Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / É importante compreender que para melhorar a questão da saúde pública é necessário produzir produtos com qualidade e em quantidade para atender às demandas públicas nacionais e internacionais. Para isso, é preciso desenvolver o complexo produtivo de bens e serviços de saúde. Diante da pressão do ambiente político e institucional em que o complexo econômico industrial da saúde está inserido, associado à necessidade de geração de novos produtos e da incerteza decorrente da globalização, a inovação tecnológica torna-se hoje elemento essencial para a obtenção de vantagem competitiva e sobrevivência das empresas. No caso de Bio-Manguinhos, o aprimoramento do controle e processos de produção da vacina febre amarela, com vista a atender os pré-requisitos necessários para a obtenção da certificação internacional, contribuiu significativamente para o fortalecimento das vantagens competitivas da organização. Em 2001, Bio-Manguinhos foi certificado pela Organização Mundial da Saúde para exportar a vacina febre amarela 5 e 50 doses. A certificação internacional foi obtida devido ao planejamento de longo prazo e à implementação de um rigoroso sistema de garantia da qualidade. Foram a melhoria e aperfeiçoamento dos processos de controle de qualidade e dos procedimentos de produção, que proporcionaram a entrada de Bio-Manguinhos no mercado externo de vacinas. Com a certificação, Bio-Manguinhos alcançou o reconhecimento mundial pela sua qualidade, garantindo com isso a sua competitividade no setor. Este trabalho teve por objetivo avaliar o ganho que a unidade obteve em função do procedimento para se obter esta certificação - processo esse chamado de pré qualificação - e o impacto da certificação internacional em inovações de processos, produtos e estrutura organizacional. / It is important to understand that in order to improve the public health system it is necessary to produce high quality products and in quantities to meet the national and international public demand. For this, we must develop and innovate in the goods and health services production complex. Under the pressure of political and institutional environment in which the health and economic-industrial complex is in, with the need to introduce new products and the uncertainty concerning globalization, technological innovation is nowadays essential to achieve competitive advantage and for survival of the companies. Regarding Bio-Manguinhos, the improvement of the control and production processes of yellow fever vaccine, in order to meet the pre-requisites necessary for obtaining the international certification, contributed significantly for the strengthening of internal competitive advantages. In 2001, Bio-Manguinhos was certified by the World Health Organization to export yellow fever vaccine 5 and 50 doses. The international certification was obtained due to longterm planning and the implementation of a rigorous quality system. It was with the improvement and development of quality control and production procedures, which provided the access of Bio-Manguinhos in the global vaccine market. With the certification, Bio-Manguinhos has achieved worldwide recognition for its quality, ensuring its competitiveness in the sector. The objective of this study was to evaluate the gain that Bio-Manguinhos obtained due to the certification procedure – this process is also known as pre-qualification - and the impact of international certification in innovating processes, products and organizational structure.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T17:52:45Z No. of bitstreams: 1 luiz-antonio-da-cunha.pdf: 2013128 bytes, checksum: 0e5dc52de1e8d6ce612c04c856313ff7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T17:52:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luiz-antonio-da-cunha.pdf: 2013128 bytes, checksum: 0e5dc52de1e8d6ce612c04c856313ff7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Um acordo internacional de transferência de tecnologia, firmado em 2003, entre a FIOCRUZ e a GlaxoSmithKline permitiu o acesso de Bio-Manguinhos a um moderno processo produtivo da vacina tríplice viral (TVV) contra o sarampo, a caxumba e a rubéola. A produção dessa vacina é parte do compromisso de Bio-Manguinhos com o programa nacional de auto-suficiência em imunobiológicos, tido como uma meta prioritária da política de saúde pública do governobrasileiro. A tecnologia aplicada para a produção da TVV envolve o uso de células MRC-5 como substrato celular para a produção de vírus vacinais da rubéola, particularmente da cepa Wistar RA27/3. A estirpe MRC-5 é reconhecida como um dos mais importantes substratos celulares para a