Submitted by Marco Antonio Oliveira da Silva (maosilva@ipen.br) on 2016-12-21T18:09:44Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-12-21T18:09:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A Austrália é um país cuja fauna é um repositório de potenciais novos biofármacos, pois se encontram no continente os animais mais mortais do planeta, dentre eles, as serpentes. A serpente Pseudechis australis (Mulga snake) é a maior serpente venenosa da Austrália e tem ampla distribuição geográfica. Os venenos de serpentes são complexas misturas com proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Devido à riqueza de seus componentes, várias moléculas encontradas no veneno vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, como agentes anticoagulantes ou analgésicos. Apesar dessas informações, existem poucos dados disponíveis sobre os componentes específicos deste veneno. O presente trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar as proteases desse veneno, ainda não descritas, um primeiro passo para compreender o papel destas enzimas no processo de envenenamento, assim como seus inibidores endógenos. Estes desempenham uma função protetora da glândula de veneno, inibindo a ação das enzimas in loco, prevenindo assim a degradação do tecido glandular por estas toxinas. O interesse nestes inibidores está relacionado ao seu potencial uso na terapia de diversas doenças como distúrbios da coagulação, hipertensão e câncer. / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:45:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Floriano_RafaelStuani_D.pdf: 3786286 bytes, checksum: a2855e3dd5b20280b1bf65e08007ab09 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho, nós examinamos a atividade neuromuscular do veneno de Bothriopsis bilineata smaragdina (serpente de floresta) e de sua toxina Bbil-TX (fosfolipase A2 Asp49) em preparações nervo-músculo isoladas de vertebrados. Em preparações BC, o veneno causou bloqueio neuromuscular concentração-dependente (0,1-30 ?g/mL) que não foi reversível por lavagem, com 50% de bloqueio ocorrendo em 90-15 min. Contratura muscular em resposta à ACh exógena e ao KCl não foram afetadas pelo veneno, mas houve um discreto aumento na liberação de CK após 60 min [UI/mL: de 80 ± 15 (basal) para 113 ± 22; n = 6; p > 0,05]. Em preparações NFD, o veneno (1, 10 e 30 ?g/mL) produziu marcante facilitação da neurotransmissão (~120% de aumento acima do basal) com a maior concentração seguida por bloqueio neuromuscular completo após 120 min; os efeitos com as menores concentrações foram considerados menos marcantes. O veneno aumentou o conteúdo quântico após 15 e 30 min de incubação seguido por significativa inibição ?90 min. No entanto, o veneno não alterou o potencial de membrana muscular ou a resposta despolarizante ao carbacol. Em ambas as preparações, incubação a 22-24 °C ao invés de 37 °C atrasou o início do bloqueio, como fez também a inibição da atividade PLA2 do veneno. Em preparações NFD curarizadas, o veneno produziu apenas uma discreta facilitação muscular. Estes resultados indicam que o veneno de B. b. smaragdina causa bloqueio neuromuscular in vitro por um mecanismo pré-sináptico envolvendo PLA2. Também foi investigada a atividade neuromuscular de Bbil-TX, uma PLA2 com atividade catalítica isolada do veneno de B. b. smaragdina, em preparações BC e NFD. Em preparações BC, Bbil-TX (35-702 nM) causou bloqueio tempo- e concentração-dependente que não foi reversível por lavagem; os tempos para causar 50% de bloqueio foram 87 ± 7, 41 ± 7 e 19 ± 2 min (média ± EPM; n = 4-6) para 70, 351 and 702 nM, respectivamente. Contraturas musculares à ACh exógena e KCl não foram alteradas. A toxina (702 nM) também não alterou as respostas contráteis de preparações BC curarizadas (d-Tc; 14,8 ?M) e diretamente estimuladas. No entanto, Bbil-TX (702 nM) produziu moderada alteração morfológica (fibras edemaciadas e/ou hipercrômicas) em BC; houve também uma progressiva liberação de CK [UI/mL: de 116 ± 17 (basal) para 961 ± 48 após 60 min; n = 6; p < 0,05]. O bloqueio neuromuscular induzido