Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-05T13:23:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1488786 bytes, checksum: fa0e1838ff1c48229a354080995a98d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-05T13:23:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1488786 bytes, checksum: fa0e1838ff1c48229a354080995a98d4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os vírus que infectam bactérias são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças em plantas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos i) caracterizar um bacteriófago isolado de Ralstonia solanacearum proveniente do estado do Ceará, Brasil ii) caracterizar proteínas H-NS de Ralstonia solanacearum e estudar seu o efeito regulatório no sistema CRISPR-Cas. A partir de um isolado não patogênico de Ralstonia solanacearum, foi isolado um vírus filamentoso que possui um ciclo de multiplicação do tipo pseudo-lisogênico. O genoma viral foi completamente sequenciado, possui 6945 nucleotídeos e conteúdo de GC de 61,25%. A organização genômica é típica de vírus da família Inoviridae, gênero Inovirus. Comparação da sequência obtida com sequências de outros Inovirus sugere que o isolado viral é uma nova espécie do grupo φRSM, tentativamente denominada Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). Partículas de RSIBR1 foram transmitidas para R. pseudosolanacearum, que quando infectadas pelo RSIBR1 também perdeu a capacidade de causar doença em plantas de tomate, sugerindo que a infecção viral interfere com a patogenicidade de Ralstonia spp. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o sistema CRISPR-Cas de Ralstonia solanacearum é inativo. Para avaliar se essa inatividade pode ser explicada pela presença de proteínas do tipo H-NS,foi realizada uma busca por genes que codificam H-NS no genoma de Ralstonia solanacearum. Três cópias de H-NS (H-NS 1, 2 e 3) foram localizadas no megaplasmídeo. Não foram identificadas cópias de H-NS codificadas no cromossomo bacteriano. As H-NS de Ralstonia solanacearum possuem os domínios de oligomerização e de ligação a DNA bem conservados. A análise filogenética de proteínas H-NS de diferentes bactérias agruparam de acordo com as famílias Enterobacteriaceae,Pseudomonadaceae e Ralstoniaceae. Além disso, foi observado que as proteínas H-NS da família Ralstoniaceae são altamente conservadas com H-NS codificadas por podovírus, sugerindo que as H-NS de Ralstoniaceae podem ser de origem viral. Foi realizada uma análise in silico nos promotores das proteínas CAS para verificar a presença de sítios de ligação de H-NS. Foram identificadas regiões de alto conteúdo AT, com curvatura típica potencial para a ligação de H-NS. A análise da expressão das H-NS mostrou que somente as H-NS 1 e 3 são expressas em Ralstonia solanacearum. Para confirmar que as proteínas H-NS possuem efeito regulatório na expressão dos genes Cas, foram construídos cassetes para a obtenção de mutantes para H-NS1, H-NS 2 e H-NS3. A obtenção dos mutantes e a análise da expressão dos genes Cas nos mutantes irão permitir elucidar o papel regulatório de H-NS na expressão do sistema CRISPR-Cas em Ralstonia solanacearum. / Viruses that infect bacteria are the most abundant organisms on the planet, and play important roles in maintaining the ecosystem. In recent years, the use of viruses as a biological control tool has gained a lot of attention, mainly due to the difficulty of isolating new antimicrobial drugs and the selection of bacteria resistant to existing drugs. Because of this potential as biological control agents, the findings on these viruses have increased what broadens the perspectives of the ecological management of diseases in plants. In this context, the present work had as objectives i) to characterize a bacteriophage isolated from Ralstonia solanacearum from the state of Ceará, Brazil ii) to characterize H-NS proteins of Rastonia solanacearum and to study its regulatory effect in the CRISPR-Cas system. From a non-pathogenic isolate of Ralstonia solanacearum, a filamentous virus was isolated which has a pseudo-lysogenic- like multiplication cycle. The viral genome was completely sequenced, containing 6945 nucleotides and a GC content of 61.25%. The genomic organization is typical of viruses of the family Inoviridae, genus Inovirus. Comparison of the sequences obtained with other inovirus sequences suggests that the viral isolate is a new species of the φRSS group, tentatively named Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). RSIBR1 