produção de vacinas virais, e também tem sido adotada como modelo de estudo para senescência celular in vitro. A senescência celular é um estágio fisiológico complexo pelo qual, invariavelmente, qualquer população de células somáticas normais passa após atingir um determinado número de mitoses. Esseestágio fisiológico é caracterizado nas células diplóides pela contenção da capacidade de se multiplicar e pelo desenvolvimento de alterações morfológicas peculiares, especialmente quando cultivadas in vitro. Com o objetivo de aprimorar omonitoramento de estirpes de células diplóides humanas (HDCS – do inglês Human Diplóide Cells Strains) e contribuir para o estabelecimento da base de conhecimento necessário para a futura aplicação no processo de produção de TVV em Bio-Manguinhos, nós avaliamos culturas de células MRC-5 condicionadas com carnosina, em três diferentes aspectos: cinética de crescimento, propagação da cepa vacinal, Wistar RA27/3, do vírus da rubéola e a expressão do marcador biológico de senescência, a enzima β-galactosidase AS (β-gal AS). A avaliação do potencial antioxidante e antisenescente atribuído a carnosina, um dipeptídeo ubíquo à fisiologia de todos os animais superiores, sobre as células MRC-5 pode contribuir para aprimorar os procedimentos de qualificação e controle de células diplóides associados à produção de vacinas, e aindaservir para o desenvolvimento de novos produtos e a pesquisa científica. Aspectos dacinética de crescimento da cultura de células condicionadas com carnosina, observados neste estudo, são discutidos sob o ponto de vista da teoria do compromisso celular com a senescência. Todas as culturas de células MRC-5 avaliadas demonstraram a expressão da β-gal AS através do uso de X-Gal ou ONPG como substrato. Não encontramos variações no perfil de propagação de cepas vacinais do vírus da rubéola que possam ser associadas ao condicionamento das células MRC-5 com carnosina, nas condições testadas. / An international technology transfer agreement established between FIOCRUZ and GlaxoSmithKline in 2003, will provide Bio-Manguinhos with access to a modern manufacturing process for the production of the triple viral vaccine against measles, mumps and rubella (TVV). The production of TVV forms part of the Bio-Manguinhos commitment to the self-sufficiency national programin immunobiologicals, within the Brazilian government public health prioritized policies. The TVV technology employs diploid cells derived from normal human lung tissue(MRC-5) as the substrate for production of the attenuated rubella vaccine virus,Wistar RA27/3. The MRC-5 strain is one of the most important cellular substrates for viral vaccine manufacturing and in addition is widely used as a model for in vitrostudies of cell senescence. Cellular senescence is a physiological stage which normal somatic cells beyond certain duplication level go through, invariably. Such physiological stage is characterized by growth arrest and specific morphological changes, commonly, observed in diploid cells under in vitroculture environment. Aiming to contribute with the human diploid cells strains (HDCS) monitoring study and line up with the establishment of the necessaryknowledge base for the conduction of the TVV production process in Bio-Manguinhos, weevaluated MRC-5 cell cultures conditioned with carnosine under three different aspects: growth kinetics, propagation of the attenuated strain of rubella virus Wistar RA27/3 and the expression of the senescence bio-marker, SA β-Galactosidase. An evaluation of the antioxidant and antisenescence features attributed to carnosine, a dipeptide, ubiquitous to the physiology of all superior animals, over MRC-5 may contribute to the improvement of the qualification and control procedures in production of vaccines, product development and scientific research. Aspects of the growth kineticsof MRC-5 cells conditioned with carnosine observed in this study are discussed in relation to the cellular commitment theory. All MRC-5 tested demonstrated SA β-Galactosidase activity, as verified by enzyme processing of X-Gal or ONPG used as substrate. Additionally, no variations in the propagation profile of the attenuated rubella virus by treating cells with carnosine could be characterized in this study.