por Bbil-TX (351 nM) foi significativamente inibido a 22-24 °C e o pré-tratamento com p-BPB aboliu seu bloqueio. Bbil-TX (210 nM, 702 nM e 2 ?M; n = 4-6) causou bloqueio parcial tempo- e concentração-dependente em preparações NFD (52 ± 2% com a maior concentração). Bbil-TX (2 ?M) também reduziu significativamente a frequência de PsPTM/min [de 26 ± 2,5 (basal) para 10 ± 1 após 60 min; n = 5; p < 0,05] e o conteúdo quântico [de 94 ± 14 (basal) para 24 ± 3 após 60 min; n = 5; p < 0,05] de preparações NFD, mas causou apenas uma discreta alteração do potencial de membrana em repouso [de -80 ± 1 mV (basal) para -66 ± 2 mV após 120 min; n = 5; p < 0,05], com nenhuma alteração significativa na resposta despolarizante ao carbacol. Estes resultados mostram que Bbil-TX é uma PLA2 pré-sináptica que contribui para o bloqueio neuromuscular causado pelo veneno de B. b. smaragdina. A atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina e o mecanismo de ação de Bbil-TX no sistema nervoso periférico foi examinado também em outras preparações neuromusculares isoladas de camundongo. Em preparações NFD mantidas em solução fisiológica com baixo Ca2+, o veneno de B. b. smaragdina (3 ?g/mL) produziu uma alteração trifásica nas respostas contráteis enquanto que a maior concentração (10 ?g/mL) produziu uma abrupta e marcante contratura inicial a qual foi seguida por facilitação neuromuscular, oscilações rítmicas das contrações evocadas, alterações na linha de base e progressivo bloqueio neuromuscular. O veneno também atrasou a fase de relaxamento da resposta contrátil aumentando o tempo de decaimento constante. Em condições de baixo Ca2+, Bbil-TX (210 nM) causou um progressivo aumento na amplitude das respostas contráteis (83 ± 19 % acima dos valores basais após 120 min) em preparações NFD; não houve alteração no tempo de decaimento constante após tratamento com a toxina. O veneno de B. b. smaragdina (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram discreta alteração na amplitude do potencial de ação composto registrado em preparações NC de camundongo (veneno: 20 ± 2,1% e toxina: 17 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; n = 3; p < 0,05) e nenhum efeito significativo sobre o tempo de subida e a latência; Tetrodotoxina (3,1 nM) bloqueou os potenciais no final dos experimentos. Em preparações TSn-m, veneno (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram significativa redução na forma de onda perineural associada à corrente K+ (veneno: 35 ± 7,2% e toxina: 26 ± 1,4% de redução abaixo dos valores basais; p < 0,05; n = 3-5) enquanto que a amplitude da corrente de Na+ não foi significativamente afetada (veneno: 18 ± 3,3% e toxina: 15 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; p > 0,05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) causou aumento nos valores de conteúdo quântico de preparações TSn-m mantidas em baixo Ca2+ [de 9,6 ± 1,1 (t0) para 31,4 ± 7,7 (t60), p < 0,05; n = 4]. O veneno (3 ?g/mL) e toxina (210 nM) induziram aumento na fluorescência ao cálcio em células SK-N-SH marcadas com indicador sensível ao Ca2+ Fluo3 AM (4 ?M) e mantidas em solução fisiológica com normais condições de Ca2+ ou com baixo Ca2+. Em células mantidas em Ca2+ normal, o aumento na amplitude de fluorescência foi acompanhado por irregular e frequente movimento de Ca2+. Em preparações TSn-m marcadas com Fluo4 AM (4 ?M), o veneno de B. b. smaragdina causou imediato aumento na concentração de Ca2+ intracelular de fibras musculares seguido por frequente oscilação na fluorescência e contratura muscular; Bbil-TX não induziu nenhuma alteração na fluorescência ao cálcio em fibras musculares de preparações TSn-m. Secções de preparações NFD pré-tratadas com Bbil-TX (210 nM) destinadas à imunohistoquímica foram marcadas positivamente para receptores juncionais de ACh mas houve perda de marcação para as proteínas pré-sináptica sinaptofisina e SNAP25. Juntos, estes dados indicam que Bbil-TX tem alta seletividade de ação sobre a região pré-sináptica semelhantemente a outras neurotoxinas PLA2 modulando a atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina / Abstract: In this work, we examined the neuromuscular activity of Bothriopsis bilineata smaragdina (forest viper) venom and its toxin Bbil-TX (Asp49 phospholipase A2) in vertebrate isolated nerve-muscle preparations. In chick biventer cervicis preparations (BC) the venom caused concentration-dependent (0.1-30 ?g/ml) neuromuscular blockade that was not reversed by washing, with 50% blockade occurring in 15-90 min. Muscle contractures to exogenous acetylcholine and KCl were unaffected by the venom, but there was a slight increase in creatine kinase release after 60 min [IU/ml: from 80 ± 15 (basal) to 113 ± 22; n = 6; p > 0.05]. In mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (PND), the venom (1, 10 and 30 ?g/ml) produced marked facilitation (~120% increase above basal) at the highest concentration followed by neuromuscular blockade; the effects at lower concentrations were considerably less marked. The venom increased quantal content values after 15 and 30 min followed by significant inhibition at ?90 min. However, the venom did not alter the muscle membrane resting potential or the response to exogenous carbachol. In both preparations, incubation at 22 °C instead of 37 °C delayed the onset of blockade, as did inhibition of venom PLA2 activity. In curarized mouse preparations, the venom produced only muscle facilitation. These results indicate that B. b. smaragdina venom causes neuromuscular blockade in vitro by a presynaptic mechanism involving PLA2. It was also investigated the neuromuscular activity of Bbil-TX, a PLA2 with catalytic activity isolated from B. b. smaragdina venom, in BC and PND preparations. In BC preparations, Bbil-TX (35-702 nM) caused time- and concentration-dependent blockade that was not reversed by washing; the times for 50% blockade were 87 ± 7, 41 ± 7 and 19 ± 2 min (mean ± SEM; n = 4-6) for 70, 351 and 702 nM, respectively. Muscle contractures to exogenous ACh and KCl were unaffected. The toxin (702 nM) also did not affect the twitch-tension of directly stimulated, curarized (d-Tc, 14.8 ?M) BC preparations. However, Bbil-TX (702 nM) produced mild morphological alterations (edematous and/or hyperchromic fibers) in BC; there was also a progressive release of CK [IU/ml: from 116 ± 17 (basal) to 961 ± 48 after 60 min; n = 6; p < 0.05]. Bbil-TX (351 nM)-induced blockade was markedly inhibited at 22-24 °C and pretreatment with p-BPB abolished the neuromuscular blockade. Bbil-TX (210 nM, 702 nM and 2 ?M; n = 4-6) caused partial time- and concentration-dependent blockade in PND preparations (52 ± 2% at the highest concentration). Bbil-TX (2 ?M) markedly reduced the MEPPs frequency/min [from 26 ± 2.5 (basal) to 10 ± 1 after 60 min; n = 5; p < 0.05] and the quantal content [from 94 ± 14 (basal) to 24 ± 3 after 60 min; n = 5; p < 0.05] of PND preparations, but caused only minor depolarization of the membrane resting potential [from -80 ± 1 mV (basal) to -66 ± 2 mV after 120 min; n = 5; p < 0.05], with no significant change in the depolarizing response to exogenous carbachol. These results show that Bbil-TX is a presynaptic PLA2 that contributes to the neuromuscular blockade caused by B. b. smaragdina venom. The neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom and the mechanism of action of Bbil-TX on peripheral nervous system have been further examined in mouse nerve-muscle preparations in vitro. In PND preparations maintained in low Ca2+ physiological salt solution (PSS), B. b. smaragdina venom (3 ?g/ml) caused a triphasic change in twitch height while the xv highest concentration (10 ?g/ml) produced an abrupt and marked initial contracture which was followed by neuromuscular facilitation, rhythmic oscillation of nerve evoked twitch, alteration in base line and progressive blockade. The venom also slowed the relaxation phase of the muscle twitch increasing the constant decay time. Under low Ca2+ conditions, Bbil-TX caused a progressive increase in twitch amplitude (83 ± 19 % above basal values after 120 min) in PND preparations; there was no