Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValerianoZapana_JoseAntonio_M.pdf: 9614816 bytes, checksum: f7fe976f2fbaf3eab37af937d9930859 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_D.pdf: 3134117 bytes, checksum: 3177d146a01c9214975aac2e9aebd929 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os venenos de serpentes são uma mistura complexa de moléculas funcionais sendo em sua maior parte proteínas. Para a perpetuação da espécie, e sendo selecionadas a partir do processo de seleção natural, as serpentes apresentam uma alta variabilidade de mutações gênicas responsáveis por expressar proteínas e componentes dos venenos ocorrendo um processo denominado de microevolução, com isso criou diversas toxinas com uma alta complexidade funcional e uma alta similaridade estrutural. Essas toxinas são responsáveis por uma grande variedade de efeitos farmacológicos que geram alterações fisiológicas e com isso imobilizando a presa (neurotoxicidade e miotoxicidade) impedindo a fuga do local de ataque, tendo componentes nos venenos que também iniciam a digestão da presa facilitando a alimentação da serpente. Estas toxinas têm sido utilizadas como ferramentas moleculares para uma melhor compreensão de processos fisiológicos. Através da identificação de modificações químicas em aminoácidos específicos e sequenciamento de "de novo" através de espectrometria de massas de PLA2s isoladas a partir do veneno de serpentes, foi possível correlacionar estrutura e função destas enzimas e elucidar certos mecanismos de ações farmacológicas específicas. As modificações químicas através dos reagentes p-BPB e AA da Bbil-TX foram identificadas e confirmadas por espectrometria de massas, apresentando um alto grau de eficiência e especificidade dos reagentes por aminoácidos específicos (lisina para o AA e histidina para o p-BPB). Após três etapas de purificação de uma nova PLA2 K49 isolada do veneno de Bothriopsis taeniata, denominada Btt-TX, esta foi submetida a duas diferentes enzimas de clivagem (tripsina e Lys-C) e os peptídeos gerados aplicados a um sistema de LC MS/MS aplicando-se diferentes métodos de fragmentação dos peptídeos digeridos como CID/HCD/ETD, com isso foi possível obter uma variedade de padrões complementares dos peptídeos fragmentados, sendo feito o sequenciamento "de novo" automático através da sobreposição dos peptídeos gerados pela combinação destas diferentes metodologias, permitindo obter 100% de cobertura da sequencia de aminoácidos. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal / Abstract: The snake venoms are a complex mixture of functional molecules and in the most part of proteins. For the preservation of the species and suffering a natural selection process, the snakes show high genic variability responsible for the protein expressions and compounds present in the venom, occurring an microevolution process, in this way several toxins with a high functional complexity and structural similarity was created. These toxins are responsible for various pharmacological effects that produces many physiological disturbs (neurotoxicity and myotoxicity) which immobilize the prey keeping near from the local of the attack and having some venom components that start the digestion of the prey. Toxins are often used as a molecular tool to get a better comprehension of physiological process. Through identification of chemical modifications in specific amino acids and make a "de novo" sequence by mass spectrometry on isolated PLA2s from snake venom correlating function and structure of these enzymes trying to elucidate some specific pharmacological actions. All the chemical modification at the Bbil-TX by the reagents p-BPB and AA was identified and proved by mass spectrometry, showing a high level of efficacy and specificity of the reagents from specific amino acids (lysine for the AA and histidine for the p-BPB). After the purification of a new PLA2 K49 isolated from the Bothriopsis taeniata snake venom, called Btt-TX, submitting it to two different cleavage enzymes (trypsin and Lyc-C) and the generated peptides injected to an LC MS/MS system. Applying different fragmentation mode, such as, CID/HCD/ETD, it was possible obtain a variety of additional and complementary patterns of fragmented peptides. With the obtained data we did the "de novo" automatic sequence through the overlapping of the generated peptides from all the fragmentation methods, allowing to have 100%. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal. Our structure/function studies showed that the C-terminal region and the presence of the highly hydrophobic amino acid residues as well as the lisines presence are responsible for the anchorage and disrupt membrane, promoting the myotoxic effetc. The N-terminal loss in the Btt-TX, prove the importance of this region in anchoring with the cell membrane and increasing interaction with amino acids of these PLA2s, allowing a better interaction with the lisines increasing the penetration efficiency of the hydrophobic amino acids on C-terminal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Escorpiões da família Buthidae estão envolvidos na maioria dos envenenamentos em todo o mundo. Tityus é um dos gêneros dessa família, sendo Tityus serrulatus a espécie mais perigosa, por estar envolvida em envenenamentos graves, nos quais as