particles were transmitted to R. pseudosolanacearum, which when infected by RSIBR1 also lost the ability to cause disease in tomato plants, suggesting that the viral infection interferes with the pathogenicity of Ralstonia spp. In previous studies, it has been shown that the CRISP-Cas system of Ralstonia solanacearum is inactive. To assess whether this inactivity can be explained by the presence of H-NS type proteins, we searched for genes encoding H-NS in the Ralstonia solanacearum genome. Three H-NS copies (H-NS 1, 2 and 3) were located in megaplasmid. No copies of H-NS encoded on the bacterial chromosome were Identified. Ralstonia solanacearum H-NS have the well-conserved oligomerization and DNA binding domains. Phylogenetic analysis of H-NS proteins from different bacteria grouped according to the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae and Ralstoniaceae. In addition, it was observed that the H-NS proteins of the Ralstoniaceae family are highly conserved with H-NS encoded by podovirus, suggesting that the H-NS of Ralstoniaceae may be of viral origin. An in silico analysis was performed on the promoters of the CAS proteins to verify the presence of H-NS binding sites. Regions with high AT content were identified, with a typical potential curvature for H-NS binding. Analysis of H-NS expression showed that only H-NS 1 and 3 are expressed in Ralstonia solanacearum. To confirm that H-NS proteins have a regulatory effect on the expression of Cas genes, cassettes were constructed to obtain mutants for H-NS1, H-NS2 and H-NS3. Obtaining the mutants and analyzing the expression of the Cas genes in the mutants will enable elucidating the regulatory role of H-NS in the expression of the CRISPR-Cas system in Ralstonia solanacearum. / Arquivo PDF difere da versão impressa na ficha catalográfica e as linhas apresentam numeração. E-mail enviado informando as divergências em 05-09-2018.

Orientador : Alvaro Santos Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T04:57:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gaspar_JoseOsmar_D.pdf: 3808807 bytes, checksum: 7cd95060b1651d03a8be7925b6402fc2 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: As particulas do virus do mosaico angular do feijoeiro (VMAF) são alongadas, ligeiramente flexiveis ,com comprimento normal de 650 nm e 13 nm de diâmetro. Em células infectadas de feijoeiro Jalo e soja, o VMAF ocorre como feixes de particulas paralelas ou, de maneira caracteristica, na forma de feixes de particulas onde estas apresentam-se presas em uma extremidade do feixe e sol tas na outra. Aqui, elas se curvam tornando-se falcadas. O VMAF apresenta sua capa envol tória constituida de um só tipo de proteina de peso molecular 32600 D e uma concentração de ácido nucleico ao redor de 7'/0.Baseado na similaridade da morfologia, comprimento normal da particula, presença de feixes de particulas falcadas, peso molecular proteina da capa, contéudo de ácido nucleico, além de dados da anteriormente conhecidos de patologia e serologia, é concluido-que o.VMAF' é idêntico ao virus do mosqueado fraco do caupi (VMAC), descrito em outras partes do mundo. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The particles of bean angular mosaic virus (BAMV) are filamentous and slightly flexuous with 650 nm in normal length and 13 nm in diameter. In Jalo bean and soybean infected cells, the BAMV occeurs in bundles of falcate particles or, more rarely, parallel particles. The BAMV contains a single protein (M. Wt. 32,600) and 7% of nucleic acid. Particle morphology, its oceurrenee in falcate bundles, protein molecular weight, and nucleic acid content, besides pathological and serological characteristics indicate that bean angular mosaic virus and cowpea mild mottle virus (CpMMV) , are the same virus. The presence of falcate bundles in infected tissues alone is considered of diagnostic value for BAMV and CpMMV infections. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T20:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dani_MariaAngelaGomesdeCastro_M.pdf: 3584513 bytes, checksum: 44f0c60386e93a6a79298e7ba5df2fba (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Pneumovírus aviário (PVA) causa infecção aguda no trato respiratório em perus (rinotraqueítedos perus) e galinhas (síndrome da cabeça inchada) com início abrupto e disseminação rápida. Neste estudo, foi padronizada a reação de RT-PCR quimioluminescente para detecção de um transcrito do gene F do PVA em dois isolados europeus e dois isolados brasileiros. Foram realizadas PCRs de diluição limitante utilizando-se RT-PCR quimioluminescente e "nested PCR" (nPCR) para a comparação quanto à sensibilidade e especificidade entre as metodologias na detecção de PVA. A sensibilidade e especificidade da RT-PCR quimioluminescente foram semelhantes às da nPCR e 100 vezes mais sensível que uma única PCR. O seqüênciamento dos produtos de 175 pb do gene F revelaram 100% de homologia com seqüências depositadas no banco de dados. Em seguida foi realizada a caracterização dos isolados brasileiros através de RT-PCR, análise com enzimas de restrição e seqüênciamento automático de um fragmento do gene G. Os produtos de 600 pb correspondentes aos primeiros 600 nucleotídeos do gene G dos isolados SHS BR 119 e SHS BR 121 revelaram 99% de similaridade com 3 isolados do subgrupo A e 87% de similaridade com isolados do subgrupo B depositadas no banco de dados / Abstract: Avian Pneumovirus (APV) causes an acute respiratory tract infection both in turkeys (turkey rhinotracheitis) and chicken (swollen head syndrome) with sudden onset and rapid spread through the flocks. In this study, immunochemiluminescent Southern blot RT-PCR assay was employed to detect a F gene transcript of the avian pneumovirus (APV) in two European turkey isolates and two Brazilian chicken isolates. Limiting dilution PCR was performed to compare the sensitivity of immunochemiluminescent Southern blot assay and nested PCR (nPCR) assay. The sensitivity and specificity of immunochemiluminescent Southem blot RT-PCR assay were comparable to that of nPCR, and at least 100 fold more sensitive than a single PCR amplification. Sequence analysis of the 175 bp product ofthe F gene revealed 100% identity with earlier reported PVA sequences. We characterized the Brazilian isolates using restriction analysis and sequencing of a 600 bp fragment of the G gene and conclude that the isolates belong to the APV subgroup A / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Com os avanços recentes nos métodos de detecção de patógenos, a importância das doenças polimicrobianas tornou-se mais evidente e a identificação de interações de patógenos e seus mecanismos de potenciação de enfermidades se tornou um tema de grande interesse. O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) está associado a várias síndromes, tais como a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS), a síndrome da dermatite e nefropatia dos suínos (SDNS), o complexo das doenças respiratórias dos suínos (CDRS), falhas reprodutivas e tremores congênitos, coletivamente chamadas “doenças associadas ao circovírus suíno tipo 2” (PCVAD), e que, além do PCV2, podem apresentar diferentes graus de envolvimento de outros agentes. Dentre estas, a SMDS é a que apresenta maior impacto na cadeia produtiva de suínos. Sendo a SMDS uma doença multifatorial e polimicrobiana, estudos buscando identificar associações do PCV2 com outros patógenos são importantes. No presente trabalho foram desenvolvidos ensaios moleculares para a detecção de alguns agentes cuja potencial participação nas PCVAD não havia ainda sido estudada com maior profundidade. Dessa forma, o citomegalovírus suíno (PCMV) e os recém-identificados bocavírus suínos do tipo 1, 2, 3 e 4 (PBoV1-4) foram pesquisados em amostras de animais afetados ou não pela SMDS, em diferentes faixas etárias. O PCMV foi detectado em altas taxas em ambos os grupos de animais, afetados ou não pela SMDS, sendo que nenhum tipo de associação com a SMDS pode ser inferida quanto à detecção de genomas de PCMV e o desenvolvimento da síndrome. A detecção de genomas de PBoV2 e 3 foi associada com animais afetados pela SMDS, enquanto nenhum tipo de associação foi inferida com a detecção de genomas de PBoV1 e do PBoV4. Animais afetados pela síndrome apresentam frequência de detecção e carga viral de PBoV2 significantemente superior à frequência encontrada em animais saudáveis com idade equivalente, revelando uma associação positiva entre PBoV2 e a SMDS. Por outro lado, animais adultos possuem uma carga viral significativamente superior a dos animais jovens sem sinais clínicos de SMDS. Os resultados obtidos possibilitaram detectar, pela primeira vez, os quatro tipos PBoV em amostras de suínos no Brasil. Paralelamente, esse estudo mostrou, pela primeira vez, a presença de genomas circulantes de PBoV1, PBoV2 e PBoV4 em animais adultos clinicamente saudáveis. Além disso, permitiu sugerir uma possível associação entre SMDS e PBoV2 e