose predominant age group was <5 years. The most frequent capsular type was b, followed by a and f. Hib strains predominated at the beginning of the study period, while the other serotypes prevailed in the end. In this study, we did not found mutant strains deficient in both capsule Hib- and Hia-. NT strains accounted for the vast majority of isolates in this study, 32 strains isolated from invasive sites and 49 sites noninvasive, and were obtained from patients of all age groups. The capsulated strains were predominantly biotype I and II, while non-typeable strains were most II and III. In this study, only the NT strains were resistant to two drugs: ampicillin and trimethoprim - sulfamethoxazole. These were mostly non-invasive. Thus, none of the capsulated isolates were resistant. The PFGE patterns for the 96 strains were quite different, however eight NT strains belonged to the same genotype. Capsulated strains of the same serotype were similar, getting most isolates grouped in the same cluster. We therefore conclude that it is necessary to monitor the Hi strains circulating in Rio de Janeiro, because of the geographic and economic importance of this municipality. Such conduct should be extended to the whole country in order to understand the possible changes of serotypes today, which will certainly guide for the design of new vaccines, improvement of existing ones and the use of antibiotics, resulting in a public health impact.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 simone_costa_ioc_dout_2008.pdf: 34704570 bytes, checksum: e34eaf901d373dd2f63e3ffbecbb7e50 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue (DENV) consiste de quatro sorotipos antigenicamente relacionados: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Apesar dos diversos esforços para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue, ainda não há nenhuma comercialmente disponível. As proteínas não estruturais 1 e 3 (NS1 e NS3) são indicadas como antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina contra DENV. Segundo alguns estudos, a proteína NS1 é capaz de induzir uma resposta protetora de anticorpos com atividade de fixação do complemento. A proteína NS3, que realiza reações enzimáticas essenciais para a replicação viral, parece ser imunogênica, contendo um predomínio de epítopos para linfócitos T CD4+ e CD8+. No presente trabalho nós avaliamos o potencial de vacinas de DNA baseadas nas proteínas NS1 e NS3 de DENV-2. Foram construídos cinco plasmídeos, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N e pcTPANS3C, contendo a seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionado ao gene NS3 inteiro ou partes destes. Todos estes plasmídeos mediaram a expressão das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas Camundongos foram inoculados com estes plasmídeos e desafiados com DENV-2 por via intracerebral (i.c.). Nenhuma destas construções induziu níveis satisfatórios de proteção. Além dos plasmídeos com NS3, foram construídas quatro vacinas de DNA baseadas no gene NS1: 1 - pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E fusionada à NS1, 2 - pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção N-terminal da NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, que codifica o peptídeo sinal t-PA fusionado à NS1 e 4 - pcTPANS1ANC, semelhante ao pcTPANS1 com a adição da seqüência ANC. A proteína NS1 recombinante foi detectada nos extratos celulares e sobrenadante das culturas de células BHK transfectadas com pcTPANS1, pcENS1 e pcENS1ANC. Tais resultados indicam que as seqüências sinais t-PA e E direcionaram a NS1 para secreção. A proteína NS1 também foi observada associada à membrana plasmática de células transfectadas com pcENS1ANC, demonstrando a importância da seqüência ANC para o seu ancoramento. Todos os camundongos imunizados com pcTPANS1 ou pcENS1 produziram altos níveis de anticorpos, direcionados principalmente para epítopos conformacionais da NS1, enquanto que somente metade dos animais inoculados com pcENS1ANC apresentaram níveis detectáveis de anticorpos A resposta de anticorpos se mostrou duradoura (até 56 semanas após a primeira dose das vacinas), e os animais apresentaram uma rápida resposta secundária após um reforço de DNA. Camundongos imunizados com os plasmídeos pcTPANS1 e pcENS1 se mostraram protegidos contra desafios com DENV-2 por via i.c., sendo o pcTPANS1 levemente mais protetor. Estes dois plasmídeos ativaram a produção de diferentes subclasses de IgG específicas contra NS1. Não foi observada proteção interespecífica quando camundongos