vítimas são crianças, podendo levar a óbito. As manifestações da picada incluem dor local, hipersensibilidade, hipertensão, manifestações cardiovasculares e edema pulmonar. A peçonha do T. serrulatus contem, entre outros componentes, várias toxinas que atuam em canais de K+, Na+ e Ca2+ e que são responsáveis pelos efeitos tóxicos do veneno. Estudos recentes mostraram que a peçonha de T. serrulatus pode ativar macrófagos que são críticos na resposta imune e desempenham papel fundamental na resposta humoral e celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos diretos dessas peçonhas sobre linfócitos humanos. Considerando que a modulação de funções celulares como proliferação, ativação e produção de citocinas pode desempenhar papel importante em envenenamentos, o presente estudo propôs: a) avaliar o efeito citotóxico do veneno bruto de Tityus serrulatus (VTs) sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); b) analisar o efeito do VTs sobre a modulação da expressão de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 e CD19) e de marcadores de ativação celular, incluindo CD69, CD25 e HLA-DR em células T e B; c) avaliar o efeito do VTs sobre a proliferação de linfócitos T; d) avaliar a capacidade do VTs em modular a produção de citocinas pelas PBMC. Ensaios de citotoxicidade foram realizados pela técnica do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) e mostraram que as concentrações de 500, 1000 e 2000 ?g/mL do VTs apresentaram citotoxicidade baixa a moderada para PBMC (12,7, 22,2 e 23,7% de redução na viabilidade celular, respectivamente). Concentrações de 25, 50 e 100 ?g/mL não foram citotóxicas. Com base nesses ensaios, estas ultimas concentrações foram utilizadas nos ensaios subsequentes. A citometria de fluxo foi empregada para avaliação da proliferação celular, da expressão de marcadores fenotípicos e de ativação celular, bem como para a quantificação de citocinas nos sobrenadantes de culturas celulares. As concentrações utilizadas não induziram alterações significativas nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, CD8+ e B, após 24h de cultivo. O ensaio de proliferação celular, utilizando marcação concomitante com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) e anticorpos monoclonais contra marcadores fenotípicos e marcadores de ativação celular, permitiu que se avaliasse não só a proliferação, mas a discriminação das diferentes subpopulações celulares e o estado de ativação das mesmas após 96h de cultivo. Os resultados sugerem que o VTs inibe a proliferação de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina (PHA), e em especial a porcentagem de linfócitos T CD8+CD25+ (linfócitos T citotóxicos ativados). O VTs não foi capaz de induzir proliferação celular. Em contraste, o VTs quando adicionado isoladamente à cultura de PBMC, nas concentrações de 50 e 100 ?g/mL, induziu a produção de IL-6 (p<0,05 e p<0,01, respectivamente), uma citocina pró-inflamatória que desempenha papeis importantes nas respostas imunes ii inata e adaptativa. A secreção aumentada de IL-6, portanto, não está vinculada a aumento na proliferação celular. A presença do VTs concomitantemente à PHA apresentou tendência para inibição da produção de citocinas por células estimuladas com a PHA, como IL-10, TNF e IFN-gama. Os resultados sugerem que o VTs é uma fonte potencial de substâncias com ações imunomoduladoras sobre linfócitos T humanos e estimulam novas investigações para o esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos, incluindo estudos que considerem a participação dos canais iônicos de linfócitos T nos fenômenos observados. Essas investigações, juntamente com a identificação dos componentes da peçonha, responsável pela atividades observadas, poderão contribuir para a descoberta de ferramentas para estudo dos mecanismos fisiopatológicos do envenenamento, bem como para a descoberta de novas alternativas de tratamento para doenças mediadas pelo sistema imune. / Scorpions of the Buthidae family are involved in most envenomations worldwide. Tityus is one of the genera of this family, being Tityus serrulatus the most dangerous species, because it is involved in severe envenomation, in which the victims are children and it can lead to death. The manifestations of scorpion sting are classified from mild to severe and its clinical signs include local pain, hypersensitivity, hypertension, cardiovascular manifestations and pulmonary edema. T. serrulatus venom contains, among other components, various toxins that act on K+, Na+ and Ca2+ channels, and are responsible for the toxic effects of the venom Recent studies showed that the venom of T. serrulatus (VTs) can activate macrophages that are critical to immune response and play a key role in the humoral and cellular response. However, little is known about the direct effects of these venoms on human lymphocytes. Considering that the modulation of cellular functions such as proliferation and induction of citokines production may play an important role in envenomation, the study proposed: a) to evaluate the cytotoxic effects of crude venom on peripheral blood mononuclear cells, b) to examine the effect of VTs on the modulation of expression of phenotypic markers (CD3, CD4, CD8 and CD19) and markers of cellular activation, including CD69, CD25 and HLA-DR on T and B cells c) to