Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-30. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:17:14Z : No. of bitstreams: 1 000865632.pdf: 903176 bytes, checksum: 3e51870d6b17dcc44625fae1468b3e9d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da molécula de quorum sensing farnesol na formação de biofilmes simples e misto de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175. Inicialmente o farnesol foi diluído em metanol e posteriormente em saliva artificial (SA). Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) do farnesol contra as células de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175 em suspensão foram baseados no método da microdiluição. O farnesol diluído nas concentrações de 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 70, 150 e 300 mM foi aplicado sobre os biofilmes de Candida albicans e Streptococcus mutans (formação) e após 48 horas de contato sua atividade antibiofilme foi determinada por meio da quantificação da biomassa total (coloração com violeta cristal (CV)), enumeração das unidades formadoras de colônias (UFCs) e atividade metabólica (XTT). Foi ainda realizada uma curva de tempo de morte celular para os dois microrganismos estudados. Após o tratamento com o farnesol, a matriz dos biofilmes foi extraída e analisada em termos de concentração de proteínas e carboidratos, além do teste de pH para S. mutans e verificação das atividades enzimáticas de proteinase, fosfolipase e hemolítica para Candida albicans, ainda a estrutura dos biofilmes foi analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura. Os resultados de CIM foram de 150 mM para C. albicans e de 6.25 mM para S. mutans. O farnesol diminuiu a formação de biofilmes simples e mistos, com reduções significativas de 37-90% e 64-96%, respectivamente para a biomassa total e atividade metabólica. Para os biofilmes simples, concentrações de farnesol iguais ou maiores que 3,125 mM promoveram reduções significativas (1,3-4,2 log10; p < 0,05) nas UFCs, enquanto que para os biofilmes mistos reduções... / The aim of this study was to evaluate the activity of a quorum sensing molecule, farnesol, in biofilm formation of Candida albicans ATCC 10231 and Streptococcus mutans ATCC 25175. Initially farnesol was diluted in methanol and then in artificial saliva (AS). Minimum inhibitory concentration tests (MIC) of farnesol against Candida albicans ATCC 10231 cells and Streptococcus mutans ATCC 25175 suspension were based on the microdilution method. Farnesol was prepared at concentrations of 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 70, 150 and 300 mM, and placed in contact with biofilms in formation of Candida albicans and Streptococcus mutans for 48 hours. Its antibiofilm activity was determined by quantifying the total biomass (stained with crystal violet (CV)), enumeration of colony forming units (CFUs) and metabolic activity (XTT). It was further carried out a cell death time curve for both microorganisms studied. After the treatment with farnesol, the matrix of the biofilm was extracted and analyzed in terms of protein and carbohydrates, in addition to the pH test for S. mutans and examination of enzymatic activities of proteinase, fosfolipase and hemolytic for Candida albicans. The structure of biofilms was analyzed by scanning electron microscopy. The MIC values were 150 mM for C. albicans and 6.25 mM for S. mutans. Farnesol decreased the formation of single and mixed biofilms, with significant reductions of 37-90% and 64-96% respectively for the total biomass and metabolic activity. For single biofilms, farnesol concentrations equal to or higher than 3.125 mM promoted significant reductions (1,3-4,2log10; p <0.05) in the CFU for single biofilms, while in mixed biofilms the reductions (0,67-5,32log10; p <0.05) were noted at concentrations of 1.56 mM. For cell death curve after an hour in contact with those microorganisms, farnesol reduced 1 log10... / FAPESP: 13/23592-0

