Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T01:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pivetta_LucianeBeneditaDuarte_M.pdf: 4595229 bytes, checksum: 95f48747caf7eb8ddce4f6ccacc9d5d4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Sorovariedades patogênicas de Salmonella enterica constituem um problema de saúde global, que abrange desde gastroenterites até doenças sistêmicas, sendo que ambas podem ser letais. Linhagens atenuadas de S. enterica são promissoras como vacinas vivas, pois são facilmente administradas via oral e capazes de induzir o sistema imune sistêmico e de mucosas do hospedeiro. Além disso, apresentam o potencial de atuar como vacinas multifatoriais, expressando antígenos de outros agentes infecciosos. Neste trabalho, linhagens recombinantes de Salmonella enterica foram construídas e a atenuação da virulência e a estimulação do sistema imune foram avaliadas no modelo murino da salmonelose. As linhagens recombinantes foram desenvolvidas a partir do sistema de recombinação homóloga ?Red, com a deleção de um ou mais genes com efeitos pleiotrópicos na virulência de Salmonella. Após a confirmação da deleção do gene alvo por PCR, as linhagens foram transduzidas com o bacteriófago P22, visando eliminar possíveis problemas com a integridade de lipopolissacarídeos. Posteriormente, caracterizações fenotípicas foram realizadas, por meio de curvas de crescimento in vitro, verificação da capacidade de invasão e sobrevivência no interior de macrófagos e resistência a espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. A atenuação da virulência das linhagens foi avaliada in vivo por meio de inoculações orais e intraperitoneais em camundongos BALB/c/AnUnib e a dose letal média também foi estabelecida. Variados níveis de atenuação foram atingidos e dentre as linhagens desenvolvidas, a duplo mutante para os genes hupA e hupB foi a que apresentou os resultados mais promissores. Nos ensaios de proteção e desafio, 100% dos animais vacinados com duas doses da linhagem 'delta'hupA'delta'hupB sobreviveram ao desafio com doses letais da linhagem selvagem. Para a linhagem duplo mutante também foi verificada a capacidade de colonização bacteriana no sangue, placas de Peyer e baço, assim como a produção de anticorpos IgG e IgA. A obtenção de uma linhagem atenuada, porém capaz de induzir com eficácia o sistema imune do hospedeiro é idealmente almejada no desenvolvimento de uma vacina viva. No entanto, atingir esse balanço é um desafio, já que a deleção de genes de virulência de Salmonella acarreta em diferentes níveis de atenuação, mesmo quando os genes são intimamente relacionados. Uma perspectiva futura é o refinamento das linhagens atenuadas por meio da introdução de antígenos heterólogos e de um sistema de expressão regulado, com o estabelecimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Pathogenic Salmonella enterica serovars are the cause of a global health problem that ranges gastroenteritis to lethal systemic disease. Attenuated strains of Salmonella enterica are promising as live vaccines because they are orally administrated and capable of inducing a mucosal and systemic immune response in the host. Besides, they can act as multifactorial vaccines delivering antigens from other diseases. In this work, attenuated strains of Salmonella enterica were produced and the attenuation of the virulence and the induction of an immunologic response were evaluated in the murine model of salmonellosis. The recombinant strains were constructed using the ?Red system of homologous recombination deleting one or more genes with pleiotropic effects on Salmonella virulence. After that, a PCR to confirm the deletion of the target gene was made and the strains were transduced with bacteriophage P22 to avoid problems with lipopolysaccharide's integrity. Phenotypic characterization as the in vitro growth curve of the strains, the resistance to ROI and RNI species and the ability of survival inside J774 macrophages cultures were performed. The attenuation of the strains was evaluated in vivo trough oral and intraperitoneal inoculations of the strains into BALB/c/AnUnib mice and the median lethal dose was also established. Many levels of attenuation were reached and among the developed strains, the double mutant strain for the genes hupA and hupB was the one with the best results. In the protection and challenge assays, 100% of the animal vaccinated with two doses of the 'delta'hupA'delta'hupB strain survived to the challenge with lethal doses of the wild type strain. For this strain it was also verified the capacity of colonization into blood, peyer's patches and spleen as well as the production of IgG and IgA antibodies. In the developmente of a live vaccine it is ideal to have a strain that is attenuated but still capable of inducing an immune response in the host. Reaching this balance is a challenge and the deletion of virulence genes in Salmonella entails different levels of attenuation although they are closely related. A future prospect is the improvement of these attenuated strains with the insertion of controlled expression systems and heterologous antigens, creating a multifactorial vaccine / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T14:18:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abramczuk_BeatrizMariana_M.pdf: 