A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O vírus da cinomose canina (CDV) é classificado no gênero Morbillivirus da família Paramyxoviridae e é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças virais de canídeos domésticos. A cinomose ocorre em todo o mundo e produz alta mortalidade em populações imunologicamente naïve. Apesar de encontrar-se bem controlada pela vacinação, casos de cinomose ocorrem esporadicamente tanto em cães vacinados quanto em não vacinados. Uma das causas suspeitas desta falha vacinal é a grande variabilidade genética entre cepas de CDV. O objetivo deste trabalho foi detectar e analisar a variabilidade genética do CDV circulante no País. Foram coletados 386 suabes retais de cães em diversas regiões do Brasil, dos quais se detectaram 155 positivos através de uma RT-nested-PCR de um fragmento do gene do nucleocapsídeo. Destes, 23 foram selecionados para amplificação parcial do gene da hemaglutinina, sequenciamento e análise filogenética. A grande maioria das sequências obtidas agrupou no genótipo América do Sul-I, que inclui isolados da Argentina e do Uruguai, com exceção de uma amostra similar à cepa vacinal Rockborn. A análise filogenética sugere a presença de pelo menos sete subgenótipos do genótipo América do Sul-I circulando neste continente. O grupo América do Sul-II é formado somente por isolados da Argentina. Além disso, propõe-se que este grupo e os clados Rockborn-like e Europa Selvagem sejam denominados subgenótipos dentro de um genótipo único. / Canine distemper virus (CDV) is classified in the genus Morbillivirus within the family Paramyxoviridae and is the etiologic agent of one of the most important viral diseases of domestic Canidea. It occurs worldwide and produces high mortality in immunologically naïve populations. Despite being well controlled by vaccination, cases of canine distemper occur sporadically in vaccinated and unvaccinated dogs. One of the suspected causes of this vaccine failure is the great genetic variability between strains of CDV. The objective of this study was to detect and analyze the genetic variability of CDV circulating in our country. Rectal swabs were collected from 386 dogs in various regions of Brazil, of which 155 were found positive by a nested RT-PCR of a fragment of the nucleocapsid gene. Of these, 23 were selected for partial amplification of the hemagglutinin gene, sequencing and phylogenetic analysis. The vast majority of sequences obtained grouped in genotype South America-I, which includes isolates from Argentina and Uruguay, with the exception of a sample similar to the vaccine strain Rockborn. Phylogenetic analysis suggests the presence of at least seven subgenotypes belonging to South America-I genotype, circulating in this continent. The group South America-II consists only of isolates from Argentina. Furthermore, it is proposed that this group and clades Rockborn-like and Europe Wildlife are denominated subgenotypes within a single genotype.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

A bovinocultura é um dos destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial, uma vez que o País tem o maior rebanho bovino comercial do mundo e é o maior exportador de carne bovina. Para manter e melhorar a competitividade no mercado internacional é fundamental o monitoramento da sanidade animal e a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes, especialmente em relação às doenças virais que causam grande impacto na produtividade. As infecções em bovinos causadas por pestivírus resultam em grandes perdas econômicas em todo mundo. Estas podem variar de subclínicas até fatais e pode envolver sinais clínicos respiratórios, reprodutivos e digestivos. As espécies virais pertencentes à família Flaviviridae, gênero Pestivirus, que causam estas infecções são: vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), BVDV tipo 2 (BVDV-2) e vírus da doença da fronteira (BDV), além de um pestivírus atípico, o vírus Hobi-like. O objetivo deste trabalho foi caracterizar filogeneticamente isolados de pestivírus detectados no Brasil entre 1995 e 2014. Para isso, 89 isolados de pestivírus foram amplificadas por RT-PCR, sequenciadas e analisadas filogeneticamente em três regiões genômicas, região 5’ não traduzida (5’UTR), autoprotease N terminal (Npro) e glicoproteína 2 (E2). Estes isolados eram provenientes de amostras biológicas de bovinos, soro fetal bovino e de cultivos celulares contaminados, de seis estados brasileiros (PB, PR, MS, MT, RS, SC). No total, 53,9% das sequências foram identificadas como BVDV-1, 33,7% como BVDV-2 e 12,3% como vírus Hobi-like. Os subgenótipos predominantes foram BVDV-1a (35,9%) e BVDV-2b (31,4%), porém, BVDV-1b (10,1%), 1d (6,7%), 2c (2,2%) e 1e (1,1%) também foram identificados. O BVDV-1e e 2c foram descritos pela primeira vez no Brasil. Estes resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de vacinas e testes de diagnósticos mais eficazes, visando futuros programas de controle e erradicação destes vírus no País. / The livestock is one of the highlights of Brazilian agribusiness in the world scenario. Since Brazil has the world’s largest commercial cattle population and is the largest beef exporter. To maintain and improve the competitiveness in the international market, is