change in the constant decay time after treatment with toxin. B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused minor changes in the amplitude of the compound action potential (CAP) recorded from SN preparations (venom: 20 ± 2.1 % and toxin: 17 ± 2.4 % of reduction below basal values; n = 3; p < 0.05) and no significant effect on rise time and latency; tetrodotoxin (3.1 M) blocked the CAP at the end of the experiments. In TSn-m preparations, both venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused significant reduction in the perineural waveform associated with the outward K+ current (venom: 35 ± 7.2 % and toxin: 26 ± 1.4 % of reduction below basal values; p < 0.05; n = 3-5) while the amplitude of the inward Na+ current was not significantly affected (venom: 18 ± 3.3 % and toxin: 15 ± 2.4 % of reduction below basal values; p > 0.05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) caused progressive increase in quantal content in TSn-m preparations maintained in low Ca2+ PSS [from 9.6 ± 1.1 (t0) to 31.4 ± 7.7 (t60), p < 0.05; n = 4]. Venom (3 ?g/ml) and toxin (210 nM) induced increase in calcium fluorescence in neuroblastoma cell line SK-N-SH loaded with calcium sensitive indicator Fluo3 AM (4 ?M) and maintained in low Ca2+ or normal Ca2+ PSS. In those cells maintained in normal Ca2+ PSS, the increase in fluorescence amplitude was accompanied by irregular and frequent calcium transients. In TSn-m preparations loaded with Fluo4 AM (4 ?M), B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) caused immediate increase in Ca2+ intracellular of muscle fibres followed by frequent oscillation in fluorescence and muscle contracture; Bbil-TX did not induce any change in calcium fluorescence in TSn-m preparations. Immunohistochemical sections of PND preparations pretreated with Bbil-TX (210 nM) were labeled positively for junctional ACh receptors but there was loss of labeling for presynaptic proteins synaptophysin and SNAP25. Together, these data indicate that Bbil-TX has high selectivity of action under the presynaptic region similarly as other PLA2 neurotoxins modulating the neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

O envenenamento por aranhas Loxosceles pode resultar dois tipos de manifestações clínicas: o loxoscelismo cutâneo e o sistêmico. Hemólise, agregação plaquetária, inflamação persistente, falência renal e morte podem ser observados em pacientes com manifestações sistêmicas. Apesar da pouca incidência de vítimas com falência renal, esta é a principal causa de óbito, ocorrendo principalmente em crianças. O principal fator do veneno da aranha Loxosceles, responsável pelas manifestações locais e sistêmicas, é a esfingomielinase D. O presente estudo teve como objetivo investigar a ação tóxica do veneno de L. intermedia e das SMases D sobre células renais humanas, o possível envolvimento de metaloproteases endógenas e do sistema complemento neste processo. Os resultados obtidos mostram que tanto o veneno, como a SMase D, foram capazes de provocar morte celular, a qual foi relacionada a ativação de metaloproteases de matriz extracelular, MMP-2 e MMP-9 e, ainda, por ação lítica do complemento, após clivagem do MCP, por ação de metaloproteases da família das adamlisinas. A remoção de MCP permitiu ativação do Complemento, como determinado pelo aumento da deposição de C3 e C4 e da morte celular. Também foi observado um aumento na deposição do fator H e da properdina, mas não de C4bp após a tratamento das células com veneno/ SMase D. Diminuição na expressão das moléculas de superfície MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulina, EPCR e EGFR foi observada e está relacionada com a ativação de metaloproteases da família das adamlisinas. A expressão de outros reguladores do complemento, como DAF e CD59, não foi afetada pelo tratamento. Em conjunto, tais resultados mostram que o veneno e a SMase D induzem aumento na expressão/ativação de metaloproteases endógenas, operantes nos eventos de morte celular por apoptose e necrose, os quais podem ter um papel relevante para os danos