2595424 bytes, checksum: 3e48454d94d95b8537effc850770b330 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Uso de antiretrovirais pela gestante, parto cesárea na 38ª semana de gestação, administração intravenosa de zidovudina durante o parto e por via oral para o recém-nascido além de não aleitamento materno são medidas empregadas com sucesso para reduzir a transmissão vertical do HIV. Essas recomendações, associadas ao ambiente intrauterino alterado pela infecção materna, interferem no crescimento e desenvolvimento do feto/embrião podendo levar a disfunção mitocondrial e alterações hematológicas e imunológicas. O presente trabalho incluiu, no estudo referido como capítulo I, 33 lactentes com exposição vertical ao HIV não infectados (ENI) e 47 lactentes não expostos ao vírus (NE) e, no estudo referido no capítulo II, 51 ENI e 112 NE, todos com mediana de idade de 7 meses. Comparamos ENI e NE em relação ao peso de nascimento, à contagem de linfócitos TCD3, TCD4+, TCD8+, CD3-CD16+CD56+ (natural killer), atividade citotóxica de células mononucleares do sangue periférico para células tumorais K562 e resposta humoral para as vacinas hepatite B, difteria e tétano (Instituto Butantan-SP, Brasil). Os resultados mostram baixo peso ao nascimento e reduzida contagem de linfócitos TCD3, TCD4+ e TCD8+ entre os lactentes do grupo ENI. Resultados inéditos desse estudo foram uma reduzida resposta protetora à vacina da hepatite B, títulos baixos de anticorpos IgG para o toxóide tetânico e normais para o toxóide diftérico para os lactentes ENI. Além disso, encontramos para esse grupo uma contagem normal de células natural killer e preservada atividade citotóxica de células mononucleares do sangue periférico. Concluímos que o grupo de lactentes jovens ENI apresenta baixo peso ao nascer e alteração no desenvolvimento da imunidade adaptativa, necessitando de orientação específica para o calendário de vacinação. / Abstract: Use of antiretroviral drugs by the pregnant woman, cesarean delivery at 38 weeks of gestation, intravenous zidovudine during delivery and orally to the newborn, in addition to not breastfeeding, are recommendations used successfully to reduce vertical transmission of HIV. These recommendations, coupled with the intrauterine environment altered by maternal infection, interfere with growth and development of the fetus/ embryo and may lead to mitochondrial dysfunction and hematological and immunological changes. In the study referred to as Chapter I were included 33 HIV-exposed uninfected infants (HEU) and 47 healthy infants not exposed to the virus (NE) and in the study referred to as Chapter II, 51 ENI and 112 NE, all of them with median age of 7 months. We compared HEU and NE with respect to birth weight, TCD3 lymphocyte, CD4+, CD8+ and CD3-CD16+CD56+ (natural killer) counts, cytotoxic activity of peripheral blood mononuclear cells against tumor cells K562 and humoral response to hepatitis B, diphtheria and tetanus vaccine (Instituto Butantan, SP, Brazil). The results show low birth weight and reduced lymphocyte count TCD3, CD4 + and CD8 + among infants of the HEU group. Inedited results of this study were a reduced protective response to hepatitis B vaccine, lower antitetanus titres of and normal anti-diphtheria titres for the HEU infants. Furthermore, we observed to the HEU group a normal count of natural killer cells and preserved cytotoxic activity of the peripheral blood mononuclear cells. We conclude that the group of HEU young infants has a low birth weight and changes in the development of adaptive immunity, requiring specific guidance for the vaccination schedule. / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Submitted by Bianca Neves (oliveirabia1@ymail.com) on 2016-04-20T18:38:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alex Sander Rodrigues Nogueira- reprodução parcial.pdf: 161115 bytes, checksum: 3caf890689ff035dfb2d21540b375365 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-04-25T17:49:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alex Sander Rodrigues Nogueira- reprodução parcial.pdf: 161115 bytes, checksum: 3caf890689ff035dfb2d21540b375365 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-04-25T17:53:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alex Sander Rodrigues Nogueira- reprodução parcial.pdf: 161115 bytes, checksum: 3caf890689ff035dfb2d21540b375365 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T17:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alex Sander Rodrigues Nogueira- reprodução parcial.pdf: 161115 bytes, checksum: 3caf890689ff035dfb2d21540b375365 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / Não informada / The bovine anaplasmosis is a disease characterized by severe anemia, fever, weight loss, decreased milk production, abortion and death in the animals. It is caused by A. marginale and transmitted by ticks, leading severe economic losses in cattle production and hence strategies for developing vaccines are essential to minimize its impact. In this study, a chimeric protein was produced by synthetic DNA, carrying sequences of predicted epitopes from OMP7, OMP9 and MSP1a, and used as vaccine emulsified with ISA adjuvant. After three doses, Balb/c mice were challenged with 3x105cel/mL A. marginale UFMG2 to assess proctetion of