evaluate the VTs effect on the proliferation of T lymphocytes d) to evaluate the ability of VTs to modulate cytokine production by PBMC. Cytotoxicity assays were performed by the technique of MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) and showed that VTs concentrations of 500, 1000 and 2000 ?g/mL showed low to moderate cytotoxicity to PBMC (12.7, 22.2 and 23.7% reduction in cell viability, respectively). Concentrations of 25, 50 e 100 ?g/mL were not cytotoxic. Based on these tests, these concentrations were used in subsequent trials. Flow cytometry was used to assess cell proliferation, expression of phenotypic markers and cell activation, as well as for the quantification of cytokines in supernatants of cell cultures. The concentrations used did not induce significant changes in subpopulations of lymphocytes and did not modify the expression of activation markers on CD4+, CD8+ and B cells, after 24 hours of culture. The cellular proliferation assay, using simultaneously diacetate carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and monoclonal antibodies against phenotypic markers and cell activation markers, allowed the evaluation not only of proliferation, but the discrimination of different cell subpopulations and activation state of the same after 96h of culture. The results suggest that VTs inhibits the proliferation of lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA), and in particular the percentage of T lymphocytes CD8+ CD25+ (activated cytotoxic T lymphocytes). The VTs were not able to induce cell proliferation. In contrast, the VTs when added alone to the culture of PBMC at concentrations of 50 and 100 ?g/mL induced production of IL-6 (p <0.05 and p <0.01, respectively), a proinflammatory cytokine that plays important roles in innate and adaptive immune responses. The increased secretion of IL-6, therefore, is not linked to increased cell proliferation. The presence of VTs concurrently with PHA tended to inhibit cytokine production by cells stimulated with PHA, as IL-10, TNF and iv IFN-gamma.The results suggest that the VTs is a potential source of substances with immunomodulatory actions on human T lymphocytes and stimulate further research to elucidate the mechanisms of action involved, including studies to consider the participation of ion channels of T lymphocytes in the phenomena observed. These investigations, along with the identification of the components of the venom responsible for the observed activities may contribute to the discovery of tools to study the pathophysiological mechanisms involved in the envenomation as well as for the discovery of new treatment alternatives for diseases mediated by the immune system.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

Em 1987 o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde iniciou o uso do Veneno Botrópico de Referência Nacional (VBRN), que é a primeira extração das serpentes B. jararaca recém-chegadas da natureza. Em 10 anos notou-se uma queda de 67,65% na recepção de serpentes ao Instituto Butantan (IB), e na distribuição geográfica, resultando em uma maior heterogeneidade na composição do VBRN. Assim, comparamos os venenos das serpentes nascidas em cativeiro (VP) do Laboratório de Herpetologia do IB com o VBRN, para verificar a possibilidade de incorporar o VP na preparação dos lotes do VBRN. O VP mostrou-se estatisticamente semelhante ao VBRN nos testes de dosagem de proteínas, SDS-PAGE, 2DE, cromatografia, atividade fosfolipásica, ELISA, Western blotting, dose mínima coagulante (plasma) e hemorrágica, enquanto para as atividades de L-aminoácido oxidase, caseinolítica, zimografia e dose mínima coagulante (fibrinogênio) o VP mostrou-se diferente do VBRN. Para as doses letais e efetiva dos venenos o pool do VP com VBRN foi mais eficaz do que os VP e o VBRN sozinhos. / In 1987, The National Institute of Quality Control in Health in Brazil (INCQS) established the Brazilian Reference Bothrops Venoms (BRBV), which should be composed of the first extractions of newcomers wild snakes. In 10 years there has been a decrease of 67.65% in the reception snakes to Butantan Institute (IB), and geographic distribution, resulting in a higher heterogeneity in BRBV composition. So, we compared the venom samples of snakes born in captivity (SVP) of IB Herpetology Laboratory with BRBV to check the possibility of incorporating the SVP in the preparation of batches of BRBV. SVP was statistically similar to BRBV the proteins dosage, SDS-PAGE, 2DE, chromatography, phospholipase, ELISA, Western blotting, minimum coagulant dose (plasma) and hemorrhage dose, while for L-amino acid oxidase activity, caseinolytic, zymography and minimum coagulant dose (fibrinogen) SVP was shown to be different from BRBV. For effective and lethal doses of pool with SVP and BRBV it was more effective than SVP and BRBV alone.