renais presentes no loxoscelismo sistêmico humano. / Envenomation by Loxosceles spider can result two forms of clinical manifestations: cutaneous and systemic loxoscelism. Haemolysis, platelet aggregation, inflammation persistent, renal failure and death can be observed in patients with systemic manifestations. Despite the low incidence of renal failure victims, this is the main cause of death, occurring mainly in children. The sphingomyelinase D is the main factor in Loxosceles spider venom responsible for local and systemic manifestations This study aimed to investigate the toxicity of the L. intermedia venom and SMase D on human kidney cells and the possible involvement of endogenous metalloproteinases and complement this process. Results showed that venom and SMase D were able to cause cell death, which was related to activation of extracellular matrix metalloproteases, MMP-2 and MMP-9 and also by lytic action of complement, after MCP cleavage by the action of the family of metalloproteases adamlisins. The removal of MCP, by action of the venom/ SMase D, allowes activation of complement, as determined by increases deposition of C3 and C4 and cell death. There was also an increases in deposition of properdin and factor H, but not C4bp, after treatment of cells with venom/ SMase D. decreased expression of surface molecules MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulin, EPCR and EGFR was observed after incubation of the renal cells with venom or SMase D and is related to activation of metalloproteinases family adamlisins. The expression of others complement regulators such as DAF and CD59 was not affected by treatment. Together, theses results show that the venom and SMase D induce increased expression/ activation of endogenous metalloproteases, operating in the event of cell death by apoptosis and necrosis, which may have an important role for the kidney injury loxoscelism in the human system.

Dos peixes peçonhentos encontrados no Brasil os bagres destacam-se pelo número de acidentes provocados. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os componentes tóxicos presentes na peçonha e no muco. Obtivemos uma média protéica de 3,1 mg/mL (peçonha) e 1,4 mg/mL (muco). O perfil eletroforético da peçonha e do muco possui poucas bandas protéicas. O fracionamento isolou 11 frações para peçonha e 13 frações para o muco. Com relação às atividades biológicas avaliadas, as frações peptídicas induziram danos teciduais ao passo que as frações protéicas induziram processo inflamatório. Isolamos duas frações com atividade antimicrobiana para cada secreção. Isolamos uma toxina de 65,1 kDa que apresenta homologia com Wap65 e análise por microscopia intravital revelou que esta proteína causa aumento dos leucócitos rolantes assim como a presença de leucócitos aderidos ao endotélio. Nossos resultados indicam uma diferença entre os componentes protéicos e peptídicos do muco e da peçonha. Finalmente, conseguimos isolar e caracterizar a proteína Wap65 da peçonha deste peixe. / Of the venomous fish found in Brazil, catfish noteworthy for the number of accidents they cause. The objective of this study was to characterize the toxic compounds present in the venom and mucus. We obtained an average protein intake of 3,1 mg / mL (venom) and 1,4 mg / mL (mucus). The electrophoretic profile of venom and mucus has a few protein bands. Fractionation isolated 11 fractions to the venom and 13 fractions to the mucus. With respect to biological activities evaluated, the peptide fractions induced tissue damage while the protein fractions induced inflammation. We isolated two fractions with antimicrobial activity for each sample. We isolated a toxin of 65,1 kDa which shows homology with Wap65 and intravital microscopy analysis revealed that this protein causes an increase in leukocyte rolling as well as the presence of leukocytes adhered to the endothelium. Our results indicate a difference between the peptide and protein components of mucus and venom. Finally, we isolate and characterize the protein Wap65 from the venom of this fish.