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-11. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:12Z : No. of bitstreams: 1 000866878.pdf: 819016 bytes, checksum: f4b074f87450614f386b1be1ec42f77b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros / Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses

Submitted by David Jossue Lopez Espinosa (daespi24.7@gmail.com) on 2016-08-30T20:02:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação-David-Completa1.3.pdf: 1347529 bytes, checksum: 922e472d250d99953bbb493161f43551 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-08-31T18:11:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 espinosa_djl_me_jabo.pdf: 1347529 bytes, checksum: 922e472d250d99953bbb493161f43551 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T18:11:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 espinosa_djl_me_jabo.pdf: 1347529 bytes, checksum: 922e472d250d99953bbb493161f43551 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) / A susceptibilidade de Bemisia tabaci biótipo B (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) aos isolados de Beauveria bassiana (IBCB18, IBCB35, IBCB66 e JAB07), Lecanicillium muscarium (LCMAP3790) e Metarhizium rileyi (NOM1950) foi avaliada em testes de patogenicidade e virulência. A concentração discriminatória de 108 conídios/ mL-1 foi utilizada para bioensaios com ovos e ninfas de terceiro ínstar utilizando folhas de feijão como substrato. Para cada tratamento foram utilizados 60 ovos e 60 ninfas, distribuídos em três repetições. A testemunha consistiu de água destilada esterilizada + Tween® 80 (0,05%). Para estimar a virulência dos isolados, foram realizados bioensaios de estimativa da concentração letal (CL50). As suspensões dos isolados (1,0 × 103 , 1,0 × 104 , 1,0 × 105 , 1,0 × 106 , 1,0 × 107 e 1,0 × 108 conídios/mL-1 ) foram pulverizadas sobre ovos e ninfas de terceiro ínstar e avaliou-se o número de ovos e ninfas com mortalidade confirmada pelo fungo. Todos os isolados testados foram patogênicos para ovos e ninfas de B. tabaci. A mortalidade de ninfas e de ovos variou de 63,3 a 100,0 e 32,1 a 95,0%, respectivamente. Os isolados JAB07 e IBCB18 de B. bassiana e o LCMAP3790 de L. muscarium foram os melhores para o controle de ninfas e ovos de B. tabaci, sendo que o isolado JAB07 foi o mais virulento para ninfas e ovos, com CL50 estimada de 0,006 e 0,012 x 103 conídios/mL-1 para ovos e ninfas de terceiro ínstar, respectivamente, sendo este o isolado mais indicado para futuros testes a em casa de vegetação e campo para o controle de B. tabaci. / The susceptibility of Bemisia tabaci biotype B (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae) to isolates of Beauveria bassiana (IBCB18, IBCB35, IBCB66 and JAB07) Lecanicillium muscarium (LCMAP3790) and Metarhizium rileyi (NOM1950) was evaluated using pathogenicity and virulence tests. The 1,0 × 108 conidia/mL-1 discriminatory concentration was used for bioassays with 60 eggs and 3rd instar nymphs in bean leaves as a substrate. For each treatment was used 60 eggs and nynphs distribued in three replicates. The control treatment consisted of distilled water + Tween 80 (0.05%). To estimate the virulence of strains, lethal concentration (LC50) bioassays were performed. Isolates suspensions (1,0 × 103 , 1.0×104 , 1.0×105 , 1.0×106 , 1.0×107 and 1.0×108 conidia/ml-1 ) were sprayed on eggs and 3rd instar nymphs and the number of eggs and nymphs with mortality confirmed by the fungus was evaluated. All isolates tested were pathogenic for B. tabaci eggs and nymphs. The mortality rate of nymphs and eggs ranged from 63.3 to 100.0 and 32.1 to 95.0%, respectively. JAB07 and IBCB18 from B. bassiana and LCMAP3790 L. muscarium isolated were the best for the control of B. tabaci nymphs and eggs, JAB07 was the isolate most virulent for nymphs and eggs, with LC50 estimated 0.006 and 0.012 x 103 conidia/mL-1 estimated for eggs and 3rd instar nymphs, respectively, this being isolated most suitable for future field trials for control of B. tabaci.