As fosfolipases A2 (PLA2s) de peçonhas de serpentes compreendem um grupo de enzimas de massas moleculares variáveis entre 14.000 e 18.000, e são responsáveis por vários efeitos tóxicos induzidos pela peçonha destes animais, tornando-se necessária a busca por inibidores naturais de PLA2¬s. O presente trabalho propôs a caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de duas proteínas inibitórias isoladas do plasma da serpente Bothrops jararacussu (BjussuMIPs), que neutralizam as atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de diferentes PLA2s. Estes inibidores foram isolados por cromatografia de afinidade em miotoxina-Sepharose, demonstrando que ambos são glicoproteínas com massas moleculares de 24.000 (BjussuMIP) e 23.500 (BjussuMIP) para os monômeros e de 120.000 (BjussuMIP) e 160.000 (BjussuMIP) para os oligômeros. O tratamento dos BjussuMIPs com a N-glicosidase F reduziram os seus pesos moleculares para aproximadamente 18.000, mas não afetaram suas atividades inibitórias sobre PLA2s, sugerindo que os carboidratos tem pouco ou nenhum papel na associação dos BjussuMIPs com estas enzimas. A análise do BjussuMIP por dicroísmo circular mostrou 44% de -hélice, 18% de folhas , 10% de voltas e 28% de estruturas aleatórias. O cDNA obtido por PCR a partir do fígado desta serpente revelou 432 pb (BjussuMIP) e 543 pb (BjussuMIP) que codificam para 144 e 181 resíduos de aminoácidos, respectivamente. O alinhamento da sequência de BjussuMIP com a de outros inibidores do tipo , denominados de PLIs, apresentou 73-92% de similaridade e o BjussuMIP mostrou 89-94% com inibidores do tipo PLIs. Os BjussuMIPs demonstraram ser relativamente estável a variações de pH (6-12) e temperatura, entretanto, perderam atividade inibitória quando submetido a altas temperaturas. A caracterização funcional indica que os BjussuMIPs apresentaram propriedades inibitórias sobre diferentes PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Ambos BjussuMIPs revelaram propriedades farmacológicas como a inibição das atividades fosfolipásica, anticoagulante, miotóxica, indução de edema, citotóxica, bactericida e letal. Os resultados obtidos demonstram que o BjussuMIP mostra maior afinidade sobre as PLA2s homólogas Lys49 como BthTX-I e PrTX-I, enquanto que o BjussuMIP apresenta-se mais específico para PLA2s Asp49, sugerindo uma especificidade entre os BjussuMIPs e tipos de PLA2s. Além disso, ambos os inibidores mostraram ser eficazes na suplementação do antiveneno botrópico em diferentes concentrações, resultando no aumento da capacidade do soro em neutralizar toxinas de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre possíveis mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos inibitórios exercidos pelos BjussuMIPs, assim como auxiliar o tratamento do envenenamento ofídico pela suplementação da soroterapia tradicional. / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms comprise a group of enzymes with molecular weights varying from 14,000 to 18,000, and are responsible for several toxic effects induced by the venom of these animals, making important the search for natural inhibitors of PLA2s. The present work proposed the biochemical, pharmacological and structural characterization of two protein inhibitors isolated from the plasma of Bothrops jararacussu snake (BjussuMIPs), which neutralize the enzymatic, toxic and pharmacological activities of different PLA2s. These inhibitors were isolated by an affinity chromatography on myotoxin-Sepharose, showing that both are glycoproteins with molecular weights of 24,000 (BjussuMIP) and 23,500 (BjussuMIP) for the monomers and 120,000 (BjussuMIP) and 160,000 (BjussuMIP) for the oligomers. The treatment of BjussuMIPs with N-glucosidase F reduced their molecular weights to about 18,000, but did not affect their inhibitory activity on PLA2s, suggesting that the carbohydrates have little or no role in the association of these BjussuMIPs with these enzymes. The analysis of BjussuMIP by circular dichroism showed 44% of -helix, 18% of sheets, 10% of turns and 28% of random structures. The cDNA obtained by PCR from the snake liver showed 432 bp for BjussuMIP and 543 bp for BjussuMIP, which encode for 144 and 181 amino acid residues, respectively. The alignment of the sequence of BjussuMIP with those from other -inhibitors (PLIs) showed 73-92% of similarity and 89-94% for the BjussuMIP compared to other PLIs. The BjussuMIPs showed to be relatively stable to changes in pH (6-12) and temperature, however lost of its activity when submitted to high temperatures. The functional characterization indicates that both BjussuMIPs presented inhibitory properties on different snake venom PLA2s from the genera Bothrops and Crotalus. Both BjussuMIPs showed pharmacological properties such as inhibition of phospholipase, anticoagulant, myotoxic, cytotoxic, bactericidal, edema-inducing and lethal activities. The results show that BjussuMIP presents higher affinity to Lys49-PLA2 homologous, such as BthTX-I and PrTX-I, while BjussuMIP is more specific to Asp49-PLA2s, suggesting specificity between BjussuMIPs and types of PLA2s. Moreover, both inhibitors proved effective in the supplementation of Bothrops antivenom at different concentrations, resulting in an increased capacity of serum in neutralizing snake toxins. The issues reported in this work could bring additional information on possible mechanisms of action and may result in better understanding of the inhibitory effects exerted by these BjussuMIPs, as well as assist the treatment of ophidian envenomations by supplementation of the traditional serum therapy.