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-04-07T11:49:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Danielle_Almeida.pdf: 2650975 bytes, checksum: 80a18514ce2bd91e7361e6eacc16a783 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-04-07T11:49:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Danielle_Almeida.pdf: 2650975 bytes, checksum: 80a18514ce2bd91e7361e6eacc16a783 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-04-07T11:50:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Danielle_Almeida.pdf: 2650975 bytes, checksum: 80a18514ce2bd91e7361e6eacc16a783 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T11:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Danielle_Almeida.pdf: 2650975 bytes, checksum: 80a18514ce2bd91e7361e6eacc16a783 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Vacinas são os únicos meios para interromper a cadeia de transmissão de doenças imunopreviníveis. A vacina tríplice viral (contra sarampo, caxumba e rubéola), fornecida por Bio-Manguinhos, é constituída da mistura dos vírus vivos atenuados do sarampo, caxumba e rubéola. É de grande importância o efetivo controle da qualidade deste produto antes do seu ingresso no mercado, sendo necessária a realização do ensaio de potência biológica com a utilização de uma vacina de referência. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar um lote vacinal como material de referência de trabalho (MRT) candidato (cMRTBio) para ser utilizado na rotina da determinação de potência da vacina tríplice viral em substituição a vacina disponibilizada pela GlaxoSmithKline (GSK) empregada anteriormente.Este estudo foi baseado nas normativas de compêndios que preconizam os estudos de caracterização do lote candidato quanto à homogeneidade e estabilidade, utilizando-se ferramentas estatísticas adequadas,visando à atribuição do seu valor, atendendo aos propósitos desejados e agregando maior confiabilidade aos ensaios de potência realizados pelo laboratório. O lote designado de 131VVA002Z utilizado como cMRTBio apresentou características como integridade, composição e potência em conformidade com as especificações exigidas. No estudo de homogeneidade, os resultados obtidos foram considerados homogêneos intra-frascos e inter-frascos, já que todos os coeficientes de variação obtidos foram inferiores a 10%, estando dentro do limite de aceitação. A potência estimada de cada componente viral do cMRTBio foi de: 3,73 log10 CCID50 / DH para o vírus do sarampo, 4,75 log10 CCID50 / DH para o vírus da caxumba e 3,67 (log10 CCID50 / DH) para o vírus rubéola, estando dentro das especificações previstas. No estudo de estabilidade verificamos um pequeno decaimento de potência, sendo estes valores considerados irrelevantes, uma vez que a potência encontrada ainda se encontrava dentro dos valores determinados para a especificação da vacina. De acordo com os resultados obtidos, verificamos que o cMRTBio apresentou todas as características exigidas para ser utilizado como MRT, sendo este material protocolado na Instituição como MRT(B)TVV001/13. / Vaccines are the only means to interrupt the transmission chain of transmission of immune predictable diseases. The MMR vaccine (measles, mumps and rubella), supplied by Bio-Manguinhos, is composed of a mixture of live attenuated viruses of measles, mumps and rubella. It is of great importance to the effective control of the quality of this product before its market entrance because it is necessary to perform the test of biological power with the use of a reference vaccine. The main objective of this study was to evaluate a batch vaccine as work reference material (MRT) candidate (cMRTBio) to be used in the routine determination of power of the MMR vaccine in replacing the vaccine made by GlaxoSmithKline (GSK), which was previously employed. This study was based on normative compendia that advocate the studies of characterization of candidate batch homogeneity and stability, using appropriate statistical tools, aiming the allocation of its value, taking into account the purposes intended and aggregating greater reliability to tests of power performed by the laboratory. The batch designated as 131AWV002Z used as cMRTBio presented characteristics such as integrity, composition and power in accordance with the required specifications. In the homogeneity study, the results obtained were considered homogeneous intra-bottles and inter-bottles, considering that all coefficients of variation obtained were lower than 10 %, while within the limit of acceptance. The estimated power of each viral component of cMRTBio was: 3.73 log10 CCID50 / DH for the measles virus, 4.75 log10 CCID50 / DH for the mumps virus and 3.67 (log10 CCID50 / DH) for the rubella virus, being within the specifications provided. In the study of stability we noticed a small decay of power, being these values considered irrelevant, since the power found was still within the values determined for the specification of the vaccine. According to the results obtained, we can notice that the cMRTBio presented all the required characteristics to be used as MRT, being this material filed in the Institution as MRT(B)TVV001/13.