PBoV3, mostrando que mais estudos devem ser realizados para elucidar tal associação. / With recent advances in pathogen detection methods, the importance of polymicrobial diseases has become more evident, and identification of pathogen interactions and their disease potentiation mechanisms has become a topic of great interest. The porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with several syndromes, such as Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS), Porcine respiratory disease complex (PRDC), reproductive failures and congenital tremors, collectively called "Porcine circovirus type 2 associated diseases" (PCVAD), that beyond PCV2, may have different degrees of involvement of other agents. Among these, PMWS have the main impact on pig production chain. As PMWS is a multifactorial and polymicrobial disease, studies attempting to identify associations of PCV2 with other pathogens are important. In the present work, we developed molecular assays for detection of some agents whose potential role in PCVAD had not yet been studied in greater depth. Thus, porcine cytomegalovirus (PCMV) and newly identified porcine bocavirus type 1, 2, 3 and 4 (PBoV1-4) were investigated in samples of animals with or without PMWS, in different age groups. PCMV was detected at high rates in both groups of animals, and any type of association with PMWS could be inferred regarding detection of PCMV genomes and syndrome development. The PBoV2 and PBoV3 genomes detection was associated with animals affected by PMWS, while no association could be inferred from detection of genomes PBoV1 and PBoV4. Animals affected by the syndrome had significantly higher PBoV2 frequency of detection and viral load than the healthy animals with equivalent age, showing a positive association between PBoV2 and PMWS. Moreover, adult animals had significantly higher viral load than young animals without clinical signs of PMWS. Obtained results showed, for the first time, the four types of PBoV in Brazilian pig samples and the presence of circulating genomes of PBoV1, PBoV2 and PBoV4 in clinically healthy adult animals. It also allowed suggesting a possible association between PBoV2 and PBoV3 with PMWS, showing that more studies are needed to elucidate this association.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-22T12:52:26Z No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-22T12:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE COMPLETA Guilherme P P Zolini.pdf: 5332439 bytes, checksum: 59494ecd480af09a4c7fc97891dfd358 (MD5) / FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz (PAPES IV / PAPES V) CPqRR – Centro de Pesquisa René Rachou CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais INCTV – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas / Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunopatologia do Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) e no Laboratório de Vírus (Labvirus) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os herpesvirus possuem genoma DNA e são envelopados. Aproximadamente 70% dos adultos já tiveram contato com Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1). O HSV-1 causa úlceras ou até mesmo lesões mais graves como encefalite, e após a infecção, o vírus comumente fica latente e pode ser ou não reativado. Células do sistema immune inato, através dos “Receptores do Tipo Toll” (TLRs), reconhecem “padrões moleculares associados a patógenos” (PAMPs) orquestrando a resposta imune contra o vírus. Quando ativados, TLRs iniciam uma cascata de sinalização que culmina na ativação de genes relacionados à defesa imune inata (óxido nítrico-NO, citocinas e quimiocinas). Outros estudos do grupo mostraram que animais nocautes (KO) para TLR9 ou TLR2/9 apresentam alta mortalidade na infecção por HSV-1, ao contrário dos C57BL/6 selvagens (WT) e TLR2KO, que são capazes de controlar o vírus. Objetivamos pesquisar a interrelação na expressão dos TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 em animais TLR2 KO, TLR9 KO e TLR2/9 KO infectados por HSV-1 e principais citocinas, células e mecanismos imune celulares contra infecção por HSV-1. No presente trabalho camundongos WT, TLR2KO, TLR9KO e TLR2/9KO foram infectados via intranasal com 106 u.f.p. de HSV-1, e seus controles receberam PBS. A eutanásia dos animais foi realizada no 5º dia após infecção (dpi), que previamente já foi demonstrado ser o pico da infecção neste modelo, e então gânglios trigêmeos (TG) e cérebros foram coletados. A expressão de