essential to monitor the animal health and the application of appropriate and efficient disease control programs, especially in relation to viral diseases, which cause major impact on productivity. Infection caused by pestiviruses in cattle results in great economic losses worldwide. It can vary from subclinical to fatal, and may involve respiratory, reproductive and digestive clinical signs. The viral species belongs to the family Flaviviridae, genus Pestivirus, that are the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV type 2 (BVDV-2) and border disease virus (BDV), and one atypical pestivirus, the Hobi-like virus. The aim of this study was to phylogenetically characterize pestiviruses detected in Brazil between 1995 and 2014. For this, 89 pestivirus isolates were amplified by RT-PCR, sequencing and phylogenetically analyzed in three genomic regions, 5’ untranslated region (5’UTR), N terminal autoprotease (Npro) and envelope glycoprotein 2 (E2). These isolates were from biological samples of cattle, fetal bovine serum and contaminated cell cultures from six Brazilian Federal States (PB, PR, MS, MT, RS, SC). In total, 53.9% sequences were identified as BVDV-1, 33.7% as BVDV-2 and 12.3% as Hobi-like viruses. The predominant subgenotypes were BVDV-1a (35.9%) and BVDV-2b (31.4%). Furthermore, BVDV-1b (10.1%), 1d (6.7%), 2c (2.2%) and 1e (1.1%) were also identified. The BVDV-1e and 2c were described for the first time in Brazil. These results will contribute for the development of more efficient vaccines and diagnostic tests, aiming future pestivirus control and eradication programs in Brazil.

Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) e o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), são causas importantes de prejuízos sanitários e econômicos na bovinocultura. Estes agentes têm sido eventualmente detectados em búfalos (Bubalus bubalis) embora o papel desses vírus na biologia dessa espécie seja ainda desconhecido. A produção de búfalos vem se desenvolvendo expressivamente no Brasil, onde esses animais são mantidos frequentemente próximos ou associados à criação de bovinos. Como parte inicial de um projeto mais amplo sobre infecções por BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e BVDV em búfalos, o presente estudo objetivou analisar a presença de anticorpos neutralizantes e genomas virais em amostras de soros bubalinos coletados em rebanhos do Estado do Rio Grande do Sul. Foram examinados 339 soros de animais maiores de 12 meses, de ambos os sexos, de diferentes raças e tipo de exploração. Os animais não eram vacinados para quaisquer vírus de interesse na pesquisa e se apresentavam sem alterações clinicamente aparentes na ocasião da coleta. Para a detecção de anticorpos neutralizantes, as amostras de soro foram examinadas através do teste de soroneutralização (SN) frente a diferentes amostras de herpesvírus: BoHV-1.1 (amostra LA) , BoHV-5b (amostra A663) e BuHV-1 (amostra b6). Cento e oito destas amostras foram examinadas adicionalmente frente ao BoHV-1.1 (amostra EVI123/98) e BoHV-1.2a (amostra SV265/96), para permitir uma avaliação da sensibilidade da SN utilizando como vírus de desafio todas as variantes disponíveis de BoHV-1 e BoHV-5. A sensibilidade da SN foi menor quando considerados os resultados obtidos com cada um dos vírus separadamente. Quando os resultados positivos frente a amostra LA, SV265/96 e A663 foram somados, a prova se apresentou mais sensível. Apesar disso, a SN não permitiu a identificação dos vírus que efetivamente haviam infectado os animais, devido ao elevado grau de reatividade cruzada. Para a verificação da circulação de pestivírus, foram realizados testes de SN utilizando a amostra “Oregon C24V” de BVDV-1 como vírus de desafio. Das 176 amostras analisadas, 19 (10,8 %) apresentaram anticorpos neutralizantes reagentes com o vírus utilizado. Paralelamente, para a detecção de genomas de pestivírus, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) capaz de detectar os três tipos conhecidos de BVDV (1, 2 e 3) e otimizada para o exame das amostras de soros bubalinos. Cinco amostras (2,8 %) continham genomas virais, sugerindo a ocorrência de prováveis infecções persistentes nos animais, semelhante ao que ocorre em bovinos. Os resultados obtidos evidenciam a circulação de herpesvírus e pestivírus nas populações bubalinas analisadas. Mais estudos são necessários para definir quais os agentes efetivamente causadores de infecções nesta espécie animal. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 5 (BoHV-5) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) are major causes of sanitary and economic losses in cattle. These agents have been eventually detected in water buffaloes (Bubalus bubalis), although their role in host species biology is unknown. Buffalo production has had significant increase in Brazil, where these animals are often kept close to or in association with cattle. As part of a wider project on infections with BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 and BVDV in buffaloes, the present study aimed to examine the occurrence of neutralizing antibodies in buffaloes serum samples collected in farms from Rio Grande do Sul State. Three hundred and thirty nine serum samples were collected from animals with ages above 12 