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 523.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) 2011sousa-rcv.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo Vírus da Hepatite A (HAV) ainda acomete milhões de pessoas em todo o mundo, causando uma doença que pode variar desde um quadro assintomático até casos mais severos. Apesar da existência de vacinas comerciais, produzidas a partir do vírus inativado ou atenuado, elas ainda não estão disponíveis para grande parte da população mundial, em virtude do seu alto custo. Uma alternativa atraente consiste na pesquisa e desenvolvimento de vacinas de DNA, que potencialmente apresentam algumas vantagens em relação a vacinas convencionais como a maior estabilidade, maior segurança e possibilidade de serem produzidas com um menor custo final. Neste trabalho foi realizada a construção, otimização e avaliação da expressão de protótipos vacinais recombinantes, visando o desenvolvimento de uma vacina de DNA contra o HAV. O segmento traduzível do genoma do HAV é composto por: região P1, formada pelas proteínas estruturais VP1, VP2, VP3 e VP4; região P2, da qual fazem parte a proteína 2A (que funciona como primeiro sinal para a montagem do capsídeo) e as proteínas 2B e 2C (as quais participam do processo de replicação do RNA viral); região P3, onde encontram-se a protease 3C (responsável pelo processamento de todas as proteínas estruturais e não-estruturais) e a RNA polimerase 3D. A sequência vacinal foi gerada a partir dos genes das proteínas estruturais, e da protease 3C viral, sendo denominada de poliproteína truncada (HAV-PTRUNC). Esta sequência foi otimizada e também fusionada a região N-terminal da Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (LAMP), com o objetivo de promover a secreção dos antígenos virais, gerando a construção N-LAMP_HAV-PTRUNC. Para a detecção da expressão de HAVPTRUNC e N-LAMP_HAV-PTRUNC, as proteínas individuais VP1, VP3 e 3C foram produzidas em bactérias e utilizadas para imunizar coelhos, para a obtenção de anticorpos policlonais específicos contra as mesmas. Os anticorpos obtidos foram capazes de reconhecer não só as respectivas proteínas recombinantes, como também as proteínas nativas do vírus e N-LAMP_HAV-PTRUNC. De acordo com os resultados obtidos, pretendemos dar continuidade aos nossos estudos através de ensaios clínicos, no intuito de produzir a primeira vacina de DNA contra HAV regulamentada para uso em humanos

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.

Streptococcus mutans é o principal agente etiológico da cárie dental humana, uma doença infecciosa para a qual não há vacina disponível. A influência dos sistemas de transporte ABC na virulência bacteriana suporta seu uso como alvos vacinais. Em S. mutans a proteína ligadora de fosfato (PstS) influencia a expressão de fatores de virulência. A proposta deste trabalho foi caracterizar uma estratégia vacinal de mucosa anti-cárie baseada na proteína PstS como antígeno alvo. Inicialmente, a forma recombinante da proteína foi obtida em E. coli. A caracterização biofísica revelou uma estrutura secundária estável, semelhante a outras proteínas ligadoras e capaz de interagir com seu ligante. Epítopos antigênicos conservados foram identificados na proteína recombinante pela reatividade com soro anti-S. mutans. A proteína rPstS foi imunogênica por via sublingual, combinada ou não à LTK4R e anticorpos rPstS-específicos interferiram na colonização oral in vivo por S. mutans. Os resultados indicam que a proteína rPstS pode ser explorada em estratégias vacinais contra a cárie. / Streptococcus mutans is the main etiological agent of human dental caries, an infectious disease for which there is no vaccine available. The influence of ABC transport systems in bacterial virulence supports its use as vaccine targets. In S. mutans the phosphate binding protein (PstS) influences the expression of virulence traits. The purpose of this work was characterizing an anti-caries mucosal vaccine based on the PstS protein as target antigen. First, a recombinant form of the protein was obtained in E. coli. The biophysical characterization showed a stable secondary structure, similar to other binding proteins and able to interact with its ligand. Conserved antigenic epitopes were identified in the recombinant protein by reactivity with anti- S. mutans serum. The rPstS protein was immunogenic by the sublingual route in combination or not with LTK4R and rPstS-specific antibodies interfered with S. mutans oral colonization in vivo. The results indicated that the recombinant PstS protein can be exploited in vaccine strategies against dental caries.