imunizados com pcTPANS1 foram desafiados por via i.c. com DENV-1. Os animais imunizados com o pcTPANS1 foram desafiados com DENV-2 por via intraperitoneal e também se mostraram protegidos. Neste modelo de desafio, foi observada uma diminuição dos efeitos histopatológicos do vírus no fígado dos animais vacinados. Resultados preliminares sugerem à lise de células infectadas com DENV-2, dependente do complemento, na presença dos anticorpos direcionados contra NS1 / Dengue virus (DENV) consists of four antigenically related serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. Although considerable research has been conducted towards the development of a DENV vaccine, no vaccine is yet commercially available. The non-structural proteins 1 and 3 (NS1 and NS3) have been identified as promising antigens for the development of vaccines against DENV. According to some reports, NS1 can elicit a protective antibody response with complement-fixing activities. NS3, a protein that carries out enzymatic reactions essential for viral replication, appears to be immunogenic, presenting a preponderance of the CD4+ and CD8+ T cell epitopes. In the present work we investigate the potential of DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 and NS3 proteins. We constructed five recombinant plasmids, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N and pcTPANS3C, which contain the sequence that codes the signal peptide derived from the human tissue plasminogen activator (t-PA) fused to the full or partial length of the DENV-2 NS3 gene. Results indicated that these plasmids promoted the expression of recombinant proteins in eukaryotic cells. Mice were inoculated with these plasmids and challenged by the intracerebral (i.c.) route with DENV-2. None of these constructs induced acceptable protection. Moreover, we constructed four DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 gene: 1 - pcENS1, coding the C-terminal of the E protein fused to NS1, 2 - pcENS1ANC, similar to pcENS1 with the addition of the N-terminal of NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1 and 4 - pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 with the addition of the ANC sequence. The recombinant NS1 protein was detected in cell extracts and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected BHK cells. Such results indicated that the E and t-PA sequences targeted NS1 to secretion. NS1 was also observed in association with plasma membrane of pcENS1ANC-transfected cells, which demonstrated the importance of the ANC sequence for cell anchoring. High levels of antibodies, mainly recognizing surface-exposed conformational epitopes of NS1, were induced in all mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only half of pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable antibody levels. Long-term antibody response was observed in pcTPANS1 and pcENS1 immunized animals (56 weeks after the first vaccine inoculation) and there was a rapid secondary response after a DNA booster. Protection was elicited in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice challenged with DENV- 2 by the i.c. route and the pcTPANS1 seemed to generate a slightly higher protection. Moreover, these two plasmids induced different NS1-specific IgG subclasses. No protection was displayed when pcTPANS1-immunized animals were i.c. challenged with DENV-1. Animals inoculated with pcTPANS1 were also protected when they were challenged with DENV-2 by the intraperitoneal route. Liver tissue from vaccinated animals presented a remarkable decrease of hepatic damages in this challenge mouse model. Preliminary results suggested the complement-mediated lyses of DENV-2 infected cells in the presence of the NS1-specific antibody.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariela_gomez_ioc_dout_2014.pdf: 8571554 bytes, checksum: 662bf4d26fe89925ff0e648a52a7d4e6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os Rotavírus da espécie A (RVA) são os principais agentes etiológicos causadores de gastroenterite aguda (GA) em crianças \22645 anos. Após a introdução, em março de 2006, da vacina monovalente G1P[8] (Rotarix® - RV1) no Programa Nacional de Imunizações (PNI) pelo Ministério da Saúde (MS) do Brasil, observou-se uma mudança na epidemiologia dos genótipos de RVA circulantes na população. Apesar desta variação dos genótipos circulantes, observou-se no Brasil uma redução de 22-28% de mortes e de 21-25% de hospitalizações em crianças \02C22 anos de idade, particularmente nas regiões Norte e Nordeste. Provavelmente a variação dos