compound MSP1a/OMP7/9+ISA. There were not body weight alterations neither clinical signs were observed in immunized mice. Bacteremia count showed drastic reduction and discrete alteration on erythrocyte morphology (spherocytes) in vaccined mice 56th day after challenge. No alteration was observed in hematologic data in relation to infected control mice. The evaluation obtained in this study showed the importance of the MSP1a /OMP7/9 protein in the immune response of the Balb/c and your applicability potential in the recombinant vaccine production. / A anaplasmose bovina é uma enfermidade causada por uma rickettsia denominada Anaplasma marginale (A. marginale) transmitida por carrapatos e a doença se caracteriza por anemias, febre, perda de peso, diminuição da produção de leite, aborto e morte nos animais. A doença causa perdas econômicas na produção de gado e por isso estratégias para o desenvolvimento de vacinas é imprescindível para minimizar seu impacto. Neste estudo uma proteína recombinante de A.marginale foi produzida a partir de uma estratégia inovadora de utilizar DNA sintetico para codificar os epítopos dos principais antígenos de A.marginale. Após a clonagem em pGEM e subclonagem em pHT43, a proteína quimérica foi expressa em Escherichia coli contendo epítopos dos antigenos OMP7/9 (outer membrane protein 7/9) e MSP1a (major surface protein 1a). A antigenicidade foi comprovada pela reatividade da proteina recombinante com soro de bezerro com anaplasmose, e a imunogenicidade e proteção vacinal foi comprovada em camundongos Balb/c. Com uma fórmula composta com adjuvante oleoso (MSP1a/OMP7/9+ISA), animais receberam três (3) doses vacinais e desafiados com 3x105cel/mL de A. marginale UFMG2. Os animais imunizados não apresentaram variação de peso corporal nem sinais clínicos da doença, porém houve redução significativa da carga bacterêmica nos vacinados (p<0,0008) comparados com grupos placebos. Além disso, não houve alterações hematológicas como aumento no número de monócitos (p<0,005), neutrófilos (p<0,05) e leucocitose (p<0,05), verificadas nos controles infectados. As avaliações deste trabalho demonstraram a importância da proteína recombinante MSP1a/OMP7/9 na melhoria da resposta imunológica de Balb/c e sua potencial aplicabilidade na produção de vacinas recombinantes.

Introdução: As ações de imunização merecem destaque mundial pelo grande impacto do uso de vacinas na prevenção das doenças imunopreveníveis. A necessidade de um diagnóstico da prevalência de perdas vacinais constitui uma etapa fundamental para o gerenciamento de vacinas no município, permitindo organizar adequadamente o sistema, evitando assim desperdícios dos recursos públicos. Objetivo: Diagnosticar e caracterizar as perdas vacinais das Unidades Básicas de Saúde da Região Oeste do município de São Paulo. Método: Trata-se de um estudo descritivo, retrospectivo, quanti-qualitativo, no qual foi utilizado como abordagem metodológica o estudo de caso. A partir dos registros de movimentação de imunobiológicos e relatórios de doses aplicadas do ano de 2015, foi calculada a taxa total das perdas, prevalência das perdas técnicas, prevalência de perdas físicas e os motivos das perdas físicas, prevalência das perdas não categorizadas e a razão das doses aplicadas por doses utilizadas. Foram realizadas entrevistas com os funcionários das salas de vacina, das UBSs da Região Oeste do município de São Paulo. Resultados: A taxa total de perdas foi de 71,3 %, a prevalência de perda técnica 18,6% e a prevalência de perda física 28,4 %. Dentre os motivos das perdas físicas, obteve-se destaque para a falta de energia elétrica, representando 18,4 % das mesmas; as perdas não categorizadas totalizaram 24,2 %. Quanto à razão de doses aplicadas, por doses utilizadas, a vacina que apresentou o maior percentual de perdas foi a vacina BCG, visto que para cada dose aplicada foram perdidas 4,86 doses. Nas entrevistas realizadas com os profissionais que trabalham nas salas de vacina, observou-se que 60% deles acreditavam que a maior causa de perda vacinal em sua unidade se devia à perda técnica. Já 36,67 % referiram que a maior causa de perda se deveu às perdas físicas, causada por falta de energia elétrica. Os profissionais apontaram sugestões para minimizar as perdas vacinais; 50 % dos entrevistados relataram que a presença de vacinas unidoses amenizaria as perdas, 46,67 % dos profissionais sugeriram a existência de gerador elétrico e 16,67 % sugeriram o agendamento de vacinas com maior percentual de perda técnica. Conclusão: Os resultados demonstraram que a taxa total de perdas vacinais na Região Oeste do município de São Paulo foi de 71,3 % e na avaliação da prevalência de perdas, obteve-se uma maior prevalência de perdas físicas. Já na opinião dos profissionais entrevistados, a maior causa de perdas deveu-se às perdas técnicas. O presente trabalho propiciou a realização de uma cartilha educativa, que propõe ações que visem diminuir as perdas vacinais nas UBSs da Região Oeste do município de São Paulo. Essa cartilha será apresentada aos órgãos da Secretaria Municipal da Saúde de São Paulo, a saber: Coordenadoria de Saúde da Região Oeste (SUVIS Oeste) e Gerência de Imunização (COVISA). / Introduction: Immunization actions deserve worldwide focus due to the great impact of the use of