O presente projeto propõe a avaliação de respostas imunológicas induzidas por uma vacina de DNA bivalente para o controle de infecções por HIV e HSV. A vacina genética codifica a proteína gD do vírus HSV-1 geneticamente fusionada à proteína Gag (p24) do HIV, rica em epítopos reconhecidos por células T CD8+. A vacina de DNA pRE4p24 codifica a proteína p24 inserida em região próxima à porção C-terminal da proteína gD-1, permitindo que a proteína recombinante seja expressa na superfície da célula transfectada. A localização da proteína recombinante foi confirmada na superfície das células HEK-293T transfectadas por ensaios de imunofluorescência. Camundongos imunizados com a vacina foram capazes de gerar respostas de anticorpos específicos após três doses administradas pelas vias intramuscular (i.m.), intradérmica com seringa (i.d.) ou intradérmico por biobalística (gg). Foram analisadas as respostas imunológicas mediadas por linfócitos T CD8+ p24-específicas e, em função dos resultados obtidos, sendo a via i.m. escolhida como a mais promissora para os ensaios subsequentes. Na tentativa de aumentar a imunogenicidade da vacina, particularmente, para respostas celulares, foi avaliado o efeito da co-administração da formulação vacinal com outros plasmídeos que expressam citocinas (pIL-2, pIL-12 ou pGM-CSF), o teste de um vetor vacinal baseado no plasmídeo multicópia pVAX (pgDp24) e o emprego de um gene sintético para promover o aumento da expressão da proteína gD em células de mamíferos (pgDhp24). Por fim, desenvolvemos um modelo murino para a avaliação funcional de respostas citotóxicas antígeno-específicas a partir de uma linhagem tumoral capaz de expressar a proteína p24 do HIV. Camundongos Balb/c imunizados com o pgDp24 apresentaram um retardo no crescimento tumoral em relação aos animais não imunizados além de proteção parcial a desafios letais com HSV-1. / The present thesis aims to evaluate the immunological responses induced by a bivalent DNA vaccine to the control HIV and HSV infectious. This genetic vaccine codes the gD protein from the HSV-1 virus envelope genetically fused with HIV Gag (p24) protein, which has various epitopes recognized by human and murine T CD8+ cells. The DNA vaccine, named pRE4p24, codes for p24 protein, inserted close to the C-terminal region of gD-1 protein, leading to the expression of the recombinant protein on the surface of the transfected cells. The location of the recombinant protein was confirmed with transfected HEK-293 cellsby immunofluorescence assays. Mice immunized with the vaccine generated antigen-specific antibody responses after three doses administered intramuscularly (i.m), intradermally with a syringe (i.d) or intradermally by gene gun (bioballistic) (gg). The immunological responses mediated by specific-T CD8+ p24 lymphocytes were evaluated and, according to the data obtained, the i.m administration was chosen for the next assays. Aiming the improvement of the vaccine immunogenicity, particularly for cellular responses, the effect of co-administration with other plasmids was assessed with: plasmids that express cytokines (pIL-2, pIL-12 or pGM-CSF); a vaccine vector based on pVAX (pgDp24); and a vector encoding a synthetic gene capable to increase the expression of gD protein in mammalian cells (pgDhp24). Finally, we developed a murine model for the functional evaluation of antigen-specific cytotoxic responses using a tumor cell line which expresses the p24 protein. Balb/c mice, immunized with pgDp24 had a reduced tumor growth when compared to non-immunized mice. In addition, vaccinated mice showed partial protection to a lethal challenge with HSV-1.