O envenenamento crotálico é responsável por, aproximadamente, 10% dos acidentes causados por serpentes peçonhentas no Brasil. A peçonha crotálica possui ação neurotóxica, miotóxica, nefrotóxica e coagulante. Insuficiência renal aguda (IRA) é a principal complicação nas vítimas que sobrevivem aos efeitos iniciais da peçonha, sendo importante causa de óbito para esses pacientes. Os objetivos deste estudo foram determinar prospectivamente a prevalência e os fatores de risco relacionados ao desenvolvimento de IRA após envenenamento crotálico. Foram estudadas 100 vítimas de acidente crotálico admitidas no Hospital Doenças Tropicais (HDT) de Goiânia-GO, no período de 07/1998 a 05/2000 e de 08/2001 a 03/2003 (43 meses). Os pacientes foram tratados com soro antiofídico específico (SAC) e estudados desde a admissão até alta hospitalar ou óbito. IRA foi definida como depuração de creatinina endógena (FG) < 60 mL/min/1,73m² nas primeiras 72 horas após o acidente. Os dados foram expressos como mediana (faixa de variação) ou % e analisados pelos testes de Mann-Whitney e Fisher e por regressão logística (RL). Vinte e nove pacientes desenvolveram IRA (29%) e 7 (24% dos pacientes com IRA) realizaram diálise. Ocorreram 3 óbitos, todos no grupo de pacientes com IRA. Comparando-se os pacientes que desenvolveram IRA e os que mantiveram FG = 60 mL/min/1,73m², constatou-se que os primeiros apresentaram menor superfície corpórea [1,55 (0,6-2,3) vs 1,7 (0,6-2,1) m², p= 0,0097], receberam SAC mais tardiamente [12 (2-48) vs 2 (1-14) h, p < 0,0001] e em maior quantidade [190 (90,4-536) vs 158 (75-500) mg/m², p < 0,0001], apresentaram maior prevalência de acidentes graves [26 (90%) vs 38 (54%), p = 0,0005], maior prevalência de ptose palpebral [29 (100%) vs 50 (70%), p = 0,0003], maior prevalência de tempo de coagulação (TC) anormal [24 (83%) vs 36 (51%), p = 0,003], menor diurese na admissão [62,4 (0-182) vs 99,6 (24,6-325) mL/h, p = 0,0004], menor valor de FG mínima [39 (0-54) vs 85 (61-110) mL/min/1,73m², p < 0,0001], maior elevação de creatinoquinase (CK) [50.250 (69-424.120) vs 1.108 (88-133.170) U/L, p < 0,0001] e menor FG de alta [87,5 (22-105) vs 102,1 (91-145) mL/min/1,73m², p < 0,0001]. Apesar de não ter havido significância estatística, pacientes com IRA também eram mais jovens [24 (3-59) vs 32 (3-61) anos, p = 0,09]. Os dois grupos receberam quantidade similar de hidratação. O modelo de RL foi baseado em TC anormal, idade ( 50 anos), tempo para receber SAC (> 120 min), CK de admissão (> 2.000 U/L) e diurese na admissão (> 90 mL/h). Idade < 12 anos (OR: 5,6, p = 0,026), tempo para receber SAC (OR: 11,1, p = 0,032), CK de admissão (OR: 12,7, p = 0,0009) foram identificados como fatores de risco independentes para o desenvolvimento de IRA, enquanto que diurese na admissão (OR: 0,20, p = 0,014) foi um fator independente associado à proteção. Estes resultados revelaram que IRA por envenenamento crotálico tem alta prevalência (29%). Demora em receber SAC, CK de admissão superior a 2.000 U/L e idade inferior a 12 anos foram fatores de risco independentes para desenvolver IRA. Diurese na admissão acima de 90 mL/h foi um fator protetor. / Approximately 10% of poisonous snakebites in Brazil are caused by Crotalus snakes. Its venom is neurotoxic, myotoxic, coagulant and causes renal injury. In fact, acute renal failure (ARF) is the major complication in patients surviving the early effects of the venom and a significant cause of death for these patients. The objectives of the present study were to assess prospectively the prevalence and risk factors for Crotalus venom-induced ARF. One hundred Crotalus snakebite patients admitted at Goiania\'s Tropical Diseases Hospital - GO, Brazil from July 1998 to May 2000 and August 2001 to March 2003 (43 months) were studied. The patients received specific antivenom (AV) and were evaluated from hospital admission until discharge or death. ARF was defined as creatinine clearance (GFR) < 60 mL/min/1.73m2 in the first 72 hours following the snakebite. Data are median (variation range) or % and were analyzed by Mann-Whitney\'s or Fisher\'s test and by logistic regression. ARF developed in 29 patients (29%) and 7 (24% of ARF patients) received dialysis. There were 3 deaths, all in the ARF group. When ARF patients were compared to patients that preserved GFR = 60 mL/min/1.73m2, it was found that ARF patients had smaller body surface area [1.55 (0.6-2.3) vs 1.7 (0.6-2.1) m², p = 0.0097], received AV therapy later [12 (2-48) vs 2 (1-14) hours, p < 0.0001], received larger AV amount [190 (90-536) vs 158 (75-500) mg/m², p < 0.0001], had higher % of accidents classified as severe [26(90%) vs 38 (54%), p = 0.0005], more palpebral ptosis [29(100%) vs 50 (70%), p = 0.0003], more cases with abnormal coagulation time (CT) [24 (83%) vs 36 (51%), p = 0.003], lower diuresis at admission [62.4 (0-182) vs 99.6 (24.6-325) mL/h, p = 0.0004], lower GFR nadir [39 (0-54) vs 85 (61-110)mL/min/1.73m², p< 0.0001], higher creatine kinase (CK) [50,250(69-424,120) vs 1,108 (88-133,170) U/L, p < 0.0001] and lower GFR at discharge [87.5 (22-105) vs 102.1 (91-145) mL/min/1.73m², p < 0.0001]. Patients with ARF were younger, but this difference did not reach statistical significance [24 (3-59) vs 32 (3-61) years, p= 0.09]. Both groups received similar amount of hydration. Logistic regression model was based on abnormal CT, age ( 50 years), time to AV administration (>120 min), CK at admission (> 2,000 U/L) and diuresis at admission (> 90mL/h). Age < 12 years (OR: 5.6, p = 0.026), time to AV administration (OR: 11.1, p= 0.032), CK at admission (OR: 12.7, p= 0.0009) were identified as independent risk factors for ARF, while diuresis at admission (OR: 0.20, p = 0.014) was an independent protective factor for renal function. These results showed that Crotalus venom-induced ARF has a high prevalence (29%) and that delay for AV treatment, CK values higher than 2,000 U/L at admission and age lower than 12 years were independent risk factors for the development of ARF. Diuresis at admission above 90 mL/h was a protective factor.