vaccines in the foresight of immune preventable diseases. The need of prevalence of vaccine losses diagnosis constitutes a fundamental step for the vaccines management in the city, allowing the system adequate organization, therefore avoiding public resources waste. Objective: To diagnose and feature the vaccine losses at the basic health units of Sao Paulo\'s Western Area. Method: This is a descriptive, retrospective, quantitative-qualitative study, where the case study was used as a methodological approach. The total loss rate, the technical losses prevalence, the physical losses prevalence and the physical losses reasons proportion, the unclassified losses prevalence and the dose ratio applied by the doses used were calculated from the immune-biological records movement and dose reports for the year 2015. Interviews were carried out with the employees of the basic health units\' vaccine rooms of Sao Paulo\'s Western Area. Results: The total losses prevalence was of 71.3%, the technical loss prevalence was of 18.6%, the physical loss prevalence was of 28.4%. Of the reasons for physical loss, the lack of electricity represents 18.4%. Non-categorized losses totaled 24.2%. Regarding the dose ratio applied by doses used, the vaccine that presented the highest percentage was the BCG vaccine, for each applied dose there is a loss of 4.86 doses; regarding Yellow Fever vaccine, for each applied dose, 1.63 doses are lost; as for the Triple Viral vaccine, for each applied dose, 1.31 doses are lost. From the interviews with vaccine rooms employees, it was observed that 60% of them believe that vaccine loss greatest reason in their unit is due to technical loss, and 36.67% reported that the greatest cause of loss, it is due to physical loss caused by lack of electricity. The employees gave suggestions to minimize vaccine losses; 50% of the interviewees reported that the presence of unit dose vaccines would reduce losses, 46.67% of the employees suggested the need of an electric generator, and 16.67% suggested scheduling vaccines which have a higher percentage of technical loss. Conclusion: The results showed that the vaccine losses total rate in São Paulo\'s Western Area was of 71.3%, and that in the losses prevalence evaluation, a higher prevalence of physical losses was obtained, as for the opinion of employees interviewed, the greatest cause of loss is due to technical losses. Vaccine losses monitoring is important in order to find new alternatives for the production and distribution of immune-biological agents in order to reduce losses without missing the opportunity to vaccinate. The present work led to the realization of an educational booklet, which will propose actions aimed at reducing vaccine losse at the Health Basic Units of Sao Paulo\'s West Region. This booklet will be presented to Sao Paulo\'s City Health Department agencies, namely: Western Region Health Coordination (SUVIS Oeste) and Immunization Management (COVISA).

Esta tese envolveu o estudo de encapsulação de vacina bivalente contra difteria e tétano de uso adulto (dT) em microesferas de ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA), com o objetivo de desenvolver uma formulação que induzisse uma resposta protetora com um número reduzido de doses, ou preferencialmente de apenas uma dose. Para ter sucesso, uma formulação como tal deve ter um perfil de liberação de antígeno que simule as múltiplas doses que recebem o indivíduo. Assim, nesta tese são mostrados os resultados dos experimentos de caracterização bioquímica e imunológica da formulação citada, sem o uso de estabilizadores protéicos, a fim de reduzir a complexidade do sistema em estudo. Do ponto de vista das proteínas encapsuladas, tal caracterização envolveu estudos de fluorescência, de dicroísmo circular, de atividade antigênica e determinação por HPLC da degradação durante o processo de encapsulação. Do ponto de vista da formulação, foram realizados ensaios de degradação in vitro e de atividade imunogênica in vivo, em camundongos e cobaias. Os dados obtidos indicaram que a encapsulação em microesferas de PLGA de vacina dT, sem o uso de estabilizadores, permitiu a produção de uma formulação vacinal viável, capaz de estimular uma resposta imunológica protetora e de memória, abrindo caminho para o desenvolvimento da tecnologia de produção de vacinas polivalentes encapsuladas em microesferas de PLGA. / The study on encapsulating a bivalent single dose vaccine against diphtheria and tetanus for adults (dT) within PLGA microspheres is described in this thesis. A successful single dose vaccine must show an antigen release profile mimicking the several doses a person should receive during the life. Therefore, results from the immunological and biochemical characterization of the formulation, prepared without protein stabilizers, is showed here. From the encapsulated protein point of view the characterization involved fluorescence, circular dichroism, antigenicity and HPLC analysis. From the formulation point of view, there were performed in vitro release assays and immunogenicity on mice and on guinea-pigs. The results indicated that the dT microencapsulation within PLGA microspheres without protein stabilizers lead to the production of a viable vaccine formulation, able to elicit protective and memory immune response.