As proteínas E7 (HPV), p24 (HIV) e gD (HSV) são exclusivamente expressas por células infectadas ou tumorais e, por isso, são utilizadas como alvos para vacinas com características terapêuticas. Foram desenvolvidas duas vacinas de DNA capazes de expressar as três proteínas virais por meio de um vetor de expressão bicistrônico baseado na sequência IRES. As vacinas, denominadas pIRES I e pIRES II, diferem entre si por transportarem os genes que codificam as proteínas E7 do HPV-16 e p24 do HIV fusionadas à proteína gD do HSV-1 em ordem inversa. Células COS-7 transfectadas com os plasmídeos vacinais expressaram as proteínas alvo, como determinado por imunofluorecência com anticorpos específicos para as proteínas gD, p24 e E7. As vacinas foram testadas em modelo murino quanto à capacidade de gerar anticorpos e células T CD8+ específicas. Observamos que animais vacinados desenvolveram baixas taxas de anticorpos contra gD, p24 e E7. Em contrapartida, demonstramos a indução de células T CD8+ específicas para os três antígenos testados. Os plasmídeos vacinais foram capazes de proteger camundongos inoculados com células tumorais TC-1 (que expressam a proteína E7 do HPV-16), embora apresentando diferentes níveis de proteção em ensaios profiláticos e terapêuticos. As formulações foram testadas em relação à capacidade de proteger animais frente a desafio com o HSV-1 sendo que apenas um deles gerou efeito protetor. Em conclusão, os resultados demonstram que vacinas voltadas para o controle terapêutico de infecções ou processos tumorais associados aos vírus HPV, HIV e HSV representam uma meta viável e promissora. / The proteins E7 (HPV), p24 (HIV) and gD (HSV) are exclusively expressed by infected cells or tumors and therefore are used as targets for vaccines with therapeutic characteristics. We developed two DNA vaccines capable of expressing these three viral proteins using a bicistronic expression vector based on IRES sequence. The plasmid vaccines, named pIRES I and pIRES II, differ by carrying the genes that encode proteins of HPV-16 E7 and p24 fused to the HIV protein gD of HSV-1 in reverse order. Transfected COS-7 cells expressed the target proteins, as determined by immunofluorescence with specific antibodies for gD, p24 and E7. The vaccines were tested in mice for their ability to generate antibodies and specific CD8+ T cells. We observed that vaccinated animals developed low levels of antibodies against gD, E7 and p24. In contrast, we demonstrate the induction of specific CD8+ T cells for the three antigens. The plasmid vaccines were able to protect mice inoculated with TC-1 tumor cells (which express the E7 protein of HPV-16), although with different levels of protection in prophylactic and therapeutic trials. The formulations were tested for ability to protect animals against challenge with HSV-1 and only one of them generated a protective effect. In conclusion, the results show that vaccines directed to therapeutic control of infections or tumor process associated with HPV, HSV or HIV represents a promising and viable goal.