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wally Victoria.pdf: 2663856 bytes, checksum: ecb49cfdc11a071bf247bc9d401b6d9d (MD5) Previous issue date: 2005-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the Amazon the accidents caused by venomous snakes represent a serious public health problem. Serotherapy neutralizes the systemic effects from the venoms, but not local effects; therefore, there is need for research on natural inhibitors of the local effects from snake envenomation. Andiroba (Carapa guianensis Aublet, 1775) is a plant from tropical and equatorial forests and its seeds produce an oil which has medicinal properties, with anti-inflammatory and antiseptic activities, and wound healing properties, besides being a fine repellent. With the objective of evaluating the activity of the andiroba oil on the local inflammation induced by Amazonian snakes, an experimental study was done on the general pharmacological effects of the andiroba oil and on the inflammatory process induced in mice by the venoms of Bothrops atrox and Crotalus durissus ruruima, two snakes species of epidemiological importance in the Amazon region. The inhibitory kinetics of the edema in mice was evaluated by measuring the paw edema diameter and by histopathological methods. There was a significant inhibition in the inflammatory infiltrate of 87,03% and 82,10% after 3 and 12 hours respectively, after treating with andiroba oil the paws induced with the venom of Bothrops atrox. With the venom of Crotalus durissus ruruima inhibition reached 89,37% and 75,60% after 3 and 6 hours respectively, after treatment with andiroba oil. There was significant reduction in the kinetics of the edema induced by the venom of Bothrops atrox (37,67%) and of Crotalus durissus ruruima (42,41%) as early as the first hour of treatment with andiroba oil. This reduction progressed to 50,64% (for Bothrops atrox) and 82,37% (Crotalus durissus ruruima) after three hours after treatment. Histologically, it was observed a reduction of the edema induced by Bothrops atrox venom by 29,18% after 3 hours. With the venom of Crotalus durissus ruruima the reduction of the edema was 30,87% after 3 hours. Neither haemorrhagy nor myonecrosis were reduced or inhibited by andiroba oil administrated intraperitoneally. It is suggested that the inhibitory activity of Carapa guianensis could be related to leucocitary migration reduction / Na Amazônia, os acidentes por serpentes peçonhentas constituem sério problema de saúde pública. A soroterapia neutraliza os efeitos sistêmicos do veneno, mas não os efeitos locais; portanto, são necessárias pesquisas sobre inibidores naturais dos efeitos locais do envenenamento. A andiroba (Carapa guianensis Aublet, 1775) é uma planta de florestas tropicais e equatoriais, cujas sementes fornecem um óleo com propriedades medicinais, com atividades antiinflamatória, cicatrizante e anti-séptica, além de ser um ótimo repelente. Com o objetivo de avaliar a atividade do óleo de andiroba na inflamação local induzida por venenos de serpentes amazônicas, foram estudados experimentalmente os efeitos farmacológicos gerais do óleo de andiroba e sua atividade sobre o processo inflamatório local, induzido em camundongos pelos venenos de serpentes Bothrops atrox ou Crotalus durissus ruruima, serpentes de importância epidemiológica na região da Amazônia. A cinética inibitória do edema em camundongos foi avaliada pela medição do diâmetro do edema das patas dos camundongos e por métodos histopatológicos. Após o tratamento com o óleo de andiroba, obteve-se uma inibição significativa no infiltrado inflamatório de 87,03% e 82,10%, às 3 e 12 horas respectivamente, nas patas experimentais induzidas com o veneno de Bothrops atrox. Com o veneno de Crotalus durissus ruruima a inibição atingiu 89,37% e 75,60%, às 3 e 6 horas, respectivamente, pós-tratamento. Quanto ao edema avaliado pela medição do diâmetro das patas dos camundongos, foi observada uma diminuição significativa em 37,67% no edema induzido pelo veneno de Bothrops atrox e em 42,41% no edema induzido pelo veneno de Crotalus durissus ruruima, a partir da primeira hora após a administração desses venenos nos grupos tratados com o óleo de andiroba. A redução dos edemas progrediu até 50,64% (para Bothrops atrox) e 82,37% (para Crotalus durissus ruruima) às 3 horas pós-tratamento. Histologicamente observou-se uma redução no edema induzido por Bothrops atrox de 29,18% às 3 horas pós-tratamento. Com o veneno de Crotalus durissus ruruima a redução do edema foi de 30,87% às 3 horas pós-tratamento. Nem a hemorragia e nem a mionecrose foram inibidas significativamente pela administração do óleo de andiroba por via intraperitoneal. Sugere-se que a atividade inibitória da Carapa guianensis poderia estar relacionada à diminuição da migração leucocitária