Orientador: Ana Carolina Gomes Jardim / Resumo: Nas últimas décadas, diversos vírus que tinham sua ocorrência limitada a pequenas regiões se espalharam pelo globo, causando epidemias e preocupação entre as autoridades de saúde. Apesar dos inúmeros avanços no tratamento das infecções virais, vários destes vírus ainda não possuem tratamento especifico e eficaz. Adicionalmente, a alta taxa de resistência e o surgimento de novas mutações, torna a busca por novos antivirais desafiadora e de extrema importância. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade antiviral de compostos de origem natural ou sintética contra os vírus da Chikungunya (CHIKV) e Enterovirus A71 (EV-A71). Contra o CHIKV, 48.750 compostos sintéticos foram inicialmente avaliados in silico por docking molecular, dos quais 12 compostos demonstraram apresentar interação com a região de ligação a ADP-ribose do dominío macro da proteína viral não estrutural 3 (nsP3), e foram selecionados para ensaios in vitro. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para determinar a máxima concentração não tóxica de cada composto, que foi utilizada nos ensaios anti-CHIKV em células de hepatocarcimona humano Huh-7, transfectadas com os replicons subgenômicos do CHIKV. Os resultados demonstraram que os compostos C5 e C13 na concentração de 20 µM inibiram 53 e 76% da replicação do CHIKV em células Huh-7, respectivamente. Contra o EV-A71, 6 proteínas isoladas da peçonha de serpentes foram testadas em concentrações não tóxicas em células Vero infect... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last decades, several viruses that had their occurrence limited to small regions spread through the globe, causing epidemics and concern among health authorities. Despite the numerous advances in the treatment of viral infections, several of these viruses have no specific and effective treatment yet. In addition, the high rate of resistance and the emergence of new mutations, makes the search for new antivirals challenging and extremely important. The present work aimed to investigate the antiviral activity of compounds from natural or synthetic origin against Chikungunya virus (CHIKV) and Enterovirus A71 (EV-A71). Against CHIKV, 48,750 synthetic compounds were initially evaluated in silico by molecular docking, of which 12 compounds demonstrated to be interacting with the ADP-ribose binding region of viral non- structural protein 3 (nsP3) macro domain and were selected for in vitro assays. Cell viability assays were performed to determine the maximum non-toxic concentration of each compound and used in anti-CHIKV assays in human hepatocarcinoma cells (Huh-7) transiently transfected with the CHIKV subgenomics replicons. The results demonstrated that the C5 and C13 compounds at 20 µM inhibited 53 and 76% of CHIKV replication in Huh-7 cells, respectively. Against EV-A71, 6 proteins isolated from snake venom were tested at non-toxic concentrations in infected Vero cells, and the virucidal, protective and anti-EV-A71 replication activity was evaluated. From the tested toxi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Em 1987 o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde iniciou o uso do Veneno Botrópico de Referência Nacional (VBRN), que é a primeira extração das serpentes B. jararaca recém-chegadas da natureza. Em 10 anos notou-se uma queda de 67,65% na recepção de serpentes ao Instituto Butantan (IB), e na distribuição geográfica, resultando em uma maior heterogeneidade na composição do VBRN. Assim, comparamos os venenos das serpentes nascidas em cativeiro (VP) do Laboratório de Herpetologia do IB com o VBRN, para verificar a possibilidade de incorporar o VP na preparação dos lotes do VBRN. O VP mostrou-se estatisticamente semelhante ao VBRN nos testes de dosagem de proteínas, SDS-PAGE, 2DE, cromatografia, atividade fosfolipásica, ELISA, Western blotting, dose mínima coagulante (plasma) e hemorrágica, enquanto para as atividades de L-aminoácido oxidase, caseinolítica, zimografia e dose mínima coagulante (fibrinogênio) o VP mostrou-se diferente do VBRN. Para as doses letais e efetiva dos venenos o pool do VP com VBRN foi mais eficaz do que os VP e o VBRN sozinhos. / In 1987, The National Institute of Quality Control in Health in Brazil (INCQS) established the Brazilian Reference Bothrops Venoms (BRBV), which should be composed of the first extractions of newcomers wild snakes. In 10 years there has been a decrease of 67.65% in the reception snakes to Butantan Institute (IB), and geographic distribution, resulting in a higher heterogeneity in BRBV composition. So, we compared the venom samples of snakes born in captivity (SVP) of IB Herpetology Laboratory with BRBV to check the possibility of incorporating the SVP in the preparation of batches of BRBV. SVP was statistically similar to BRBV the proteins dosage, SDS-PAGE, 2DE, chromatography, phospholipase, ELISA, Western blotting, minimum coagulant dose (plasma) and hemorrhage dose, while for L-amino acid oxidase activity, caseinolytic, zymography and minimum coagulant dose (fibrinogen) SVP was shown to be different from BRBV. For effective and lethal doses of pool with SVP and BRBV it was more effective than SVP and BRBV alone.