O objetivo deste estudo foi descrever e mapear a toxicidade local e sistêmica da aplicação da vacina de DNA HSP 65 do Mycobacterium leprae em pacientes com formas avançadas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e definir qual a dose máxima tolerada. Trata-se de um estudo prospectivo, randomizado, aberto, sem grupo controle, de fase 1, com utilização de uma nova vacina para o tratamento de dezoito pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço, sem opção terapêutica curativa, índice de Karnofsky maior que 70%, sem outra doença sistêmica grave. Propôs-se 3 grupos de 6 indivíduos, cada grupo recebendo diferente dose da vacina, respectivamente 150ug; 600ug e 1200ug por dose. A administração desta foi feita em 3 injeções com intervalo de 21 dias. Durante 90 dias os pacientes eram rigorosamente avaliados clinico e laboratorialmente quanto à ocorrência de eventos adversos (EA). A pesquisa de EA foi baseada no Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) elaborado pelo National Cancer Institute (NCI). No primeiro grupo (150ug) um paciente morreu por sangramento abundante de úlcera tumoral antes do fim do protocolo. Todos os pacientes referiram aumento da dor; três tiveram maior edema e dois piora da astenia; três tiveram infecções de pele e/ou tecido subcutâneo da cabeça e pescoço e um infecção do trato respiratório superior. No 2º grupo (600ug) três pacientes faleceram antes dos 90 dias de protocolo por causas não relacionadas ao tratamento, descritas a seguir: complicações de gastrostomia, rápida progressão tumoral e hemorragia fatal e carcinomatose pulmonar. Neste grupo um paciente não teve EA; cinco tiveram piora da dor; quatro aumento do edema; dois maior astenia; três celulite de face e dois apresentaram sinusite aguda. Como neste grupo observou-se toxicidade classificada como relacionada ao tratamento graus 3 e 4 em mais de um terço dos pacientes decidiu-se escalonar para baixo a dose no 3º grupo para 400ug. No último grupo três pacientes morreram por progressão tumoral rápida, sem completar o protocolo, então incluiu-se três novos indivíduos. Todos tiveram maior dor; três aumento do edema; três piora da astenia; um caso de erisipela; três com infecção pulmonar e um com sinusite aguda; um paciente apresentou linfonodomegalia peri-tumoral após receber a vacina. Concluiu-se que a administração desta vacina neste grupo de pacientes é segura na dose de 400ug e tem como principal toxicidade aumento dos sinais inflamatórios na lesão tumoral e maior ocorrência de infecções locais e respiratórias. / This study goal was to describe and graduate the local and systemic toxicity of intratumoral injections of HSP (Heat Shock Protein) 65 DNA vaccine in advanced-stage head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN) patients and to define the highest well tolerated dose for them. This is a prospective, non-randomized, uncontrolled, phase 1 study, using a new vaccine to treat eighteen patients with advanced-stage SCCHN patients without any option for curative treatment, Karnofsky performance status greater than 70% and no organ failure. The patients were divided into 3 groups of 6 patients each one, receiving different vaccine doses, 150ug; 600ug e 1200ug per dose, respectively. They received three injections with a 21 days interval. The patients were rigorously evaluated into their clinical and laboratory aspects looking for adverse events (AE) during 90 days. Toxic effects were monitored according to National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE). In the first group (150ug) one patient died due to an ulcerate lesion extensive bleeding before the protocol end. All the patients referred pain increase; tree had greater edema; two had strong fatigue; tree presented with cutaneous infections of head and neck and one with an acute sinusitis. In the second group (600ug) three patients died before the 90th day protocol, all considered unrelated to treatment, following described: gastrostomy complications, a fatal bleeding after rapid progression of the tumor and pulmonary carcinomatosis. In this group one patient didn\'t have adverse events; five had pain worsening; four had increase of edema; two had greater fatigue; tree had facial cellulitis and two had acute sinusitis. Due to grade 3 and 4 adverse events occurred in more than one third of patients of this group we decided to lower the dose of the third group to 400ug. In the last group three patients also died before protocol completion, all due to cancer progression, so we had to include three more patients in this group. All of them presented greater pain; tree had increasing of edema; tree had fatigue worsening; tree had pulmonary infections; one had acute sinusitis and lymphoadenomegalia besides the tumor lesion. We concluded that intratumoral injections of M.leprae HSP 65 DNA in advanced-stage SCCHN patients is safe at the dose of 400ug/injection and cause tumor flare adverse events and an increase rate of local and respiratory infections.