O Streptococcus pneumoniae, também conhecido como pneumococo, é um importante agente etiológico causador de pneumonia, bacteremia, meningite e otite aguda do ouvido médio, acometendo especialmente crianças e idosos. A cápsula polissacarídica (PS) é o fator de virulência mais importante e localiza-se na superfície do microrganismo e tem ação anti-fagocítica in vivo. O pneumococo expressa pelo menos 91 cápsulas diferentes, que são química e sorologicamente distintas. Usualmente, a cápsula é o antígeno das vacinas anti-pneumocócicas, tanto como polissacarídeo livre ou conjugado a proteínas. O sorotipo 6B acomete principalmente crianças e é o segundo mais prevalente no Brasil, e a otimização das condições de cultivo buscando maior produtividade em PS é o alvo desta tese. Simultaneamente, também foi investigada a influência do inóculo e da glicose residual no instante do pulso ou do início da alimentação em cultivos descontínuos alimentados. Nos cultivos descontínuos alimentados foi observado que quanto menor a densidade óptica da cultura do inóculo, maior a concentração de PS obtida. A concentração da glicose residual no momento do pulso provavelmente influenciou a produção de PS: a produção foi maior quando o pulso foi dado ainda em altas concentrações de substrato. Por isso, obteve-se uma produção de PS ~390 mg/L em cultivo descontínuo alimentado com pulso, quando DO 600 nm da cultura do inóculo ~1,6 e o pulso de glicose e acetato de amônio ~15 g/L. Observou-se também que, mesmo com DO do inóculo ~1,65, a produção de PS foi somente 248 mg/L, devido à aplicação do pulso quando a concentração de glicose residual era ~4,5 g/L. A menor produção de PS foi obtida quando a DO da cultura do inóculo foi ~2,6 e a concentração de glicose residual ~3,4 g/L, gerando somente 194 mg/L de PS. Assim, cultivos descontínuos alimentados com pulso renderam melhores resultados que os cultivos descontínuos alimentados. A alimentação constante rendeu maior quantidade de PS quando comparada à alimentação exponencial. E tanto os ensaios descontínuos com ou sem pulso e os descontínuos alimentados foram melhores do que os cultivos contínuos, principalmente se considerarmos a facilidade de operação. O efeito da concentração residual da glicose no instante da alimentação na produção de PS é provavelmente influenciado pela presença de outros componentes do meio, devido aos requerimentos nutricionais do pneumococo. O estado fisiológico do inóculo determinou uma importante correlação entre a produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados do sorotipo 6B: cultura do inóculo no meio da fase exponencial rendeu maior produção de PS. Esta correlação poderia ser conseqüência do perfil de crescimento do microrganismo in vitro e da ação de enzimas líticas após a fase exponencial. Foi observado, portanto, um efeito sinérgico entre a DO da cultura do inóculo, a concentração de glicose residual no momento de alimentação e produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen commonly responsible for pneumonia, bacteraemia, meningitis and otitis media, especially among young children and older adults. The most prominent pneumococcal virulence factor is the capsular polysaccharide (PS), which coats the surface of the bacterium and acts as an antiphagocytic factor in vivo. S. pneumoniae express at least 91 distinct capsules which are chemically and serologically distinct. The capsule is currently used as antigen in pneumococcal vaccines, either as free polysaccharide or conjugated to proteins. Pneumococcal serotype 6B is the second most prevalent in Brazil and the optimization of cultivation conditions is part of this study. Simultaneously we investigated the influence of the growth phase of the inoculum and the residual glucose concentration at the instant of the pulse or the start of feeding on PS production in batch and fed-batch cultivation. Streptococcus pneumoniae serotype 6B strain ST 433/03 was used. Bench scale experiments were carried out using a variant of the Hoeprich medium, containing glucose, acid-hydrolyzed casein, dialyzed yeast extract, L-glutamine and asparagine as nitrogen sources, choline as a growth factor and salts. The experiments were conducted in bioreactors monitored by the LabView 7.1program. It was observed in fed-batch cultivation, that the lower was the OD of the starter culture, the higher was the PS concentration obtained. The residual glucose concentration at the moment of the pulse also influenced the PS production: the PS production was higher when the pulse was given at higher residual glucose concentration. Hence, in fed-batch culture the highest PS production (387 mg/L) was obtained using an OD=1.6 of the starter culture and giving the pulse when the residual glucose was ~15 g/L. Using a similar inoculum (OD=1.65), the PS concentration reached 248 mg/L after giving the pulse when the residual glucose was 4.5 g/L. The lowest PS production was obtained when a culture with an OD=2.6 was inoculated into the reactor and the pulse was given when the residual glucose was 3.4 g/L (PS=194 mg/L). The effect of the residual glucose concentration at the instant of the start of feeding on PS production was probably influenced by the presence of other components in the concentrated feeding medium, which could better fit the nutritional requirements of the microorganism. The physiological state of the inoculum showed an important correlation to the PS production in batch and fed-batch cultivation of S. pneumoniae serotype 6B: mid-log phase inocula yielded high PS production. This correlation is consequence of the in vitro growth profile, the action of lytic enzymes after the log phase. In fed-batch cultivation, it was also observed a synergic effect of the inoculum OD and the residual glucose concentration in the moment of the pulse on PS production.

