Objetivos: Sistemas nanoparticulados são úteis para modular a farmacocinética de substâncias. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram o desenvolvimento de um sistema nanovesicular (NV) inovador auto-organizado de quitosana e lecitina, contendo miristato de isopropila (IPM) como núcleo oleoso capaz de alterar a farmacocinética da clozapina (CZP) e do ácido valpróico (VPA). Métodos: NV foram preparadas através da mistura, utilizando Ultraturrax, de uma solução etanólica contendo Lipoid S45® e IPM em uma solução aquosa de quitosana. As concentrações de quitosana (4 ou 8 mg/ml), IPM (10 e 20 mg/mL), Lipoid S45® (4 e 8 mg/ml) foram otimizadas através de um fatorial 23 que avaliou o diâmetro, potencial zeta, pH, viscosidade e análises de retroespalhamento de luz (BS) como respostas. Às nanovesículas do sistema otimizado pela análise fatorial foi incluído a CZP. A caracterização físico-química dessa formulação (NV-CZP) foi conduzida avaliandose os mesmos parâmetros citados acima. A farmacocinética dessa formulação foi avaliada em ratos Wistar pela via i.v (5 mg/kg, CZP livre) e oral (10 mg/kg, CZP livre e NV-CZP). Para a quantificação da CZP nas amostras de plasma obtidas em tempos pré-determinados após adminsitração das formulações um método analítico por CL-EM/EM foi desenvolvido e validado. O VPA também foi encapsulado nessas nanovesículas, nesse caso em substituição ao IPM, formando NV-VPA que foram caracterizadas físico-quimicamente. Os perfis cinéticos dessa formulação foram avaliados para os seguintes grupos de animais: VPA, ratos anestesiados (G1, 4 mg/kg) e não-anestesiados (G2, 4 mg/kg), VPA-NV (G3, 2 mg/kg), oral 4 mg/kg VPA (G4) e VPA-NV (G5), além da administração intra-traqueal (i.t.) de 4 mg/kg (VPA, G6 e VPA-NV, G7). Avaliação não-compartimental e compartimental dos perfis individuais de concentração plasmática da CZP e VPA foi realizada utilizando Excel® 2003 e Scientist® 2.0, respectivamente. Resultados: Os diâmetros das partículas no planejamento fatorial variaram de 0.348 a 1.5 μm. O diâmetro foi dependente da proporção de quitosana, IPM e lecitina utilizados nas formulações O potencial zeta positivo (+41.3 a +50 mV) foi influenciado principalmente pela concentração de quitosana. O pH de todas as formulações foi ácido. Os valores de viscosidade sofreram influência das concentrações de quitosana e IPM. A formulação otimizada (quitosana 4 mg/mL; IPM 10 mg/mL e Lipoid S45® 8 mg/mL) foi escolhida para encapsular a CZP. As nanovesículas de CZP (CZP-NV 1 mg/mL) e NV brancas apresentaram, respectivamente, tamanhos médios de 181 ± 3 nm e 470 ± 2 nm, pH ácido, potencial zeta positivo, índice de polidispersão abaixo de 0.3 e doseamento da CZP próximo a 100%. Após a encapsulação da CZP em NV, a biodisponibilidade oral foi 24%, duas vezes superior a biodisponibilidade da CZP livre (9%). Aumento na meia-vida foi observado para a CZP-NV (4.32 ± 1.33 h) em relação à CZP livre (2.28 ± 0.69 h), devido a uma diminuição da depuração plasmática. No estudo com VPA, o tamanho médio, potencial zeta e pH para VPA-NV (5 mg/mL) e NV brancas foram 333 ± 1.5 nm e 131 ±1 nm; 25.6 ± 0.8 mV e +13.4 ± 1.7 mV; 2.69 ± 0.02 e 2.71 ± 0.08, respectivamente. Os perfis plasmáticos dos grupos G1, G2, G3 declinaram de forma bi-exponencial. A depuração plasmática e o volume de distribuição no steady-state do G5 diminuíram significativamente e na mesma proporção em relação ao G4. A meia-vida não se alterou para o G4 e G5. O pico de concentração plasmática (Cmax) foi significativamente maior para G7 do que para G6 e o tempo para alcançar o pico (tmax) foi menor para o G6. A depuração plasmática e o volume de distribuição no steady-state do G7 diminuíram significativamente e na mesma proporção em relação ao grupo G6, não implicando em alteração na meia-vida do fármaco. Conclusões: Neste trabalho, um novo nanossistema vesicular foi desenvolvido e biologicamente avaliado. As nanovesículas mostraram-se úteis para melhor os parâmetros farmacocinéticos do VPA e da CZP, principalmente a biodisponibilidade oral, sendo promissoras para diferentes aplicações biológicas e tecnológicas. / Objectives: Nanoparticles (NP) are useful to modulate the pharmacokinetics (PK) of drugs. The aim of this study was to develop innovative self-assembly nanovesicles (NV) constituted of chitosan and lecithin with isopropyl myristate (IPM) as oil core, able to modify the PK plasma profile of clozapine (CZP) and valproic acid (VPA). Methods: The NV were obtained by injecting 4 mL of an ethanolic phase containing Lipoid S45® and IPM into 46 ml of a chitosan aqueous solution followed by Ultraturrax homogenization. The concentrations of chitosan (4 and 8 mg/mL), IPM (10 e 20 mg/mL) and Lipoid S45® (4 and 8 mg/mL) were optimized using a 23 factorial design. The responses evaluated were particle size, zeta potential, pH, viscosity and backscattering (BS) analysis. The optimized formulation (F2) was choosed to encapsulate CZP. The PK in rats was evaluated after i.v. (5 mg/kg, free CZP) and oral (10 mg/kg, free and NV-CZP) administration. A LC-MS/MS method was developed and validated for CZP quantification in rat plasma. VPA was also incorporate into the NV in this case replacing IPM by the drug. The NV-VPA physicochemical characterization and plasma PK was evaluated. The groups for PK investigation were: VPA unconscious rat (G1, 4 mg/kg) and conscious rat (G2, 4 mg/kg), VPA-NV (G3, 2 mg/kg), oral 4 mg/kg dosing of VPA (G4) and VPA-NV (G5) and intratracheal (i.t.) 4 mg/kg VPA (G6) and VPA-NV (G7) administration. Noncompartmental and compartmental analyses were performed using Excel® 2003 and Scientist® 2.0, respectively. Results: The particle size ranged 0.348 to 1.5 μm. This response was dependent on the proportion of chitosan, IPM, and Lipoid S45® used. The analysis of laser diffractometry showed only one particle size population for all formulations, mainly below 1 μm. The zeta potential was strongly positive (+41.3 to +50 mV) and it was influenced by chitosan, mainly. The formulations pH was acid. The viscosity was dependent on chitosan and IPM concentration. The F2 (chitosan 4 mg/mL; IPM 10 mg/mL and Lipoid S45® 8 mg/mL) was choosed to incorporate CZP. The CZP-NV (1 mg/mL) and blank-NV (unloaded) presented mean particle sizes of 181 ± 3 nm and 470 ± 2 nm, respectively, acid pH, positive zeta potentials, PDI below 0.3 and drug content close to 100%. CZP oral bioavailability after encapsulation into NV was 24%, twice the oral value observed for CZP in solution (9%). An increase in half-life was observed for CZP-NV (4.32 ± 1.33 h) in relation to free CZP (2.28 ± 0.68 h), due to the decrease in total clearance (a = 0.05). In the study with VPA, the mean diameter, zeta potential and pH of VPA-NV (5 mg/mL) and blank-NV were 333 ±1.5 nm and 131 ±1 nm; 25.6 ± 0.8 mV and +13.4 ± 1.7 mV; 2.69 ± 0.02 and 2.71 ± 0.08, respectively. The plasma profiles of G1, G2, and G3 declined in a bi-exponential fashion. G5 total clearance and volume of distribution at steady state were significantly decreased in relation to G4 (a = 0.05) and the half-life was not altered. The peak plasma concentration (Cmax) was significantly higher in the G7 group than G6, and the peak time (tmax) took place earlier after administration of G6. G7 clearance and volume of distribution at steady state were both significantly decreased in the same proportion in relation to G6 (a = 0.05), not altering the halflife. Conclusions: In this work a new nanovesicular system was developed and biologically evaluated. The system showed to be useful to improve VPA and CZP pharmacokinetics. The nanovesicles have potential for application for different biological and technological uses.

Objetivos: Sistemas nanoparticulados são úteis para modular a farmacocinética de substâncias. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram o desenvolvimento de um sistema nanovesicular (NV) inovador auto-organizado de quitosana e lecitina, contendo miristato de isopropila (IPM) como núcleo oleoso capaz de alterar a farmacocinética da clozapina (CZP) e do ácido valpróico (VPA). Métodos: NV foram preparadas através da mistura, utilizando Ultraturrax, de uma solução etanólica contendo Lipoid S45® e IPM em uma solução aquosa de quitosana. As concentrações de quitosana (4 ou 8 mg/ml), IPM (10 e 20 mg/mL), Lipoid S45® (4 e 8 mg/ml) foram otimizadas através de um fatorial 23 que avaliou o diâmetro, potencial zeta, pH, viscosidade e análises de retroespalhamento de luz (BS) como respostas. Às nanovesículas do sistema otimizado pela análise fatorial foi incluído a CZP. A caracterização físico-química dessa formulação (NV-CZP) foi conduzida avaliandose os mesmos parâmetros citados acima. A farmacocinética dessa formulação foi avaliada em ratos Wistar pela via i.v (5 mg/kg, CZP livre) e oral (10 mg/kg, CZP livre e NV-CZP). Para a quantificação da CZP nas amostras de plasma obtidas em tempos pré-determinados após adminsitração das formulações um método analítico por CL-EM/EM foi desenvolvido e validado. O VPA também foi encapsulado nessas nanovesículas, nesse caso em substituição ao IPM, formando NV-VPA que foram caracterizadas físico-quimicamente. Os perfis cinéticos dessa formulação foram avaliados para os seguintes grupos de animais: VPA, ratos anestesiados (G1, 4 mg/kg) e não-anestesiados (G2, 4 mg/kg), VPA-NV (G3, 2 mg/kg), oral 4 mg/kg VPA (G4) e VPA-NV (G5), além da administração intra-traqueal (i.t.) de 4 mg/kg (VPA, G6 e VPA-NV, G7). Avaliação não-compartimental e compartimental dos perfis individuais de concentração plasmática da CZP e VPA foi realizada utilizando Excel® 2003 e Scientist® 2.0, respectivamente. Resultados: Os diâmetros das partículas no planejamento fatorial variaram de 0.348 a 1.5 μm. O diâmetro foi dependente da proporção de quitosana, IPM e lecitina utilizados nas formulações O potencial zeta positivo (+41.3 a +50 mV) foi influenciado principalmente pela concentração de quitosana. O pH de todas as formulações foi ácido. Os valores de viscosidade sofreram influência das concentrações de quitosana e IPM. A formulação otimizada (quitosana 4 mg/mL; IPM 10 mg/mL e Lipoid S45® 8 mg/mL) foi escolhida para encapsular a CZP. As nanovesículas de CZP (CZP-NV 1 mg/mL) e NV brancas apresentaram, respectivamente, tamanhos médios de 181 ± 3 nm e 470 ± 2 nm, pH ácido, potencial zeta positivo, índice de polidispersão abaixo de 0.3 e doseamento da CZP próximo a 100%. Após a encapsulação da CZP em NV, a biodisponibilidade oral foi 24%, duas vezes superior a biodisponibilidade da CZP livre (9%). Aumento na meia-vida foi observado para a CZP-NV (4.32 ± 1.33 h) em relação à CZP livre (2.28 ± 0.69 h), devido a uma diminuição da depuração plasmática. No estudo com VPA, o tamanho médio, potencial zeta e pH para VPA-NV (5 mg/mL) e NV brancas foram 333 ± 1.5 nm e 131 ±1 nm; 25.6 ± 0.8 mV e +13.4 ± 1.7 mV; 2.69 ± 0.02 e 2.71 ± 0.08, respectivamente. Os perfis plasmáticos dos grupos G1, G2, G3 declinaram de forma bi-exponencial. A depuração plasmática e o volume de distribuição no steady-state do G5 diminuíram significativamente e na mesma proporção em relação ao G4. A meia-vida não se alterou para o G4 e G5. O pico de concentração plasmática (Cmax) foi significativamente maior para G7 do que para G6 e o tempo para alcançar o pico (tmax) foi menor para o G6. A depuração plasmática e o volume de distribuição no steady-state do G7 diminuíram significativamente e na mesma proporção em relação ao grupo G6, não implicando em alteração na meia-vida do fármaco. Conclusões: Neste trabalho, um novo nanossistema vesicular foi desenvolvido e biologicamente avaliado. As nanovesículas mostraram-se úteis para melhor os parâmetros farmacocinéticos do VPA e da CZP, principalmente a biodisponibilidade oral, sendo promissoras para diferentes aplicações biológicas e tecnológicas. / Objectives: Nanoparticles (NP) are useful to modulate the pharmacokinetics (PK) of drugs. The aim of this study was to develop innovative self-assembly nanovesicles (NV) constituted of chitosan and lecithin with isopropyl myristate (IPM) as oil core, able to modify the PK plasma profile of clozapine (CZP) and valproic acid (VPA). Methods: The NV were obtained by injecting 4 mL of an ethanolic phase containing Lipoid S45® and IPM into 46 ml of a chitosan aqueous solution followed by Ultraturrax homogenization. The concentrations of chitosan (4 and 8 mg/mL), IPM (10 e 20 mg/mL) and Lipoid S45® (4 and 8 mg/mL) were optimized using a 23 factorial design. The responses evaluated were particle size, zeta potential, pH, viscosity and backscattering (BS) analysis. The optimized formulation (F2) was choosed to encapsulate CZP. The PK in rats was evaluated after i.v. (5 mg/kg, free CZP) and oral (10 mg/kg, free and NV-CZP) administration. A LC-MS/MS method was developed and validated for CZP quantification in rat plasma. VPA was also incorporate into the NV in this case replacing IPM by the drug. The NV-VPA physicochemical characterization and plasma PK was evaluated. The groups for PK investigation were: VPA unconscious rat (G1, 4 mg/kg) and conscious rat (G2, 4 mg/kg), VPA-NV (G3, 2 mg/kg), oral 4 mg/kg dosing of VPA (G4) and VPA-NV (G5) and intratracheal (i.t.) 4 mg/kg VPA (G6) and VPA-NV (G7) administration. Noncompartmental and compartmental analyses were performed using Excel® 2003 and Scientist® 2.0, respectively. Results: The particle size ranged 0.348 to 1.5 μm. This response was dependent on the proportion of chitosan, IPM, and Lipoid S45® used. The analysis of laser diffractometry showed only one particle size population for all formulations, mainly below 1 μm. The zeta potential was strongly positive (+41.3 to +50 mV) and it was influenced by chitosan, mainly. The formulations pH was acid. The viscosity was dependent on chitosan and IPM concentration. The F2 (chitosan 4 mg/mL; IPM 10 mg/mL and Lipoid S45® 8 mg/mL) was choosed to incorporate CZP. The CZP-NV (1 mg/mL) and blank-NV (unloaded) presented mean particle sizes of 181 ± 3 nm and 470 ± 2 nm, respectively, acid pH, positive zeta potentials, PDI below 0.3 and drug content close to 100%. CZP oral bioavailability after encapsulation into NV was 24%, twice the oral value observed for CZP in solution (9%). An increase in half-life was observed for CZP-NV (4.32 ± 1.33 h) in relation to free CZP (2.28 ± 0.68 h), due to the decrease in total clearance (a = 0.05). In the study with VPA, the mean diameter, zeta potential and pH of VPA-NV (5 mg/mL) and blank-NV were 333 ±1.5 nm and 131 ±1 nm; 25.6 ± 0.8 mV and +13.4 ± 1.7 mV; 2.69 ± 0.02 and 2.71 ± 0.08, respectively. The plasma profiles of G1, G2, and G3 declined in a bi-exponential fashion. G5 total clearance and volume of distribution at steady state were significantly decreased in relation to G4 (a = 0.05) and the half-life was not altered. The peak plasma concentration (Cmax) was significantly higher in the G7 group than G6, and the peak time (tmax) took place earlier after administration of G6. G7 clearance and volume of distribution at steady state were both significantly decreased in the same proportion in relation to G6 (a = 0.05), not altering the halflife. Conclusions: In this work a new nanovesicular system was developed and biologically evaluated. The system showed to be useful to improve VPA and CZP pharmacokinetics. The nanovesicles have potential for application for different biological and technological uses.

A epilepsia é uma patologia que afeta 50 milhões de pessoas, sendo que cerca de 30% dos pacientes apresentam epilepsia refratária, ou seja, não respondem a terapia medicamentosa disponível. Portanto, é necessária a busca contínua de novos fármacos. Os complexos organometálicos vêm ao encontro a esta necessidade conjugando moléculas já aplicadas na terapia (como o ácido valproico), a metais essenciais e outros ligantes a fim de aprimorar os efeitos farmacológicos. Neste trabalho foram testados quatro complexos derivados do ácido valproico: [Cu(Valp)2Fen] , [Cu(Valp)2Bipi], [Zn(Valp)2Fen] e [Zn(Valp)2Bipi], através do screening toxicológico embrionário e atividade anticonvulsivante em zebrafish induzidos por pentilenotetrazol (PTZ). O complexo [Cu(Valp)2Bipi] apresentou maior toxicidade embrionária (CL50=0.12 μM), seguido pelo [Zn(Valp)2Bipi] (CL50 = 10μM). Estes mesmo complexos nas doses de 10 mM/Kg, 30 mM/Kg e 100 mM/Kg para derivado contendo zinco a intensidade das convulsões em relação ao valproato de sódio (175 mM/Kg) em peixes adultos, demonstrando ação superior ao fármaco tradicional. Devido a baixa toxicidade aliada a ação anticonvulsivante evidente selecionamos o derivado [Zn(Valp)2Bipi] para estudos futuros em modelos complexos de epilepsia. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES / The most important determinant of quality of life in patients with epilepsy is complete seizure control, and therefore this should be the ultimate goal of pharmacological therapy. Unfortunately, around 30% of epileptic patients still suffer with refractory epilepsy. Metal ions have been frequently incorporated into pharmaceuticals for therapeutic or diagnostic purposes and the research. In this study, we access the embryo toxicity and anticonvulsant activity of 4 novel metallodrugs, with Zn+2 and Cu+2, derivative with valproic acid and the N-donor ligand in adult zebrafish pentylenetetrazole epileptic seizure model. [Cu(Valp)2Bipy] LC50 in 48 Hours Post Fertilization (hpf) was 0.22 μM and 0.12 μM in 96 hpf followed by [Zn(Valp)2Bipy] (LC50 = 10 μM). This same metallodrugs ([CuValp)2Bipi] 10 mM/Kg and [Zn(Valp)2Bipi] 30 mM and 100 mM/Kg) displayed a superior activity reducing the seizure intensity compared to Sodium Valproate (175 mM/Kg). As conclusion, among all, the [Cu(Valp)2Bipi] showed the best anticonvulsant effects, but due to its toxic effects on embryos and larvae, the [Zn(Valp)2Bipi] should be considered the most promising for future studies as anticonvulsant drug.

O ácido valproico (AVP) é um fármaco de primeira linha no tratamento de convulsões parciais e generalizadas, porém os efeitos colaterais decorrentes das altas doses administradas produzem danos hepáticos por metabolização. O AVP apresenta alta afinidade com metais de transição e produz compostos de coordenação quimicamente estáveis. O presente estudo teve como objetivos sintetizar quatro complexos de AVP com Cu+2 e Zn+2 ligados com diiminas aromáticas 1,10-fenantrolina (Phen) e 2,2’-bipiridina (Bipy), determinar as estruturas químicas por espectrofotometria de absorção atômica (FAAS), espectrofotometria de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectrometria de massas de alta resolução (ESI-TOF-MS), e espectrometria de ressonância magnética nuclear (1H RMN e 13C RMN), avaliar as atividades antioxidantes por ensaios de Sod-like e Cat-like e determinar a citotoxicidade aguda frente à Artemia salina e à cultura celular CHO. O processo de síntese iniciou-se com a preparação dos compostos precursores Cu2(Valp)4 (1) e Zn2(Valp)4 (2) pela reação do valproato de sódio com os sais CuCl2 e ZnCl2 em meio aquoso. As estruturas químicas foram confirmadas por Ponto de Fusão, FAAS, FTIR, 1H RMN e 13C RMN. Os compostos de coordenação Cu(Valp)2(1,10-Phen) (3), Cu(Valp)2(2,2-Bipy).H2O (4), Zn(Valp)2(1,10-Phen).H2O (5) e Zn(Valp)2(2,2-Bipy).H2O (6) (inédito) foram sintetizados pela reação equimolar dos compostos 1 e 2 com os respectivos ligantes neutros 1,10- fenantrolina e 2,2-bipiridina em solvente DMF. Os dados das estruturas químicas dos compostos 3 e 4 foram obtidos por PF, UV-Vis, FAAS, FTIR e ESI TOF-MS e confirmados por comparação com dados da literatura. Os compostos 5 e 6 (inédito) foram analisados por PF, UV-Vis, FAAS, FTIR, ESI TOF-MS, 1H RMN e 13C RMN, e suas estruturas químicas foram confirmadas por comparação com a literatura (5) e por interpretação de espectros (6). O experimento de Sod-like para os compostos 3, 4, 5 e 6 não expressou atividade aparente para a metodologia utilizada, porém todos expressaram atividade de Cat-like. O experimento de citotoxidade aguda frente à A. salina indicou haver correlação dose/resposta para as diferentes concentrações testadas dos compostos 3, 4, 5 e 6 e para os controles 1,10-Phen, 2,2-Bipy e K2Cr2O7. O composto 3 mostrou-se o mais tóxico (CL50: 2 μg mL-1), seguido do composto 5 (CL50: 78 μg mL-1), composto 4 (CL50: 386 μg mL-1) e o composto 6 menos tóxico (CL50: 409 μg mL-1). Os resultados indicam haver maior toxicidade dos compostos com cobre, caso similar observado para os compostos com 1,10-Phen. Os experimentos de citotoxicidade aguda dos compostos 5 e 6 frente à linhagem celular CHO com 24 horas de exposição nas concentrações de 25, 20, 15, 10, 5 e 2 μg mL-1 não expressaram toxicidade para a metodologia utilizada. Os resultados corroboram com aqueles obtidos no ensaio de A. salina. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. / Valproic acid (VPA) is a first-line drug in the treatment of seizures in general, but the side effects from high doses produce liver damage by metabolism. VPA has high affinity for transition metals and produces chemically stable coordination compounds. The present study aimed to synthesize four complexes VPA with Cu+2 and Zn+2 with 1,10- phenanthroline and 2,2’-bipyridine linked aromatic diimines, determine the chemical structures by FAAS, FTIR, ESI-TOF MS , 1H NMR and 13C NMR, evaluate the antioxidant activities by Sod-like and Cat-like and determine acute cytotoxicity front of Artemia salina (brine shrimp) and CHO cell culture. The synthesis procedure began with the preparation of precursor compounds Cu2(Valp)4 (1) and Zn2(Valp)4 (2) by the reaction of Sodium Valproate with chlorides of metals in aqueous medium. The chemical structures were confirmed by MP, FAAS, FTIR, 1H NMR and 13C NMR. Coordination compounds Cu(Valp)2(1,10-Phen) (3) Cu(Valp)2(2,2- Bipy).H2O (4), Zn(Valp)2(1,10-Phen).H2O (5) and Zn(Valp)2(2,2-Bipy).H2O (6) (unpublished) were synthesized by equimolar reaction of compounds 1 and 2 with the corresponding neutral ligands 1,10-phenanthroline and 2.2-bipyridine in DMF solvent. The data of chemical structures of compounds 3 and 4 were obtained by MP, UV-Vis, FAAS, FTIR and ESI-TOF MS and confirmed by comparison with the literature data. Compounds 5 and 6 (unpublished) were analyzed for MP, UV-Vis, FAAS, FTIR, ESI TOF-MS, 1H NMR and 13C NMR, and their chemical structures were confirmed by comparison with the literature (5) and interpretation spectra (6). The Sod-like experiments for compounds 3, 4, 5 and 6 were not significant, but all showed activity of Cat-like. The experiment of acute cytotoxicity in A. saline showed significant for compounds 3, 4, 5 and 6 in 8 different concentrations tested results. Compound 3 was found to be the most toxic (LC50: 2 mg mL-1), followed by compound 5 (LC50: 78 mg mL-1), compound 4 (LC50: 386 mg mL-1) and less toxic compound 6 (LC50: 409 mg mL-1). It can be observed correlation affix the higher toxicity of the compounds with copper, the case that observed for similar compounds with 1,10-Phen. The experiments of acute cytotoxicity of compounds 5 and 6 against CHO cell lines after 24 hours of exposure at concentrations of 25, 20, 15, 10, 5 and 2 μg mL-1 showed no significant differences in toxicities to controls. The results corroborate the results obtained using the A. salina.

Made available in DSpace on 2016-03-15T19:40:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Helen Meira Cavacanti.pdf: 728004 bytes, checksum: a8983f7df5ebf01baf8422ee22e67309 (MD5) Previous issue date: 2008-01-31 / This experimental study tries to develop models of behavioral tests to rodents as a mean to evaluate the three domains that characterize autism: loss in social interaction; verbal and non-verbal communication; behavior patterns, interest, restrict activity, repetitive behavior and stereotype. One of these models is based on the pre-natal exposition to teratogenics agents, like valproic acid, considered a risk factor for autism. The objective of this research was to analyze the interference of valproic acid in the learning process and flexibility of routines in winstar rats. This study is experimental and the sample is composed by 20 male rats 10 from the control group and 10 from the experiment group. The learning capacity and the capacity of maintaining flexible routines are evaluated by the T maze test. The capacity of habituate is measured by the open field test. The learning, discrimination and reversions capacity is evaluated by the box of conditioning working. The results shows that the valproic acid interfered in the capacities of learning, flexibility of routine, habituate and reversion of what is learned. These behavior alterations are compatible with those observed in autistic individuals. / Estudos experimentais vêm buscando desenvolver modelos de testes comportamentais para roedores na tentativa de avaliar os três domínios que caracterizam o autismo: prejuízos na interação social; na comunicação verbal e não-verbal; padrões de comportamento, interesses, atividade restrita, comportamento repetitivo e estereotipado Um dos modelos baseia-se na exposição pré-natal aos agentes teratógenos, como o ácido valpróico, considerados um fator de risco para o autismo. O objetivo deste trabalho é analisar a interferência do ácido valpróico no aprendizado e na capacidade de flexibilizar rotinas em ratos wistar. Trata-se de um estudo experimental, composta por uma amostra de 20 ratos machos, sendo 10 do grupo controle e 10 do grupo experimental. A capacidade de aprendizagem e de flexibilizar rotinas é avaliado pelo teste labirinto em T. A capacidade de habituação é medida pelo teste de campo aberto, e a capacidade de aprendizagem, discriminação e reversão é avaliado pelo teste na caixa de condicionamento operante. Os resultados mostram que o ácido valpróico interferiu nas capacidades de aprendizagem, de flexibilizar rotina, de habituação e reversão do aprendizado. Essas alterações comportamentais são compatíveis com aqueles observados em indivíduos autistas.

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) ainda é afetada pela baixa eficiência. As modificações epigenéticas estabelecidas durante o processo de diferenciação celular estão entre os principais fatores. Uma vez que estas modificações atuam como barreiras epigenéticas restringindo a reprogramação do núcleo somático. Considerando isso, a maioria dos fatores que promovem a descondensação da cromatina, incluindo os inibidores das Histonas Deacetilases (HDACis), tem sido demonstrado aumentarem a eficiência da reprogramação nuclear, tornando o seu uso comum para melhorar as taxas da TNCS. Neste trabalho, nós testamos dois inibidores das histonas deacetilases: o Ácido Valpróico (VPA) e o Ácido β-Hidróxibutírico (BOHB), sendo um farmacológico e o outro um metabólito endógeno na TNCS. Nosso objetivo era testar se o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos com estes HDACis melhoravam o desenvolvimento de embriões bovinos clonados. Em relação ao VPA, nós observamos que o tratamento de fibroblastos com o VPA aumentou a acetilação das histonas e a expressão de genes importantes para o desenvolvimento como IGF2R e PPARGC1A. Entretanto, quando as células tratadas foram usadas como doadoras de núcleo, não foi observado diferença nos níveis de acetilação das H3K9 entre os grupos. Além disso, as alterações foram rapidamente removidas após a transferência nuclear. Em relação as taxas de desenvolvimento, o uso de células tratadas como doadoras de núcleo não resultou em diferença durante o desenvolvimento pré- e pós-implantacional. Em relação ao BOHB, nós executamos um série de experimentos para testar se esta molécula age como um inibidor das HDACs em bovinos. Nós observamos que fibroblastos tratados com BOHB apresentam aumento nos níveis globais de H3K9ac. O tratamento altera a expressão de genes importantes como os transportadores de glicose e a enzima chave no metabolismo lipídico SCD. Também, nós demonstramos que este metabólito é capaz de alterar uma marca epigenética em zigotos clonados, que persiste até o estágio de blastocisto. Entretanto, o tratamento dos zigotos com este metabólito endógeno não aumentou a taxa de desenvolvimento pré-implantacional, embora tenha alterado a expressão de um fator de transcrição que protege embriões contra estresse oxidativo, o FOXO3a. O tratamento de zigotos partenogenéticos com BOHB não afetou o desenvolvimento embrionário, nem a produção de ATP, sugerindo que o BOHB não apresenta efeitos tóxicos como anteriormente pensado. Concluindo, os resultados deste trabalho mostram que a inibição das HDACs através de uma molécula farmacológica ou um metabólito endógeno, não aumenta a eficiência da TNCS em bovinos. Entretanto, aqui nós mostramos que o corpo cetônico BOHB pode ser um elo de ligação entre o ambiente extracelular e a regulação do metabolismo. E serve como um modelo in vitro para testar como distúrbios metabólicos como a cetose afeta o metabolismo e epigenoma celular e embrionário em bovinos / Cloning of mammals by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is still plagued by the low efficiency. The epigenetic marks established during the cell differentiation process are among the main cause. These modifications act as a barrier restricting the nuclear reprogramming process of somatic nuclei. Based on this, molecules that promotes chromatin decondensing, including Histone Deacetylases inhibitors (HDACis), has been demonstrated increase the efficiency of nuclear reprogramming, making their use common on SCNT procedure. Herein, we tested two histone deacetylase inhibitors: Valproic Acid and β-hydroxybutyric Acid, the former a pharmacological drug and the latter, an endogenous metabolite on SCNT. Our objective was to test whether the donor cells treatment or zygotes with these HDACis improve the bovine cloned embryos development. Regarding the VPA, we observed that fibroblasts treatment with VPA increases the histone acetylation and expression of developmentally important genes such as IGF2R and PPARGC1A. However, when treated cells were used as nuclear donors, we did not observe difference on H3K9ac levels between the groups. Moreover, the alterations were quickly removed after SCNT. Regarding the developmental rates, the use of treated cells as nuclear donors did not affect the pre- and post-implantation development. In the second experiment, we used the BOHB in a series of experiments to test whether this molecule acts as a histone deacetylase inhibitor in bovines. We observed that treatment of fibroblasts with BOHB increased the global levels of H3K9ac. Also, treatment alters the expression of important genes such as glucose transporters and a key enzyme regulating lipid synthesis. Additionally, we demonstrated that this metabolite affect at least one epigenetic mark in cloned zygotes, that lasts until the blastocyst stage. However, zygote treatment with this endogenous metabolite did not increase the pre-implantation developmental rates, albeit increased the expression of a transcription factor that protects cells against oxidative stress, the FOXO3a. Treatment of parthenogenetic embryos with BOHB did not affect the embryo development, neither ATP production, suggesting that BOHB is not toxic as previously believed. Concluding, the results presented here shows that the HDAC inhibition through a pharmacological compound or an endogenous metabolite did not increase the efficiency of bovine SCNT. However, here we showed that the ketone body BOHB might be a nexus between the extracellular environment and the cellular metabolism. Also, it can used as a in vitro model to interrogate questions about does metabolic disturbances such as ketosis in cattle affects the epigenome and cellular metabolism in bovines

One of the first embryonic structures generated during early human development is the neural tube. The embryonic process of neurulation, including neural tube closure, is necessary for proper brain and spinal cord development, whereas improper closure leads to neural tube defects including anencephaly, spina bifida, and craniorachischisis. The mechanism by which these defects occur is unknown, but some evidence suggest that redox disruption may play a role. Cellular redox state is important in regulating key processes during neural tube closure, including differentiation, proliferation, gene expression, and apoptosis. This study aims to determine whether redox potential shifts and these key processes are affected similarly or differentially after treatment with three neural tube defect-inducing developmental toxicants: ceramide (C2), valproic acid (VPA), and fumonisin (FB1). Using the P19 cell model of neurogenesis, in both undifferentiated and terminally differentiated cells, we analyzed glutathione (GSH) redox (Eh) potential to evaluate the effect of each toxicant over time. We show that in C2 and VPA treated cultures an oxidizing shift occurs, but interestingly, FB1 treatment results in a reducing shift in embryonic GSH Eh as compared to untreated cultures. Using the chick embryo model, comparable redox shifts were observed as were seen in P19 cells, supporting similarity between the models. To better understand how differential shifts in the redox state can result in similar defects, we then examined potential variances in neuronal differentiation and cellular proliferation, survival, metabolism, adhesion, and gene expression under each treatment. We report changes to cellular and embryonic endpoints that support dysmorphogenesis, likely the result of oxidizing or reducing stress that altered redox state. These results support the need for broad comparative analyses such as this to determine whether toxicants that cause the same types of defects, whether NTDs or others, act through similar or different mechanisms. This can better inform preventative measures used to reduce the risk and occurrence of birth defects.

Univerzita Karlova 1. lékařská fakulta Studijní program: Biomedicína Studijní obor: Preventivní medicína MUDr. Karolína Hronová Polymorfismus genů účastnících se v metabolismu léčiv jako potenciální cíl prevence závažných komplikací léčby u novorozenců a dětí Polymorphism of drug metabolizing enzymes as a potential target of prevention of serious treatment complications in neonates and infants Disertační práce- ABSTRAKT V ANGLICKÉM JAZYCE Školitel: prof. MUDr. Ondřej Slanař, Ph.D. Konzultant: MUDr. Pavla Pokorná, PhD. Praha, 2018 Abstract Background and aims: The safety of analgosedative drugs includes drug interactions, adverse effects, withdrawal syndrome and drug dependence are factors that significantly affect morbidity and mortality. Its prevention is critical for quality improvement of care in paediatric patients. The aim of the thesis was to evaluate the prediction of efficacy and safety of analgosedative drugs sufentanil, midazolam, tramadol and valproic acid in neonates and children based on the occurrence of selected pharmacogenetic biomarkers. The incidence of drug interactions of phenobarbital with other analgosedative drugs has also been evaluated. Methodology: The thesis is based on two studies conducted on Intensive and Resuscitation Care Unit of the Clinic of Paediatric and Adolescent...

The pesticide/neurotoxin, rotenone, has been shown to cause systemic inhibition of mitochondrial complex I activity, with consequent degeneration of the nigrostriatal pathway, as observed in Parkinson’s disease. A novel intrastriatal rotenone model of Parkinson’s disease was used to examine the neuroprotective effects of valproic acid (VPA) and melatonin, both of which are known to induce neurotrophic gene expression in the central nervous system via mechanisms which may involve epigenetic modulation. In these studies, sham or lesioned rats were treated with either vehicle, VPA (4mg/mL), or melatonin (4µg/mL) in drinking water. Results from a forelimb asymmetry test indicated a significant decrease in use of the contralateral forelimb in rotenone-infused animals, in the third week post-surgery, which was abolished by VPA treatment. Apomorphine administration resulted in significantly higher ipsilateral rotation in rotenone-lesioned (12µg) animals, as compared to controls, which was attenuated by melatonin treatment. Subsequent immunohistochemical examination revealed a decrease in tyrosine hydroxylase immunoreactivity within the striatum and substantia nigra of rotenone-infused animals. VPA or melatonin treatment prevented this decrease in tyrosine hydroxylase in the striatum and substantia nigra. Stereological cell counting indicated a significant decrease in dopamine neurons within the substantia nigra of rotenone-treated animals. Importantly, this loss of dopamine neurons in rotenone-infused animals was blocked by chronic VPA or melatonin treatment. A third study explored whether rotenone infusion into the medial forebrain bundle and substantia nigra in mice could provide a model of Parkinson's disease. Densitometric analysis revealed a significant depletion of tyrosine hydroxylase immunofluorescence within the ipsilateral striatum and substantia nigra of lesioned animals, and a significant bilateral overexpression of α-synuclein in the substantia nigra, as compared to control animals. These novel findings support the use of intracranial rotenone as a Parkinsonian model, and provide a solid platform for future combinatorial therapeutic approaches with VPA and melatonin. / Dissertation / Doctor of Philosophy (PhD)

<p>Valproic acid (VPA) is clinically utilized as an anti-convulsant and mood stabilizer, though its mechanism of action has not been fully elucidated.<strong> </strong>Evidence suggests an interaction between VPA and the melatonergic system as VPA up-regulated the melatonin MT₁ receptor subtype in rat C6 glioma cells. To determine if the observed effects can translate to an <em>in vivo </em>model, we investigated the effects of chronic VPA administration in a rat model on the expression of MT₁ and MT₂ receptors in the hippocampus. We also investigated the effect of chronic VPA treatment on the expression of the neurotrophic factors BDNF and GDNF in the rat hippocampus and striatum.</p> <p>(1) Animals were separated into two groups with the experimental group receiving VPA (4 mg/mL) for 17 days, and the control receiving vehicle. The hippocampus was dissected and MT₁, MT₂, BDNF and GDNF mRNA were analyzed with RT-PCR. (2) Animals were separated into three groups with the first group receiving VPA (4 mg/mL), the second receiving VPA (3 mg/mL) for 16 days, and the control receiving vehicle. MT₂ mRNA in the hippocampal subregions were analyzed with in situ hybridization.</p> <p>VPA induced the expression of MT₁ and MT₂ mRNA in the hippocampus in the experimental group compared to the control group. VPA also increased MT₂ mRNA expression in the subregions of the hippocampus. Additionally, BDNF and GDNF mRNA expression were increased in the VPA treatment group.</p> <p>These findings raise the interesting question of whether the diverse clinical effects of VPA involve an interaction with the melatonergic system.</p> / Master of Science (MSc)