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O veneno do escorpiÃo Tityus serrulatus à uma mistura de peptÃdeos tÃxicos e nÃo tÃxicos com diversas aÃÃes locais e sistÃmicas. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos cardiovasculares e renais induzidos pelo veneno total do escorpiÃo T. serrulatus e de suas fraÃÃes TsTx-V, Toxina &#947; e NatriurÃtica. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) para os experimentos de perfusÃo de rim isolado, leito mesentÃrico, pressÃo arterial e perfusÃo in vivo. Para os ensaios de canal deferente foram utilizados camundongos Swiss (30-40g). O veneno de T. serrulatus apresentou efeito sobre o sistema nervoso autÃnomo observado atravÃs da contraÃÃo do vaso deferente. O veneno total mostrou efeito adrenÃrgico demonstrado pela reversÃo dos seus efeitos renais apÃs prÃ-tratamento dos rins com antagonista &#945;-adrenÃrgico prazosin, especialmente sobre a resistÃncia vascular renal (RVRVTs = 7,51  0,96 vs RVRPz = 5,51  0,43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0,05) e pressÃo de perfusÃo (PPVTs = 150,1  18,40 vs PPPz = 118,1  4,00 mmHg*,*p<0,05). As fraÃÃes isoladas mostraram efeitos renais somatÃrios, haja visto que TsTx-V promoveu aumento da diurese e a Toxina &#947; causou efeitos pressÃricos. ApÃs avaliaÃÃo histopatolÃgica dos efeitos renais das fraÃÃes isolados do veneno de T. serrulatus, observamos a presenÃa de material protÃico nos espaÃos urinÃrios glomerulares e nos tÃbulos. Entretanto, no leito vascular mesentÃrico, somente a toxina &#947; mostrou-se ativa. Os efeitos renais induzidos pela fraÃÃo natriurÃtica (0,03 e 0,1Âg/mL) revelaram aumento da pressÃo e, de maneira concentraÃÃo-dependente, diminuiÃÃo da reabsorÃÃo de eletrÃlitos e aumento da excreÃÃo urinÃria de guanosina monofosfato cÃclico (GMPc). Nos experimentos in vivo, tanto o veneno total quanto a fraÃÃo natriurÃtica causaram aumento da pressÃo arterial mÃdia (PAM) e diminuiÃÃo do hematÃcrito. Em adiÃÃo, a fraÃÃo natriurÃtica causou ainda a elevaÃÃo do fluxo urinÃrio e da freqÃÃncia cardÃaca. O clearance de inulina foi utilizado para a avaliaÃÃo da funÃÃo renal in vivo. O veneno total diminui significativamente o clearance da inulina, enquanto a fraÃÃo natriurÃtica causou elevaÃÃo. O fluxo plasmÃtico renal cortical, avaliado atravÃs do clearance de p-aminohipurato, foi reduzido por aÃÃo do veneno total de T. serrulatus. Em conclusÃo, o veneno de Tityus serrulatus promoveu efeitos hemodinÃmicos renais que foram prontamente revertidos in vitro pelo prazosin. Os experimentos in vivo mostraram que o veneno de Tityus serrulatus induziu a elevaÃÃo da pressÃo arterial mÃdia, taquicardia e alteraÃÃo da funÃÃo renal. / The venom of Tityus serrulatus has a mixture of toxic and non toxic peptides presenting diverse systemic and local effects. The aim of this work was to investigate the cardiovascular and renal effects promoted by the crude venom of the scorpion Tityus serrulatus and its isolated components such as Tityus serrulatus toxin V (TsTx-V), Gamma Toxin and the newly isolated Natriuretic Peptide. The experiments of isolated perfused rat kidney, isolated mesenteric bed, arterial pressure and in vivo perfusion were performed using male Wistar rats weighing 250-300g. The assays with vas deferens were done using Swiss mice weighing 30-40g. The crude venom presented autonomic nervous system effects showed by the contraction of vas deferens. Adrenergic effects were demonstrated specially with the decrease of renal vascular resistance (RVRVTs = 7.51  0.96 vs RVRPz = 5.51  0.43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0.05) and renal perfusion pressure (PPVTs = 150.1  18.40 vs PPPz = 118.1  4.00 mmHg*,*p<0.05) induced by the crude venom after kidneys pre-treatment with prazosin. The venoms isolated components showed kidney addictional effects, where TsTx-V caused diuresis while Gamma Toxin increased perfusion pressure. We could also observe the presence of protein inside the tubules and in glomerular spaces after renal histopathologic evaluation in the groups treated with the isolated components. However, only Gamma Toxin promoted an increase of the mesenteric bed perfusion pressure. The Natriuretic Peptide (0.03 and 0.1Âg/mL) increased renal perfusion pressure. In addition, the natriuretic peptide increased cyclic guanosine monophosphate (cGMP) urinary excretion, but reduced electrolytes reabsorption in a dependent-concentration manner. The crude venom and the natriuretic peptide increased the arterial blood pressure, but decreased the hematocrit values, evaluated after in vivo experiments. However, the natriuretic peptide increased urinary flow and heartbeat frequency. In vivo renal function was evaluated by the clearance of inulin. The scorpion crude venom decreased the clearance of inulin, but this parameter was increased after natriuretic peptide treatment. The renal cortex blood flux, estimated by the clearance of p-aminohippurate, was reduced after the crude venom treatment. In conclusion, we demonstrated that Tityus serrulatus venom induced renal hemodynamic effects that were blocked in vitro by prasozin. In vivo experiments showed how the crude venom and its isolated components act increasing arterial blood pressure, heartbeat frequency and altered renal function.