As formulações vacinais contra o Vírus Respiratório Sincicial Humano, HRSV, estão associadas à indução de eosinofilia pulmonar mediada por uma resposta de células TCD4+ Th2, após exposição ao HRSV selvagem. Foi identificado um peptídeo da proteína viral G, que modificado perde a capacidade de predispor à eosinofilia, tornando-o um imunógeno atraente. Células T CD8+ específicas para HRSV reduzem a resposta Th2, mediam resistência a desafio com o vírus, e estão relacionadas à redução dos sintomas. Assim, neste trabalho buscamos e identificamos epítopos de células TCD8+ na polimerase viral, utilizando programas de predição, imunização com peptídeos e avaliação da resposta celular. Também construímos vacinas de DNA contendo a seqüência nucleotídica do peptídeo da proteína G modificado. A caracterização da resposta imune estimulada por essas vacinas e por peptídeos purificados revelou que o plasmídio pTGMCTB, bem como os peptídeos GM e GMCTB, foram capazes de induzir anticorpos que, porém, não se mostraram neutralizantes de HRSV e protetores frente a desafio. / Vaccines against human respiratory syncytial virus (HRSV) are associated with pulmonary eosinophilia induction mediated by a TCD4+ Th2 response, after exposition to wild HRSV. A peptide from the viral protein G was identified to predispose to eosinophilia and loses this ability when mutated, making it an interesting immunogen. CD8+ T cells specific to HRSV reduce the Th2 response, mediate resistance to virus challenge, and are related to symptom-reduction. Thus, in the present work, we searched for and identified CD8+ T cell epitopes in the viral polymerase; using prediction programs, peptide immunization and evaluation of the cellular response. We also constructed DNA vaccines containing the nucleotide sequence of the mutated peptide from G protein mentioned above. The characterization of the immune response elicited by these vaccines and purified peptides showed that the pTGMCTB plasmid, as well as GM and GMCTB peptides were able to induce antibody response; however they are not neutralizing and protective against HRSV challenge.

O principal problema no desenvolvimento de vacinas de segunda geração é a baixa resposta contra os antígenos, geralmente extremamente purificados. Isto tem levado à busca de novos adjuvantes que sejam mais eficientes e menos tóxicos. Este trabalho objetivava o estudo de uma proteína de choque térmico de Mycobacterium leprae - 18kDa-hsp - recombinante, produzida em levedura, veiculada em lipossomos, como modelo de proteína carregadora para antígenos fracos. Além de um estudo de estabilização de lipossomos por liofilização. A 18kDa-hsp apresenta certas características peculiares que levaram ao desenvolvimento de um método de dosagem próprio e extensível a outras proteínas com baixo teor em aminoácido cromóforos. Tendo uso potencial como proteína carregadora, a 18kDa-hsp é estável, suportando bem aquecimento, liofilização, acilação e associação com lipossomos de fosfolípides, sem perda significativa de sua atividade. Estudos paralelos de estabilização de lipossomos unilamelares mostraram que se pode usar trealose como crioprotetora no processo de liofilização-reidratação, sem perdas significativas do conteúdo dos lipossomos e com manutenção das estruturas das vesículas. Finalmente, o sistema lipossomos-18kDa-hsp mostra-se promissor como um sistema estável para veiculação de imunógenos fracos. / The major problem on development of second generation vaccines is the poor response against some immunogens. It has leading an intense research to find other substances non toxic and more efficient on enhancement of the immunological response. The aim of this work was the study of a heat-shock protein from Mycobacterium leprae - 18kDa-hsp - produced in yeast and vehiculated in liposomes, as a protein carrier model for weak immunogens. Furthermore, there was a study on stabilization of liposomes by lyophilization. The peculiar protperties of the 18kDa-hsp lead us to develop a new method for quantification that can be extended to other proteins with low chromophore content. Potentially a carrier protein, the 18kDa-hsp is very stab1e: it has no significant loss of its antigenic reactivity when heated, lyophilized, acylated and associated to liposomes. Parallel studies on liposomes stabilisation show trehalose as a good cryoprotector. The sugar can avoid the leakage of the entrapped marker (protein) and maintain the vesicles structures on the lyophilisation-rehydration processo Finally, the system liposomes-18kDa-hsp is promising for vehiculation of weak immunogens.