TLRs 1, 2, 3, 6, 7 e 9 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Camundongos WT infectados apresentaram diferença significativa na expressão destes TLRs comparados com seus respectivos controles no TG, mas não no cérebro. Nos KOs, houve aumento da expressão dos TLRs tanto nos TGs (mas com níveis mais moderados comparado aos WT) quanto nos cérebros. Também foi avaliada a expressão de gp91phox, p22phox e iNOS. A expressão de iNOS em C57BL/6 WT infectados foi maior que nos outros grupos, mas o mesmo não ocorreu para gp91phox, p22phox. Adicionalmente, foi mensurada a produção de NO por macrófagos intraperitoneais, através da reação de Griess, que demonstrou maior produção por macrófagos WT, comparados aos grupos TLR KOs. Ensaios de histopatologia e imunofluorescência demonstraram maior celularidade nos TGs infectados, além de confirmar a presença de CD8, macrófagos, e aumento da produção de iNOS nos C57BL/6 WT infectados, o que não ocorreu com os camundongos TLRs KO. Em ensaio de sobrevivência com C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO e iNOS KO a importância das células T e do iNOS foi confirmada, uma vez que CD8 KO, RAG KO e iNOS KO tiveram 0% de sobrevida. Camundongos C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO e iNOS KO tiveram seus TGs analisados por PCR em tempo real para verificar a expressão do gene viral VP-16 e MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes e TNF-_ no 5º dpi. Estes dados indicaram a relevância de iNOS e das célúlas T na resposta inata contra o HSV-1, uma vez que os RAG KO foram irresponsivos à expressão das citocinas, enquanto os iNOS KO apresentaram uma resposta exacerbada das mesmas. Ensaio de citometria indicou que IFN_ produzido pelas células T CD8, nos TGs, e produzido pelas células T CD4 e Natural Killer (NK), nos linfonodos regionais, são um possível mecanismo de controle contra a infecção de HSV-1 dos animais WT infectados. Hipotetizamos que a expressão coordenada de TLRs reflete na orquestração eficiente do sistema imune inato, através da produção equilibrada de quimiocinas e citocinas e da atividade imune celular adequada, com produção de NO por macrófagos e ação de células T CD8, T CD4 e NK controlando a infecção por HSV-1. / This work was carried out in the Immunopathology laboratory of the Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) and Virus laboratory (Labvirus) of the Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Herpes viruses have DNA genome and are enveloped. Approximately 70% of adult people have had contact with the Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1). After infection, HSV-1 cause cold sores, or more serious injuries such as encephalitis, and after infection, the virus usually become latent and may be reactivated or not. Cells of innate immune system recognize the “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) through “Toll Like Receptors” (TLRs), orchestrating the immune response against the virus. When activated, TLRs start a signalization cascade that culminates in the activation of genes related to the innate immune defense (NO, cytokines and chemokines). Previous research from our group demonstrated that knockout (KO) mice to TLR9 and TLR2/9 showed high mortality after HSV-1 infection, unlike C57BL/6 wild type (WT) and TLR2KO, which were able to control the virus. Research aimed in interrelation of the expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 in TLR2 KO, TLR9 KO and TLR2 / 9 KO mice infected with HSV-1 and the main cytokines, cells and cellular immune mechanisms against infection by HSV-1. In this work, TLR2KO, TLR9KO, TLR2/9KO and C57BL/6 WT mice were intranasally infected with 106 p.f.u. of HSV-1, and their respective controls received PBS. Mice euthanasia was at the 5th day post infection (dpi), previously showed to be the viral multiplication peak in our model, and then trigeminal ganglia (TG) and brain were collected. The expression of TLRs 1, 2, 3, 6, 7 and 9 were measured by Real Time PCR. Infected WT mice showed significant increase in the expression of these TLRs compared to respective controls in TG, but not in brain.KOs mice had increased expression of TLRs in TG (but in more moderated levels compared to WT) and in the brains. The expression of gp91phox, p22phox and iNOS were also measured. iNOS expression in infected C57BL/6 WT was higher than in other groups, that not occurs to gp91phox, p22phox. In addition, NO production by intraperitoneal macrophages was measured through