months, of both genders, of different races and under different management practices. The animals were not vaccinated for any virus studied in the present study and were all clinically healthy at the time of sample collection. For neutralizing antibodies detection, serum samples were tested in serum neutralization (SN) tests against different herpesviruses: BoHV-1.1 (strain LA), BoHV-5b (strain A663) e BuHV-1 (strain b6). One hundred and eight of theses samples were additionally examined with BoHV-1.1 (strain EVI123/98) and BoHV-1.2 (strain SV265/96), to compare SN sensitivity using all available variants of BoHV-1 and BoHV-5 as challenge viruses. The SN sensitivity was lower when results obtained with each virus were considered separately. Sensitivity was maximum when the positive results against strain LA, SV265/96 and A663 were added. Despite this, the SN did not allow the identification of the virus which had actually infected animals, in view of the high degree of antibody cross-reactivity. In order to assess the circulation of pestiviruses, SN tests were carried out using the sample "Oregon C24V" of BVDV-1 as challenge virus. Out of the 176 analyzed samples, 19 (10.8 %) presented neutralizing antibodies to pestivirus. At the same time, for the detection of genomes of pestiviruses, was developed a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) able to detect the three known types of BVDV (1, 2 and 3) and optimized for examining bubaline sera. Five samples (2.8 %) contained viral genomes, suggesting the occurrence of persistent infections in animals, analogous to what occurs in cattle. The results obtained confirm circulation of herpesvírus and pestiviruses in examined buffalo populations. Further studies are needed to define which of these viruses effectively infect this animal species.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.

Algumas espécies de morcegos têm sido reconhecidas como reservatórios naturais de várias famílias virais, desempenhando um importante papel na trasmissão e manutenção desses micro organismos. Devido à descaracterização e fragmentação de habitats naturais, esses mamíferos buscam alternativas de abrigo e alimento, e assim, ficam cada vez mais expostos aos meios antrópicos e em contato com humanos e animais domésticos. Com exceção do vírus rábico, existem poucos trabalhos realizados na detecção de vírus em morcegos no Brasil. Em virtude disso, o presente estudo objetivou a detecção de vírus (circovírus, astrovírus, coronavírus e lyssavírus relacionados ao vírus da raiva) em amostras de órgãos de morcegos do estado do Rio Grande do Sul. Os ácidos nucléicos foram extraídos das amostras de órgãos de morcegos e submetidos à detecão por PCR e RT-PCR. Após a detecção, os fragmentos obtidos foram sequenciados para realizar análise filogenética dos vírus encontrados. Ao total foram analisadas 108 amostras de diferentes espécies e localidades, das quais dez foram positivas para circovírus, seis para coronavírus e 25 para astrovírus, este último sendo o primeiro registro do vírus em morcegos para o Brasil. Todas as amostras foram negativas para lyssavírus relacionados ao vírus da raiva. Análises filogenéticas revelaram que as sequências de circovírus agruparam em ambos os gêneros Circovirus e Cyclovirus, coronavírus no gênero Alphacoronavirus em dois clados diferentes e astrovírus no gênero Mamastrovirus junto com outros astrovírus de morcegos, o qual formam um clado separado dos outros mamíferos. Os resultados demonstram uma diversidade genética entre os vírus encontrados em diferentes espécies de morcegos, que possuem dietas alimentares e habitats distintos. / Some bat species have been recognized as natural reservoirs of several viral families, playing an important role in the transmission and maintaining of these micoorganism. Due to mischaracterization and fragmentation of natural habitats, these mammals seek shelter alternatives and food, and thus are increasingly exposed to anthropism, which make the contact with humans and domestic animals closer. With the exception of the rabies virus, there are few studies on the detection of viruses in bats in Brazil. Therefore, the present study aimed the detection of viruses (circovirus, astrovirus, coronavirus and rabies-related virus) in bats organs samples from Rio Grande do Sul state. Nucleic acids were extracted from bat organs samples and submitted to detection by PCR and RT-PCR. After detection, the obtained fragments were sequenced to perform phylogenetic analysis of the viruses found. From a total of 108 samples analyzed of different species and locations, ten were positive for circoviruses, six for coronaviruse and 25 for astrovirus, which was the first report of this virus in bats in Brazil. All samples were negative for rabies-related virus. Phylogenetic analyzes revealed that the sequences of circoviruses grouped in both Circovirus and Cyclovirus genus, coronaviruses in Alphacoronavirus genus in two different clades and astroviruses in Mamastrovirus genus along with other bats astrovirus, which form a separate clade from other mammals. Results demonstrate a genetic diversity among viruses found in different species of bats, which have different diets and habitats.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.