Orientadores: Ubirajara Ferreira, Valéria Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_LeonardoOliveira_D.pdf: 2126558 bytes, checksum: 304094622429151dac9d10d151c9e58b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O tratamento do câncer de bexiga urotelial não músculo invasivo (CBNMI) com Bacilo Calmette-Guerin (BCG) tem efeito comprovado na redução de recidiva tumoral, embora ocorram efeitos colaterais de intensidades variadas, desde sintomas irritativos leves até reação sistêmica grave e o impacto na progressão tumoral seja controverso. Neste cenário a enterotoxina B do Staphylococcus aureus (EBS) destaca-se como alternativa promissora na terapêutica do CBNMI. Assim, os objetivos principais do presente estudo foram comparar e caracterizar os efeitos morfológicos, antiangiogênicos e o balanço entre proliferação e apoptose das imunoterapias com BCG, EBS e BCG-EBS no tratamento do CBNMI de ratos induzidos quimicamente. Um total de 75 ratas da linhagem Fisher 344 foram utilizadas. Para a indução do câncer, 60 animais foram anestesiados e receberam uma dose intravesical de 1,5mg/kg de N-metil-N-nitrosouréia (MNU) a cada 15 dias, nas semanas 0, 2, 4 e 6 (4 doses). Os outros 15 animais receberam 0,3ml de solução fisiológica intravesical e constituíram o grupo Controle (CT). Após o período de indução com MNU, os animais foram divididos em 5 grupos (15 animais cada): grupo MNU: recebeu o mesmo tratamento que o grupo CT - 0,3 ml de solução fisiológica intravesical; grupo BCG: recebeu dose intravesical de 106 UFC (2x106 UFC/mg) de BCG; grupo EBS: recebeu dose intravesical de 10?g/ml de EBS; grupo BCG-EBS: recebeu tratamento simultâneo com BCG e EBS nas mesmas concentrações que nos grupos BCG e EBS; todos por 6 semanas consecutivas. Após 15 semanas de protocolo, os animais foram sacrificados e as bexigas urinárias coletadas e submetidas às análises histopatológica, imunohistoquímica e Western Blotting. Os resultados demonstraram que as alterações histopatológicas mais frequentes em cada grupo foram carcinoma papilífero e carcinoma in situ no grupo MNU, hiperplasia papilífera nos grupos BCG e EBS e hiperplasia plana no grupo BCG-EBS. Não houve toxicidade relevante. Os índices apoptótico e proliferativo foram aumentados em todos os grupos de tratamento. Contudo, esses índices foram menores nos grupos BCG, EBS e BCG-EBS em relação ao grupo MNU. Intensas imunorreatividades para VEGF, MMP-9 e IGFR-1 foram verificadas no grupo MNU; moderadas nos grupos BCG e EBS; e fracas nos grupos BCG-EBS e Controle. Em contraste, intensa imunorreatividade para endostatina foi verificada nos grupos Controle e BCG-EBS em relação aos demais grupos experimentais. Assim, pode-se concluir que o tratamento associado BCG-EBS foi mais eficaz em restaurar o equilíbrio entre os processos de apoptose e proliferação celular e as alterações histopatológicas do que os tratamentos isolados com BCG e EBS. Além disso, a diminuição da proliferação celular e das alterações histopatológicas correlacionaram-se com o aumento da reatividade para endostatina e diminuição das reatividades para VEGF, IGFR-1 e MMP-9. A associação entre BCG e EBS abre uma nova perspectiva terapêutica no CBNMI / Abstract: PURPOSE: Compare and characterize effects of intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG), Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) and BCG plus SEB treatments in the non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). METHODS: Seventy-five female Fisher 344 rats were anesthetized and 15 of them received 0.3 ml of saline (Control group), 60 animals received 1.5 mg/kg dose of N-methyl-N-nitrosourea (MNU), all intravesically every other week for 6 weeks. The rats were divided into 5 groups: MNU and Control groups received 0.3 ml of saline; BCG group received 106 CFU dose of BCG; SEB group received 10 ?g/ml dose of SEB and BCG-SEB group received simultaneous BCG and SEB, all intravesically for 6 weeks. After 15 weeks, all urinary bladders were collected for histopathological, immunological and Western Blotting analyses. RESULTS: Papillary carcinoma (pTa) and high-grade intraepithelial neoplasia (carcinoma in situ) were more often in MNU group, papillary hyperplasia in BCG and SEB groups and flat hyperplasia in BCG-SEB group. No significant toxicity was observed. Apoptosis and cellular proliferation indexes decreased in BCG, SEB and BCG-SEB groups compared to MNU group. Intensified VEGF, MMP-9, Ki-67 and IGFR-1 immunoreactivities were verified in the MNU group; moderate in the BCG and SEB groups; and weak in the BCG-SEB and Control groups. In contrast, intense endostatin immunoreactivity was verified in the Control and BCG-SEB groups. CONCLUSIONS: BCG and SEB presented similar anti-angiogenic effects. BCG-SEB treatment showed an additional activity compared to monotherapy, being more effective in restoring apoptosis and cellular proliferation balance, correlating with increased endostatin and decreased VEGF, MMP-9, Ki-67 and IGFR-1 reactivities / Doutorado / Fisiopatologia Cirúrgica / Doutor em Ciências