Griess reaction, that demonstrated a more pronounced production by WT macrophages, compared to TLR KOs groups. Histopathology and immunofluorescence assays demonstrated higher cellularity in infected TG, and besides confirmed the CD8 and macrophages presence and increase of iNOS production in infected C57BL/6 WT, what did not occurred with TLR KO mice. In survival assay with C57BL/6 WT, CCL3 KO, CD8 KO, RAG KO and iNOS KO, we showed the importance of the T cells and iNOS, because CD8 KO, RAG KO and iNOS KO had 0% of survival. C57BL/6 WT, RAG KO, CCL3 KO and iNOS KO mice had their TG analyzed by Real Time PCR, to verify the expression of viral gene VP-16 and MCP-1, iNOS, IP-10, Rantes and TNF-_ in 5th dpi. These data show us that iNOS and T cells are important in innate responses against HSV-1, once RAG KO were irresponsive to cytokines expression, while iNOS KO showed an excessive response to cytokines expression. The cytometry assay indicated that IFN_ produced by T CD8 cells, in the TG, and by T CD4 and Natural Killer cells (NK), in region lymph nodes, are a possible mechanism to control HSV-1 infection of WT infected mice. We hypothesize that coordinated expression of TLRs leads to an efficient orchestration of the innate immunity system, through cytokines and chemokines stable production and proper cellular immune activity, with NO production by macrophages and T CD8, T CD4 e NK cells action controlling HSV-1 infection.

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Resumo: Paramyxoviridae, é um vírus envelopado com tamanho médio de 120 a 300nm, de simetria helicoidal, que apresenta um genoma de RNA fita simples não segmentado de polaridade negativa. Este genoma codifica 11 proteínas, dentre as quais as glicoproteínas de membrana que são responsáveis pela infectividade do vírus. A proteína F, em associação com a proteína G e SH, é responsável pela fusão da membrana viral à célula que será infectada, ou seja, esta proteína proporciona a entrada e instalação do vírus na célula. Conhecer a forma de interação das proteínas da membrana viral com a célula que será infectada é importante para propor um mecanismo de inibição deste processo de infecção viral. Existem evidências que os glicosaminoglicanos são potenciais inibidores da infecção causada por vários vírus. A hipótese é de que este processo de inibição ocorra devido à ligação dos glicosaminoglicanos às proteínas da membrana viral, mais especificamente na proteína G, que apresenta um domínio de ligação para heparina, impedindo desta forma, que o vírus se ligue na célula hospedeira e que inicie o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar a atuação de glicosaminoglicanos como potenciais inibidores da infecção viral. Esta análise foi realizada por meio de experimento de cultivo de células Hep2 na presença dos glicosaminoglicanos heparina e dextrana sulfatada que foram inoculadas com o vírus sincicial respiratório do tipo A (RSVA) e analisados por meio das técnicas de PCR e Imunofluorescência Indireta. Os resultados mostraram que a heparina e a dextrana sulfatada apresentam efeito inibitório da infecção viral em cultivo de células Hep2. / Abstract: The respiratory sincicial virus (RSV) is part of Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family, is an enveloped virus with average size of 120 to 300nm, helical symmetry, that presents a genome consisting of a single strand, no segmented, RNA negative. This genome codifies for 11 proteins including the membrane glycoproteins which are responsible for the infectivity of the virus. Protein F in association with protein G and SH is responsible for the fusion of the viral membrane with the cell that will be infected, that is, this protein provides the entrance and the virus to settle in the cell. To know the form of interaction of viral membrane proteins with the cell that will be infected is important to propose a mechanism to inhibit of this process of viral infection. Evidences exist that the glycosaminoglycans are potential inhibitors of the infection caused by some viruses. The hypothesis is that this process of inhibition occurs more specifically due to the interation between glycosaminoglycans and the proteins of the viral membrane, more specifically in protein G, that presents a domain of linking for heparin, avoiding the virus to bind to the host cell and initiating the infection process. The aim of this work was to verify the performance of glycosaminoglycans as inhibitors of the viral infection. This analysis was accomplished through experiments of Hep2 cell culture in the presence of these glycosaminoglycans (heparin and dextran sulfate) that was inoculated with the respiratory sincicial virus type A (RSVA) and analyzed through the technique of PCR and Indirect Imunofluorecence. The results had shown that the heparin and the dextran sulfate presented an inhibitory effect of the viral infection in Hep2 cells culture. / Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Paula Rahal / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Paola Jocelan Provazzi Scaranzi / Mestre

Conhecido como vírus da imunodeficiencia humana, o HIV é o causador da AIDS, a sindrome de imunodeficiencia adquirida. O vírus, ao infectar o hospedeiro, ataca células T CD4 do sistema imune. Existem drogas da terapia anti-retroviral para o tratamento da AIDS, um regime complexo de drogas prontas para atacar o HIV em certos estágios do seu ciclo de vida. O HIV, em média, demora dez anos para passar de infecção primária para AIDS propriamente dita. Anteriormente, sabia-se que a taxa de replicação do HIV era muito baixa, mas juntamente com a terapia, percebeu-se que essa taxa poderia crescer rapidamente. A modelagem dessas taxas indicou que o vírus poderia se tornar resistente a qualquer droga, principalmente daquelas que precisavam de uma mutação para gerar resistência. Neste trabalho foram gerados três modelos intra - hospedeiro, que tentam retratar a dinâmica viral no interior de um indivíduo, abordando certas questões de interesse, tal como resistência, tratamento ARV e adesão ao tratamento, com EDOs, resolvidas através do Programa Model-Builder. O modelo I descreve a interação entre células T CD4 suscetíveis (T), células infectadas por vírus selvagem (Is), por células infectadas por vírus resistentes (Ir), vírus selvagens (Vs) e vírus resistentes (Vr). As células T CD4 são geradas a uma taxa λ, morrem a uma taxa d por célula, e são infectadas a uma taxa Ks e Kr. Células infectadas a constante δ e produzem vírus uma taxa fs e fr por célula. O modelo I foi testado através de dados da literatura de dois pacientes com dados experimentais coletados. Os gráficos gerados pelo programa Model-Builder foram similares aos da literatura.Inibidores de transcriptase reversa são usados para bloquear a habilidade do vírus de infectar a célula, enquanto que inibidores de protease provocam a liberação de partículas virais não infecciosas. Sendo assim, o modelo II descreve a interação entre as células T CD4 suscetíveis (T), quatro tipos de células infectadas, as duplamente sensíveis aos inibidores de RT e IP (Iss), as sensíveis a RT e resistentes a IP (Isr), as resistentes a RT e sensíveis a IP (Irs) e as duplamente resistentes (Irr), e os quatro tipos de vírus livres, que estão de acordo com a descrição anterior, Vss, Vsr, Vrs, Vrr. As células T CD4 são geradas a uma taxa λ e morrem a uma taxa d por célula e são infectadas a uma taxa k específica para cada tipo viral. Células infectadas morrem a uma taxa constante δ por célula e produzem novos vírus a taxas fss, frs, fsr e frr, respectivamente e novos vírus são liberados no sistema a uma taxa c por vírus, onde εrt e εip são as eficácias para IRT e IP, ao se abordar o tratamento ARV, no qual ε = 1 significa uma droga perfeita. Sabe-se que a simulação da dinâmica viral em redes sociais/sexuais tenta identificar quais as possibilidades de cepas virais resistentes serem transmitidas para a população. Assim, um modelo populaciona dinâmico, inter-hospedeiro foi desenvolvido para demonstrar como o vírus se espalha através das redes de contato da população através de uma redes sexual fictícia de 200 pessoas suscetíveis, com um tempo de 100 dias, no qual primariamente um indivíduo era inoculado com uma infecção mista, sendo rodado o modelo III no mesmo e depois, este indivíduo índice transmitia a infecção para o resto da rede. Os resultados desta dinâmica indicaram que em uma infecção mista, com tipos virais selvagens e resistentes, o tipo selvagem pode vencer a competição em cenários de baixa e intermidiária adesão, mas em cenários de alta adesão na população, o tipo resistente e o selvagem podem coexistir na presença de várias combinações de ARV. Logo, através deste modelo epidemiológico, novas propostas de políticas e estratégias para o uso da terapia ARV e revisão do uso da HAART podem ser propostas, com a finalidade de um melhor resultado, na presença de ambos os tipos de vírus, na sobrevida das pessoas que vivem com HIV/AIDS hoje, no mundo