Trombocitopenia e diminuição da função plaquetária são achados comuns em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops. Sabe-se que o veneno de Bothrops jararaca (VBj) apresenta compostos com características pró e anti-agregantes plaquetárias, porém existem poucos estudos sobre a influência do veneno total assim como das principais famílias de proteínas que o compõem sobre as funções plaquetárias. A utilização de modelos experimentais é essencial para entender as desordens plaquetárias em humanos que culminam em sangramentos diversos. Portanto, o objetivo deste estudo foi (i) comparar as respostas ex vivo de plaquetas lavadas de humanos e de camundongos frente ao VBj, assim como entender a participação de serinaproteinases (SVSP) e metaloproteinases (SVMP) presentes no veneno sobre a agregação dessas plaquetas; e (ii) delimitar dentro do complexo proteico do veneno os compostos que induzem a trombocitopenia em camundongos após 3 horas do início do envenenamento botrópico. As plaquetas lavadas de humanos e camundongos BALB/c, C57BL/6 e do mutante natural pérola (Ap3b1-/-) apresentaram respostas de agregação máxima ao VBj na concentração de 24,4 ?g/mL, porém esta concentração provocou uma agregação menos intensa em plaquetas humanas quando comparada àquela observada nas linhagens BALB/c e C57BL/6. Mesmo em plaquetas de camundongos pérolas, deficientes em corpos densos plaquetários, o VBj se mostrou um potente agonista, promovendo a agregação plaquetária sem a necessidade da secreção do conteúdo granular. A ação agonista do veneno promoveu a secreção de ATP presente nos corpos densos plaquetários de humanos e das linhagens BALB/c e C57BL/6 de forma tão intensa quanto à provocada pela trombina, assim como a secreção de PF4 presente nos grânulos ? de plaquetas humanas e de camundongos BALB/c. Já em relação à secreção lisossomal, observou-se que as plaquetas humanas secretam níveis mais baixos de ?-hexosaminidase quando estimuladas com VBj do que pela trombina, enquanto que em plaquetas de camundongos BALB/c a secreção lisossomal ao VBj foi superior à constatada com a trombina. Os baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante das plaquetas estudadas mostraram ausência de atividade direta citotóxica pelo VBj. Para verificar se as principais classes de famílias de enzimas do VBj, SVMP e SVSP, estavam envolvidas na ativação plaquetária ex vivo, elas foram inibidas com Na2EDTA (13 mM) e AEBSF (8 mM), respectivamente. Observou-se que em plaquetas humanas as serinaproteases são importantes para a agregação ex vivo, enquanto a agregação das plaquetas de camundongos BALB/c foi independente dessa classe de toxinas. Os resultados dos ensaios in vivo demonstraram que as proteínas do VBj com peso molecular inferior a 50 kDa (UF < 50 kDa) são importantes para o estabelecimento da trombocitopenia em camundongos BALB/c que receberam essa fração por via subcutânea e que esse quadro é independente de manifestações hemorrágicas e do desenvolvimento de coagulopatia durante o envenenamento botrópico. A caracterização dos compostos presentes no UF < 50 kDa foi realizada por espectrometria de massas e foi observada a presença predominante de metaloproteinases (37%) e proteínas similares às lectinas do tipo-C (33%), enquanto serinaproteases (17%), fosfolipases A2 (10%) e outros compostos (3%) somaram 30% da fração UF < 50 kDa. Em conclusão, o veneno é um potente agonista plaquetário que promove agregação, aglutinação e secreção de plaquetas humanas e de camundongos, independente da secreção de corpos densos plaquetários, e a fração do veneno responsável pela trombocitopenia em camundongos BALB/c tem peso molecular menor que 50 kDa / Thrombocytopenia and platelet dysfunction are common findings in patients bitten by Bothrops jararaca snakes. Pro- and anti-aggregating toxins have been isolated from Bothrops jararaca venom (BjV), but only few studies have been carried out about the effects of crude BjV and its main families of enzymes on platelet function ex vivo, as well as to understand their relevance to the pathophysiological events that occur during B. jararaca envenomation. Animal models have been used to understand platelet disorders in humans that culminate in bleeding manifestations. Thus, the aim of this study was to investigate (i) the effects of BjV, and snake venom serine proteinases (SVSP) and snake venom metalloproteinases (SVMP) contained therein, on aggregation and secretion in suspensions of washed human and mouse platelets, and (ii) to determine the BjV fractions, obtained by ultrafiltration, that induce thrombocytopenia in BALB/c mice after 3 h of administration of Bothrops envenomation. Washed platelets from humans and BALB/c, C57BL/6 and pearl (Ap3b1-/-) mice showed maximal aggregation responses to BjV at the concentration of 24.4 ?g/mL. However, this concentration aggregated less intensely platelets from humans than BALB/c or C57BL/6 mice. Even in pearl mouse platelets, which are deficient in dense bodies, BjV proved to be a potent agonist, promoting platelet aggregation without the requirement of granule content secretion. Nonetheless, BjV induced secretion of ATP, present in dense bodies, and PF4, present in ? granules, in the same extent as thrombin, from platelets of humans and mice. In regard to lysosomal secretion, it was observed that human platelets secreted low ?-hexosaminidase levels when stimulated by BjV than thrombin, whereas in BALB/c platelets higher secretion was induced by BjV than by thrombin. Release of lactate dehydrogenase (LDH) was similar between BjV and thrombin, evidencing the absence of cytotoxic activity by BjV on platelets. Inhibition of SVMP and SVSP, using Na2EDTA (13 mM) and AEBSF (8 mM), respectively, demonstrated that SVSP are important for ex vivo aggregation only in human platelets, whilst BALB/c platelet aggregation was independent of both of them. In in vivo studies, only BjV toxins with molecular weight less than 50 kDa (UF50) caused thrombocytopenia when administered s.c. to BALB/c mice, and it was independent of hemorrhagic manifestations and consumptive coagulopathy. Characterization by mass spectrometry of these toxins present in UF50 showed the predominant presence of SVMP (37%) and type-C lectin proteins (33%) were observed, while SVSP (17%), phospholipases A2 (10%) and other proteins (3%) accounted for the remaining toxins in UF50. In conclusion, BjV is a potent platelet activating agent that promotes aggregation, agglutination and secretion of human and mouse platelets, independent of secretion of dense platelet bodies, and the fraction of venom responsible for thrombocytopenia in BALB / c mice has a molecular weight less than 50 kDa