genótipos de RVA, tanto no tempo quando nas regiões geográficas, esteja relacionada a diversos fatores. O fato da vacina RV1 apresentar uma constelação genética (11 genes) Wa-like pode estar influenciando na eficácia da mesma frente aos RVA que apresentem constelações diferentes, como vírus DS-1-like e AU-1-like. Neste estudo foi analisada a diversidade genética de RVA de diversos genótipos detectados no Brasil antes e após a introdução da vacina RV1 pelo PNI, tanto em crianças vacinadas quanto não vacinadas, com o intuito de: i) identificar e caracterizar variantes de RVA emergentes e reemergentes; ii) contribuir para um melhor entendimento da dinâmica evolutiva deste vírus; iii) identificar mutações pontuais e genes que foram introduzidos mediante reestruturação genética, que eventualmente posam estar vinculados ao fato de RVA causarem GA inclusive em crianças vacinadas Deve-se ressaltar que este estudo engloba amostras de diferentes regiões geográficas do Brasil, visto que dados epidemiológicos sugerem diversidades genotípicas regionais. Todas as cepas G2P[4] para as quais foram analisados os 11 segmentos gênicos apresentaram uma constelação gênica DS-1-like: I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2, apesar de que diversas variantes virais circularam no período estudado. Não foram observadas diferenças nos sítios antigênicos das proteínas VP8* e VP7 entre crianças vacinadas e não vacinadas. As cepas G1P[6] analisadas apresentaram uma constelação gênica Wa-like: I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1. As cepas G12P[9] apresentaram uma constelação gênica AU-1-like: I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H6, enquanto as cepas G12P[8] revelaram uma constelação gênica Wa-like: I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1. Além disso, a análise do viéis no uso de códons de RVA genótipo G2P[4] revelou que existe uma correlação entre o viéis no uso de códons e a composição de bases, o que sugere que a pressão mutacional é um fator importante na determinação do viéis no uso de códons em RVA humanos / Specie A rotaviruses (RVA) are the main etiological agents of acute gastroenteritis (AG) in children ≤ 5 years old. After the introduction of monovalent vaccine G1P[8] (Rotarix® - RV1) in the National Immunization Program (NIP) in March 2006, a change in the epidemiology of RVA circulating genotypes in the population was observed in Brazil. Despite this variation, a reduction of 22-28% of deaths and 21-25% of hospital admissions in children ˂ 2 years of age, particularly in the North and Northeast regions, occurred after RV1 introduction. RVA genotypes variation along time and in the different geographical regions might be related to several factors. Since the RV1 vaccine has a Wa-like genetic constellation the effectiveness of this vaccine against RVA showing different genetic constellations, such as DS-1-like and AU-1-like viruses, it might be influenced. In this study we analyzed the genetic diversity of different RVA genotypes detected in Brazil, before and after the introduction of the RV1 vaccine by the NIP, in vaccinated and unvaccinated children in order to: i) identify and characterize RVA emerging and reemerging variants; ii) contribute to a better understanding of the evolutionary dynamics of this virus; iii) identify point mutations and genes that have been introduced by reassortment events and that could eventually be linked to the fact that some RVA are capable to cause AG in vaccinated children. It should be emphasized that this study includes different geographical regions of Brazil, as epidemiological data suggests regional genotypic diversity. All G2P[4] strains analyzed revealed a DS-1-like genome constellation: I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2. However, several viral variants circulated during the study period. No differences were observed inside antigenic sites of VP7 and VP8* proteins between vaccinated and unvaccinated children. The G1P[6] strains analyzed showed a Wa-like genome constellation: I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1. The G12P[9] strains showed a AU-1-like genome constellation: I3-R3-C3-A3-M3-N3-T3-E3-H6, while G12P[8] strains showed a Wa-like genome constellation: I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1. Furthermore, analysis of codon usage bias of RVA G2P[4] genotype revealed that a correlation between the codon usage bias and base composition exists, suggesting that the mutational pressure is the main factor in determining the codon usage bias in human RVA.