O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay

Escorpiões da família Buthidae estão envolvidos na maioria dos envenenamentos em todo o mundo. Tityus é um dos gêneros dessa família, sendo Tityus serrulatus a espécie mais perigosa, por estar envolvida em envenenamentos graves, nos quais as vítimas são crianças, podendo levar a óbito. As manifestações da picada incluem dor local, hipersensibilidade, hipertensão, manifestações cardiovasculares e edema pulmonar. A peçonha do T. serrulatus contem, entre outros componentes, várias toxinas que atuam em canais de K+, Na+ e Ca2+ e que são responsáveis pelos efeitos tóxicos do veneno. Estudos recentes mostraram que a peçonha de T. serrulatus pode ativar macrófagos que são críticos na resposta imune e desempenham papel fundamental na resposta humoral e celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos diretos dessas peçonhas sobre linfócitos humanos. Considerando que a modulação de funções celulares como proliferação, ativação e produção de citocinas pode desempenhar papel importante em envenenamentos, o presente estudo propôs: a) avaliar o efeito citotóxico do veneno bruto de Tityus serrulatus (VTs) sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); b) analisar o efeito do VTs sobre a modulação da expressão de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 e CD19) e de marcadores de ativação celular, incluindo CD69, CD25 e HLA-DR em células T e B; c) avaliar o efeito do VTs sobre a proliferação de linfócitos T; d) avaliar a capacidade do VTs em modular a produção de citocinas pelas PBMC. Ensaios de citotoxicidade foram realizados pela técnica do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) e mostraram que as concentrações de 500, 1000 e 2000 ?g/mL do VTs apresentaram citotoxicidade baixa a moderada para PBMC (12,7, 22,2 e 23,7% de redução na viabilidade celular, respectivamente). Concentrações de 25, 50 e 100 ?g/mL não foram citotóxicas. Com base nesses ensaios, estas ultimas concentrações foram utilizadas nos ensaios subsequentes. A citometria de fluxo foi empregada para avaliação da proliferação celular, da expressão de marcadores fenotípicos e de ativação celular, bem como para a quantificação de citocinas nos sobrenadantes de culturas celulares. As concentrações utilizadas não induziram alterações significativas nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, CD8+ e B, após 24h de cultivo. O ensaio de proliferação celular, utilizando marcação concomitante com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) e anticorpos monoclonais contra marcadores fenotípicos e marcadores de ativação celular, permitiu que se avaliasse não só a proliferação, mas a discriminação das diferentes subpopulações celulares e o estado de ativação das mesmas após 96h de cultivo. Os resultados sugerem que o VTs inibe a proliferação de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina (PHA), e em especial a porcentagem de linfócitos T CD8+CD25+ (linfócitos T citotóxicos ativados). O VTs não foi capaz de induzir proliferação celular. Em contraste, o VTs quando adicionado isoladamente à cultura de PBMC, nas concentrações de 50 e 100 ?g/mL, induziu a produção de IL-6 (p<0,05 e p<0,01, respectivamente), uma citocina pró-inflamatória que desempenha papeis importantes nas respostas imunes ii inata e adaptativa. A secreção aumentada de IL-6, portanto, não está vinculada a aumento na proliferação celular. A presença do VTs concomitantemente à PHA apresentou tendência para inibição da produção de citocinas por células estimuladas com a PHA, como IL-10, TNF e IFN-gama. Os resultados sugerem que o VTs é uma fonte potencial de substâncias com ações imunomoduladoras sobre linfócitos T humanos e estimulam novas investigações para o esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos, incluindo estudos que considerem a participação dos canais iônicos de linfócitos T nos fenômenos observados. Essas investigações, juntamente com a identificação dos componentes da peçonha, responsável pela atividades observadas, poderão contribuir para a descoberta de ferramentas para estudo dos mecanismos fisiopatológicos do envenenamento, bem como para a descoberta de novas alternativas de tratamento para doenças mediadas pelo sistema imune. / Scorpions of the Buthidae family are involved in most envenomations worldwide. Tityus is one of the genera of this family, being Tityus serrulatus the most dangerous species, because it is involved in severe envenomation, in which the victims are children and it can lead to death. The manifestations of scorpion sting are classified from mild to severe and its clinical signs include local pain, hypersensitivity, hypertension, cardiovascular manifestations and pulmonary edema. T. serrulatus venom contains, among other components, various toxins that act on K+, Na+ and Ca2+ channels, and are responsible for the toxic effects of the venom Recent studies showed that the venom of T. serrulatus (VTs) can activate macrophages that are critical to immune response and play a key role in the humoral and cellular response. However, little is known about the direct effects of these venoms on human lymphocytes. Considering that the modulation of cellular functions such as proliferation and induction of citokines production may play an important role in envenomation, the study proposed: a) to evaluate the cytotoxic effects of crude venom on peripheral blood mononuclear cells, b) to examine the effect of VTs on the modulation of expression of phenotypic markers (CD3, CD4, CD8 and CD19) and markers of cellular activation, including CD69, CD25 and HLA-DR on T and B cells c) to evaluate the VTs effect on the proliferation of T lymphocytes d) to evaluate the ability of VTs to modulate cytokine production by PBMC. Cytotoxicity assays were performed by the technique of MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) and showed that VTs concentrations of 500, 1000 and 2000 ?g/mL showed low to moderate cytotoxicity to PBMC (12.7, 22.2 and 23.7% reduction in cell viability, respectively). Concentrations of 25, 50 e 100 ?g/mL were not cytotoxic. Based on these tests, these concentrations were used in subsequent trials. Flow cytometry was used to assess cell proliferation, expression of phenotypic markers and cell activation, as well as for the quantification of cytokines in supernatants of cell cultures. The concentrations used did not induce significant changes in subpopulations of lymphocytes and did not modify the expression of activation markers on CD4+, CD8+ and B cells, after 24 hours of culture. The cellular proliferation assay, using simultaneously diacetate carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and monoclonal antibodies against phenotypic markers and cell activation markers, allowed the evaluation not only of proliferation, but the discrimination of different cell subpopulations and activation state of the same after 96h of culture. The results suggest that VTs inhibits the proliferation of lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA), and in particular the percentage of T lymphocytes CD8+ CD25+ (activated cytotoxic T lymphocytes). The VTs were not able to induce cell proliferation. In contrast, the VTs when added alone to the culture of PBMC at concentrations of 50 and 100 ?g/mL induced production of IL-6 (p <0.05 and p <0.01, respectively), a proinflammatory cytokine that plays important roles in innate and adaptive immune responses. The increased secretion of IL-6, therefore, is not linked to increased cell proliferation. The presence of VTs concurrently with PHA tended to inhibit cytokine production by cells stimulated with PHA, as IL-10, TNF and iv IFN-gamma.The results suggest that the VTs is a potential source of substances with immunomodulatory actions on human T lymphocytes and stimulate further research to elucidate the mechanisms of action involved, including studies to consider the participation of ion channels of T lymphocytes in the phenomena observed. These investigations, along with the identification of the components of the venom responsible for the observed activities may contribute to the discovery of tools to study the pathophysiological mechanisms involved in the envenomation as well as for the discovery of new treatment alternatives for diseases mediated by the immune system.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.