Os vírus influenza A (VIA) e circovírus suíno tipo 2 (PCV2) são os agentes etiológicos da influenza suína (IS) e da circovirose suína (CS), respectivamente. Estas doenças têm um impacto econômico significativo na suinocultura mundial. Adicionalmente, o VIA pode ser transmitido entre animais e humanos, sendo por isso, importante para a saúde pública. O presente trabalho teve o objetivo de pesquisar a ocorrência desses vírus em suínos de abate no sul de Moçambique. As amostras foram coletadas em um abatedouro na cidade da Matola, nos períodos de dezembro de 2014 a fevereiro de 2015 e dezembro de 2015 a fevereiro de 2016. Os materiais e métodos aplicados e resultados obtidos estão apresentados em dois artigos científicos. O primeiro relata a infecção pelo VIA associada à caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares. Foram avaliados 457 pulmões de suínos, e amostras de 38 (8.3%) pulmões, que apresentaram áreas de consolidação, foram coletadas e submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae. Antígenos do VIA foram detectados em 32/38 (84.3%) dos pulmões com pneumonia através da IHQ, e os suínos positivos eram provenientes dos distritos de Matutuine (5/32), Moamba (2/32), Namaacha (21/32), Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todos os pulmões com pneumonia foram negativos no exame de IHQ para PCV2 e M. hyopneumoniae. O segundo artigo teve o objetivo de detectar lesões histológicas, antígenos e DNA de PCV2 em linfonodos mesentéricos de suínos e realizar a caracterização filogenética de isolados de PCV2 circulantes no sul de Moçambique. Foram coletados aleatoriamente 111 linfonodos mesentéricos de suínos de abate provenientes de nove distritos do sul de Moçambique. As amostras foram submetidas ao exame histopatológico, IHQ e reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma amostra positiva para PCV2 na PCR de cada distrito (n=9) foi selecionada aleatoriamente e submetida ao sequenciamento da região aberta de leitura ORF2. DNA de PCV2 foi detectado em 53.8% (62/111) das amostras e em 73.8% de granjas dos nove distritos. No exame de IHQ, linfonodos mesentéricos de seis suínos positivos para PCV2 na PCR apresentaram antígenos desse vírus associados à depleção linfoide e infiltrado de histiócitos e células gigantes multinucleadas. Na análise filogenética, sequências dos isolados dos distritos de Namaacha, Moamba e Maputo ficaram agrupadas no genótipo PCV2d-2; as sequências de isolados dos distritos de Manhiça e Matola, no genótipo PCV2d-1; enquanto os isolados dos distritos de Boane, Matutuine, Chibuto e Xai-Xai, no genótipo PCV2b-1A/B. Os resultados do trabalho permitem concluir que o VIA e PCV2 circulam na população suína em vários distritos da região sul de Moçambique. / Influenza A virus (IAV) and porcine circovirus type 2 (PCV2) are the etiological agents of swine influenza (SI) and porcine circovirus associated diseases (PCVAD) respectively. These diseases represent a significant economic impact on pig production worldwide. In addition, IAV can be transmitted between animals and humans with consequences for public health. The objective of this study was to investigate the occurrence of these viruses in slaughter pigs in Southern Mozambique. Samples were collected in a slaughterhouse in Matola city, from December 2014 to February 2015 and December 2015 to February 2016. The materials and methods applied and the results obtained are presented in two manuscripts. The first article reports IAV infection in pigs and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of the associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were evaluated grossly, and samples from 38 (8.3%) of these that presented pulmonary consolidation were collected and examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. IAV antigens were detected in 32/38 (84.3%) of pneumonic lungs, and positive pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola City (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and M. hyopneumoniae. The second article aimed to detect histological lesions, PCV2 antigens and DNA and perform phylogenetic analysis of PCV2 strains circulating in Southern Mozambique. At slaughter, mesenteric lymph nodes were collected from 111 randomly selected pigs from nine districts of Southern Mozambique. Samples were submitted to histopathological examination, IHC and polymerase chain reaction (PCR). One PCV2 PCR positive sample from each district (n=9) was randomly selected in order to obtain sequences covering the ORF2 region. PCV2 DNA was detected in 53.8% (62/111) of the samples and 73.8% of the farms from all nine districts. PCV2 antigen was detected by IHC in six lymph nodes that were positive for PCV2 by PCR and antigens were associated with lymphoid depletion and infiltrate of histiocytes and multinucleated giant cells. Phylogenetic analysis demonstrated that three sequences from Maputo, Namaacha and Moamba were grouped with PCV2d-2, two sequences from Manhiça and Matola were grouped as PCV2d-1, and four sequences from Boane, Matutuine, Chibuto, and Xai-Xai were closely related to PCV2b-1A/B genotypes. The results of this study indicate that IAV and PCV2 circulate in the swine population in several districts of the southern region of Mozambique.

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.