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MarcosHenriquede_M.pdf: 1961086 bytes, checksum: 56f96f9d1cad5160a5c9417fc809b09e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Salmonella enterica é uma bactéria Gram-negativa classificada em diferentes sorovariedades que podem causar desde gastroenterites a infecções sistêmicas. A sorovariedade Enteritidis é predominante nos casos de salmonelose em humanos, tendo produtos derivados do frango como principal fonte de infecção. Uma forma de se controlar infecções por Enteritidis é através da vacinação de frangos, uma estratégia já utilizada, porém com limitações, pois estas vacinas muitas vezes são inativadas ou possuem origem de atenuação desconhecida. Outra limitação é a falta de estudos específicos para Enteritidis, pois maior parte dos estudos feitos com S. enterica se baseiam na sorovariedade Typhimurium. Um alvo para a construção de linhagens vacinais são os genes codificadores de Nucleoid Associated Proteins que são proteínas que se ligam ao DNA alterando sua topologia, afetando a transcrição global dos genes. Neste projeto realizamos a construção de mutantes nulos de S. enterica Enteritidis para alguns destes genes com a finalidade de avaliar seu potencial vacinal e papel na patogênese. As linhagens foram testadas no modelo de infecção sistêmica e de inflamação do ceco. No modelo de infecção sistêmica, a linhagem selvagem e ?fis se apresentaram virulentas ou pouco atenuadas enquanto as linhagens ?ihfA e ?ihfB foram atenuadas. Os testes de proteção foram feitos com os dois mutantes atenuados que induziram 100% de proteção. A linhagem selvagem e o mutante pouco atenuado induziram inflamação neste modelo, mas o mutante induziu de forma mais amena. Analises morfométricas futuras irão elucidar com mais clareza o papel deste gene na inflamação. Este projeto teve como principais realizações: (i) a construção de duas linhagens atenuadas, com alto potencial para uso vacinal e (ii) abriu novas possibilidades para o estudo nas NAP's durante a patogênese de diferentes sorovariedades / Abstract: enterica is a Gram-negative bacterium classified in different sorovars which may causes gastroenteritis and systemic infections. The serovar Enteritidis is responsible for most of the cases of salmonellosis in humans and have poultry based products as its main source of infection. Poultry vaccination has been and effective strategy to control Enteritidis infections and it's already applied, but with limitations, because the vaccines sometimes are inactivated or are attenuated by unknown mechanisms. Another limitation is the lack of studies especific to Enteritidis, most of the research related to S. enterica is based on serovar Typhimurium. A target to vaccine strains development are the genes members of the group called Nucleoid Associeted Proteins, which are proteins that bind to DNA changing its topology and affecting global gene transcription. In this project, we constructed S. enterica null mutants to some of these genes aiming the evaluation of their vaccine potential and and role in pathogenesis. The strains were tested with the systemic infection model and cecum inflamation. In the systemic infection model, the wild and ?fis strain were virulent while the ?ihfA and ?ihfB were attenuated. The protection essays were made with attenuated mutants and provided 100% of protection. The wild and ?fis strains lead to inflammation in this model, but the mutant induced a mild inflammation, morfometrics analysis will clarify the role of this gene in inflammation. This project have as main outcomes: (i) the construction of strains, ?ihfA and ?ihfB, with good potential to be used as vaccines; (ii) New possibilities to the role of fis gene during inflammation / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular