Parasitoides criam condições favoráveis para seu desenvolvimento regulando processos fisiológicos do hospedeiro via a utilização de moléculas produzidas por tecidos maternos ou por tecidos derivados do parasitoide imaturo ou de simbiontes associados (vírus de poliDNA - PDV). Assim, essas moléculas se destacam como uma fonte preciosa para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. O objetivo desse trabalho foi o de explorar a interação hospedeiro-parasitoide, visando à identificação de moléculas que participem do processo de regulação hospedeira para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. A busca pela identificação dessas moléculas foi concentrada na interação Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) pela avaliação i) do efeito do parasitismo na fisiologia digestiva do hospedeiro e ii) da contribuição da glândula de veneno e do ovário na produção de moléculas bioativas e iii) pela caracterização de transcritos produzidos por teratócitos desse parasitoide. O potencial de aplicação de moléculas derivadas da interação hospedeiro-parasitoide foi verificado pela caracterização da atividade de uma quitinase putativa isolada da associação Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae), via expressão heteróloga e transformação genética de plantas de fumo. Os resultados demonstraram que o parasitismo afeta a utilização do alimento por lagartas parasitadas, reduzindo as taxas de crescimento (RGR), consumo (RCR) e metabólica (RMR) relativas, enquanto aumenta a eficiência de conversão do digerido (ECD). O parasitismo por C. flavipes também aumentou a permanência do alimento no intestino do hospedeiro e a atividade de -amilase, sacarase e trealase em lagartas de D. saccharalis. Análises do transcriptoma da glândula de veneno e do ovário de C. flavipes indicaram a produção de muitas proteínas desconhecidas. Porém, foi possível identificar proteases, um inibidor de proteinase e uma proteína com ação antimicrobiana, produzidas pela glândula de veneno, e uma proteína de expressão precoce (ep1), como produto do ovário de C. flavipes. Dois transcritos isolados de teratócitos de C. flavipes foram putativamente identificados como serpina e fator de inibição da tradução (CfHTIF). Ambos os transcritos foram detectados em teratócitos após cinco dias do parasitismo, sendo que transcritos do CfHTIF também foram observados em hemócitos de hospedeiros parasitados. CfHTIF apresentou alta homologia a proteínas produzidas por PDVs associados a outras espécies de Cotesia, sugerindo a sua origem viral, sendo este o primeiro relato da utilização de teratócitos para a produção de proteínas virais voltadas à regulação hospedeira. A caracterização da atividade da quitinase de teratócitos de T. nigriceps e a avaliação do seu potencial biotecnológico via transgenia de plantas para o controle de lagartas de H. virescens indicou que, apesar dessa quitinase possuir capacidade de ligação à quitina coloidal e cristalina em ensaios in vitro, a mesma não demonstra qualquer atividade quitinolítica. Avaliações de plantas de fumo transformadas com o Tnchi não indicaram qualquer efeito deletério ao desenvolvimento de lagartas de H. virescens. Apesar da ausência de atividade quitinolítica, essa quitinase apresentou atividade antimicrobiana. A possibilidade de exploração dessa proteína na produção de plantas de interesse econômico é discutida. / Parasitoids regulate their hosts physiological processes in order to produce suitable conditions for their own development by employing molecules produced by maternal tissues, the immature parasitoid and derived tissues, and associated simbionts (polidnavirus PDV). These molecules represent, therefore, an untapped resource of new molecules for the development of alternative pest control methods. Our objective was to exploit the hostparasitoid interactions aiming at the identification of molecules involved in host regulation for their use in the development of alternative strategies for pest control. The search for new molecules was concentrated on the interaction Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) by assessing i) the effects of parasitization on the host digestive physiology and ii) the contribution of the venom gland and ovary in producing regulatory molecules, and by iii) the characterization of cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes. The potential application of molecules from hostparasitoid associations was verified by characterizing the activity of a putative chitinase isolated from the interaction Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae) using recombinant proteins and geneticallymodified tobacco plants. Data obtained demonstrated parasitized larvae had reduced relative growth (RGR), consumption (RCR) and metabolic (RMR) rates, while an increased efficiency in the conversion of the digested food (ECD) was obtained as compared to unparasitized larvae. Larvae parasitized by C. flavipes retained the food in the gut for a longer period and had higher activities for -amylase, sacarase and trehalase if compared to control larvae. Analysis of the transcriptome of the venom gland and ovary of C. flavipes predicted a large number of unknown proteins. Nevertheless, several proteases, a protease inhibitor and an antimicrobial protein from the venom gland, and an early-expressed protein (ep1), with a putative role in the process of host regulation from the ovaries, were identified. Two cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes were putatively identified as a serpin and an eukaryote translation inhibitory factor (CfHTIF). Both were detected in teratocytes from day 5 of parasitism and onwards, with the CfHTIF being also detected in hemocytes of parasitized hosts. Comparative analysis of the CfHTIF indicated it is highly homologous to host translation inhibitory factors produced by PDVs associated with other species of Cotesia, indicating its possible viral origin and suggesting this to be the first record of teratocytes as a source of PDV-derived proteins for host regulation. The characterization of the activity from the chitinase isolated from teratocytes of T. nigreceps (Tnchi) and the evaluation of its biotechnological potential via plant transgenesis to control larvae of H. virescens indicated this chitinase can bind to colloidal and crystalline chitins in in vitro assays, but it does not display chitinolytic activity. Assays with transformed tobacco plants expressing Tnchi did not result in any effect to H. virescens larval development and survival. Although Tnchi did not have any chitinolytic activity, it did show to have an antimicrobial effect. The possible exploitation of this protein for production of economically-important plants is dicussed.

The red imported fire ant, Solenopsis invicta, is a South American native introduced in Alabama in the early 20th century. This predatory species has rapidly spread throughout the southeastern US and parts of the West Indies, inflicting great ecological and economic damage. For example, Solenopsis invicta is known to attack the eggs and hatchlings of ground nesting birds and reptiles. The ants swarm into the nests attacking hatchlings and diminishing their chance for survival. My thesis research aimed to survey the distribution of ants on sea turtle nesting beaches in South Florida and St. Croix, USVI, and to evaluate the possible threat of Solenopsis invicta and other predatory ants to sea turtle hatchlings. / Includes bibliography. / Thesis (M.S.)--Florida Atlantic University, 2013.

Neste estudo foram avaliados os efeitos da subunidade CB (FLA2 isolada do veneno da serpente C. d. terrificus) em células endoteliais quanto: 1) síntese de PGI2 e mecanismos e 2) mecanismos inibitórios sobre moléculas de adesão. Os resultados mostraram que a liberação de PGI2 induzida pela CB depende de COX-1, PGIS, cFLA2, ERK1/2, mas não de COX-2, NF-kB, p38, JNK, iFLA2, receptor IP, AC ou PKA. Em adição, a CB aumentou os níveis de PGIS, mas não de COX-1 ou COX-2. Ainda, a CB inibiu a expressão de ICAM-1 e VCAM-1, mas não de PECAM-1, induzidas pelo LPS. Em relação aos mecanismos da ação inibitória da CB, foi demonstrado que o PPAR-α e -β/δ, IP, AC, PKA e a PGI2 são relevantes para inibição de ICAM-1, mas não de VCAM-1, induzida pelo LPS. Além disso, a CB inibiu a expressão gênica de ICAM-1, VCAM-1, TNF-α e IL-6, induzida pelo LPS. Este estudo evidenciou importantes vias na ação inibitória da FLA2 crotálica, em um evento fundamental da resposta inflamatória e trouxe a melhor compreensão das atividades biológicas desencadeadas por esta FLA2 em células endoteliais. / In this study the effect of CB, a phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom, in cultured endothelial cells was investigated, with focus on: i) biosynthesis of prostacyclin (PGI2) and related mechanisms, and ii) inhibitory mechanisms on expression of ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 adhesion molecules. Results showed that COX-1, PGI2 synthase (PGIS), cPLA2, ERK1/2 and MEK1/2, but not COX-2, NF-kB, p38, JNK, iPLA2, IP receptor, cyclase adenylate nor PKA, are involved CB-induced PGI2 biosynthesis. In addition, CB up-regulated PGIS, but not COX-1 nor COX-2 protein levels. Moreover, CB was able to inhibit LPS-induced ICAM-1 and VCAM-1, but not PECAM-1 protein expression. PPAR-α and -β/δ, IP receptor, cyclase adenylate, PKA and PGI2, but not PPAR-γ, are essential for CB-induced inhibition of ICAM-1. Furthermore, CB inhibited LPS-induced gene expression of ICAM-1, VCAM-1, TNF-α and IL-6. Inhibition of these cytokines by CB may be related to down regulation of both VCAM-1 and ICAM-1 seen in endothelial cells incubated with this venom PLA2.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 µmol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 µmol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 µmol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 µmol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 µmol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 µmol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

O escorpião Tityus serrulatus é o responsável pelos acidentes mais graves no Brasil. Dentre os componentes já estudados de sua peçonha estão neurotoxinas capazes de interagir com canais iônicos, além de peptídeos biologicamente ativos também estarem presentes. Neste estudo foram isolados peptídeos da fração de baixa massa molecular da peçonha que interagiram com as oligopeptidases timet oligopeptidase (EP24.15) e neurolisina (EP24.16) através do emprego de substratos fluorescentes específicos como ferramentas. Usando espectrometria de massas, as sequências KEILG, FTR, YLPT e do análogo KELLG foram determinadas e posteriormente sintetizadas. In vitro, os peptídeos não foram substratos para enzimas já citadas, além de testes com a neprelisina e ECA. Em relação à inibição, os destaques ficam por conta de KELLG e KEILG, capazes de inibirem a EP 24.15 e de não inibirem a EP 24.16. Outro destaque foi o YLPT, apresentando um Ki de 0,94 mM perante a neprilisina. In vivo os peptídeos foram testados em relação à nocicepção, rolamento de leucócitos e reatividade vascular, onde se destacou o FTR, apresentando efeito antinociceptivo e o KEILG, capaz de aumentar o número de leucócitos, ressaltando a importância de pequenas moléculas na composição da peçonha. / The scorpion Tityus serrulatus is responsible for the most serious accidents in Brazil. Among the components already studied in its venom, neurotoxins are able to interact with ion channels, and peptides with biological activity are also present. In this study, peptides from low molecular weight fraction of the venom that interacted with the oligopeptidases thimet oligopeptidase (EP24.15) and neurolysin (EP24.16) were isolated using specific fluorescent substrates as a tool. Sequences from the peptides KEILG, FTR, YLPT and the analogue KELLG were determined by mass spectrometry and subsequently synthesized. In vitro, the peptides were not substrates for those enzymes, neither for neprilysin and ACE enzymes. Concerning inhibition, the highlights are the KELLG and KEILG, which were able to inhibit EP 24.15 but not EP 24.16. Another peptide thats worth to mention is YLPT, with a Ki of 0.94 mM for neprilysin. In vivo, the peptides were tested for nociception, rolling of leukocytes and vascular reactivity, being the FTR distinguished to be able to cause antinociceptive effect and KEILG to increase the number of leukocytes. These results emphasize the importance of small molecules in the scorpion venom constitution.

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-18Bitstream added on 2014-06-13T19:19:38Z : No. of bitstreams: 1 cabrera_mps_dr_sjrp.pdf: 1625766 bytes, checksum: 6073fec2bef34125e9db4700102a3680 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídeos biologicamente ativos, extraídos de veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as quais alimentam suas larvas. Esses peptídeos que são desgranuladores de mastócitos, apresentam atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são catiônicos, com alta proporção de resíduos carregados e polares, e são lineares e helicoidais em meios miméticos de membranas. Buscamos correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes composições, analisada em experimentos de fluorimetria, às mudanças conformacionais, induzidas por diferentes ambientes miméticos, monitoradas por dicroísmo circular, complementando com a análise das características físico-químicas como comprimento da cadeia, amidação do terminal-C, carga líquida, influências no macrodipolo da hélice, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e ângulo polar. Observamos que estes peptídeos apresentam intensa atividade em membranas modelo, interagem preferencialmente com bicamadas aniônicas, e sua atividade lítica acontece de modo cooperativo tanto em vesículas aniônicas como nas zwitteriônicas. Com exceção de Anoplin, todos os peptídeos com ação antimicrobiana apresentam curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso sugere que esses peptídeos se acumulam na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica, além da qual o vazamento aumenta cooperativamente. De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, são também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do tipo PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L. / Solitary wasps use their venoms to paralise prays to feed their larvae. A set of biologically active peptides, obtained from these venoms, have been investigated in relation to the conformational changes they undergo in anisotropic environments and their lytic activity on zwitterionic and anionic vesicles. These peptides are mast cell degranulators, present antimicrobial activities and most of them are not hemolytic. They are cationic, their chain length are 10 to 15 residues long, with high hydrophilic / hydrophobic ratio; they are linear and helical in membrane mimetic environments. We searched correlation between the lytic activity in vesicles of different compositions, monitored in fluorimetric experiments, and conformational changes, induced by varied mimetic media, monitored by circular dichroism. The results have been also correlated with peptides' physical-chemical parameters such as chain length, amidated or carboxylated C-terminal, net charge, influences on the helix macrodipole, hydrophobicity, hydrophobic moment and polar angle. We observed that these peptides present intense activity on model membranes, they interact preferentially with anionic bilayers, and their lytic activity is a cooperative process either in anionic or in zwitterionic vesicles. Exception made to Anoplin, all the other peptides that have antimicrobial activity present in their dose-response curves a sigmoidal dependence with the peptide concentration. This fact suggests that these peptides accumulate on the vesicles surface until they reach a threshold concentration, beyond which leakage increases cooperatively. As a general rule, the most efficient antimicrobial peptides are also those characterized by efficient permeabilization of anionic vesicles, namely PCPG 7030 and by small threshold P/L ratios.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

Snake venoms are a complex mixture of polypeptide and other molecules that adversely affect multiple homeostatic systems within their prey in a highly specific and targeted manner. Amongst the most potently toxic venoms in the world are those of the Australian venomous snakes, which belong almost exclusively to the elapid family. Their venoms posses a number of unique properties by which they target the mammalian cardiovascular and neuromuscular systems and are the focus for the identification of novel pharmacologically interesting compounds which may be of diagnostic or therapeutic benefit. Although much is known about the biochemical properties of Australia snake venoms as a whole, little research attention has focused upon individual components at the molecular level. This thesis describes the cloning, characterisation and comparative analysis of a number of unique toxins from the venom gland of the coastal taipan (Oxyuranus scutellatus) and a total of seven other related Australian snakes. These include the factor X- and factor V-like components of a prothrombin activator that causes a highly coagulable state in mammals. Comparative analysis of the sequences identified in this study, along with recombinant expression of an active form of the factor X-like component, provides important information on the structural, functional and evolutionary relationships of these molecules. Numerous other toxins were similarly identified and characterised including a pseudechetoxin-like protein, multiple phospholipase A2 enzymes and neurotoxin isoforms as well as vasoactive venom natriuretic peptides. Identified transcripts included not only toxin sequences but also other cellular peptides implicated in toxin processing, including a calglandulin-like protein. This thesis is the first description of the majority of these molecules at either the cDNA or protein level, and provides a means to study the activity of individual components from snake venoms and probe their function within the systems they specifically target. This study represents the most detailed and comprehensive description to date of the cloning and characterisation of different genes associated with envenomation from Australian snakes.