Submitted by TAÍS RAMALHO DOS ANJOS null (tranjos.vet@gmail.com) on 2017-04-24T12:41:20Z No. of bitstreams: 1 TAIS_RAMALHO_DOS_ANJOS (2).pdf: 1545211 bytes, checksum: 549d837c68e7609438e83800c2a4db56 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T20:34:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 anjos_tr_me_jabo.pdf: 1545211 bytes, checksum: 549d837c68e7609438e83800c2a4db56 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T20:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anjos_tr_me_jabo.pdf: 1545211 bytes, checksum: 549d837c68e7609438e83800c2a4db56 (MD5) Previous issue date: 2017-04-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O tratamento térmico por UAT elimina formas vegetativas dos microrganismos, porém, formas esporuladas altamente resistentes ao calor podem permanecer nos produtos e após a germinação dos esporos são capazes de liberar toxinas causadoras de doenças transmitidas por alimentos (DTAs). No presente estudo, objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica de produtos tratados por UAT, por meio da contagem de microrganismos heterotróficos aeróbios mesófilos, isolamento e contagem de bactérias do grupo do Bacillus cereus e de Clostridium perfringens, comparar lotes dos três produtos quanto a tais microrganismos, identificar a espécie dos isolados e a presença dos fatores de virulência de bactérias do grupo do B. cereus. Para isso, foram obtidas 75 amostras, sendo 25 de cada produto (de leite de cabra UAT, alimento com soja UAT e bebida de leite de cabra e soja UAT), de 5 diferentes lotes, no comércio do interior do Estado de São Paulo. Os resultados evidenciaram possíveis falhas de processamento e utilização de matéria-prima inadequada, uma vez que altas populações (>104UFC/mL) de microrganismos heterotróficos aeróbios mesófilos foram verificadas em 100% dos lotes de alimento com soja e bebida de leite de cabra e soja e 80% dos lotes de leite de cabra. Microrganismos do grupo do B. cereus foram isolados de 80% dos lotes de alimento com soja, e 60% dos lotes de bebida de leite de cabra e soja e leite de cabra, com populações superiores a 1018 UFC/mL. C. perfringens foi isolado de 20% dos lotes de alimento com soja, com populações superiores a 103 UFC/mL. Na comparação entre os lotes, a data de validade não influenciou nas populações dos microrganismos analisados. Dos isolados de bactérias do grupo do B. cereus, 100% (29/29) apresentaram amplificação para o gene do complexo hbl, 96,5% (28/29) para o gene do complexo nhe e 75,8% (22/29) para o gene bceT. Tais resultados devem servir de alerta às autoridades sanitárias, pois leite de cabra e produtos à base de soja são normalmente consumidos por crianças e alérgicos, e o leite de cabra adicionado de soja apresentou maiores cargas de microrganismos patogênicos potencialmente causadores de intoxicações alimentares. / Heat treatment by UHT (ultra-high temperature) eliminates the vegetative forms of microorganisms, however, sporulated forms highly resistant to heat can remain in the products and following spore germination are capable of releasing toxins that cause foodborne diseases (FD´s). The objective of this study is to evaluate the microbiological quality of products submitted to UHT, namely goat milk, soy food, and goat and soy milk drinks, by the counting of heterotrophic aerobic mesophilic microorganisms, the isolation and counting of bacteria from the Bacillus cereus groups and Clostridium perfringens, comparing batches of the three products for such microorganisms, to identify the species of the isolated and the presence of the virulence factors of bacteria of the B. cereus group. For this, 75 samples were obtained, 25 of each product (from UAT goat milk, food with UAT soy and drink from goat milk and UAT soy) from 5 different lots, in the interior trade of the State of São Paulo. The results demonstrated possible failures in the processing and use of inadequate raw material since high population (>104 ) of heterotrophic aerobic mesophilic microorganisms were found in 100% of the lots of soy food and goat and soy milk drinks and 80% of the lots of goat milk. Microorganisms from the B. cereus group were isolated from 80% of the lots of soy food and 60% of the lots of goat and soy milk drinks, with population above 1018 . The C. perfringens microorganisms were isolated from 20% of the soy food lots, with population above 103 . In the comparison between the lots, the expiration date did not influence the population of the analyzed microorganisms, therefore, they were conveyed by the raw material used. Of the B. cereus isolated, 100% (29/29) showed amplification for the hbl complex gene, 96,5% (28/29) for the nhe complex gene and 75,8% (22/29) for the bceT gene. These results should serve as a warning to the health authorities because goat milk and soy-based products are generally consumed by children and individuals with allergies and goat milk added to soy was capable of carrying even higher doses of pathogenic microorganisms that may potentially cause food poisoning.

Submitted by LIANE CAROLINE SOUSA NASCIMENTO null (carolsousa@ifma.edu.br) on 2017-05-26T22:57:20Z No. of bitstreams: 1 Tese Liane Caroline Sousa.pdf: 2923720 bytes, checksum: f45d8056bdb8c66ff8b4ea8704a4ba6a (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-31T12:57:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nascimento_lcs_dr_sjrp.pdf: 2923720 bytes, checksum: f45d8056bdb8c66ff8b4ea8704a4ba6a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-31T12:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nascimento_lcs_dr_sjrp.pdf: 2923720 bytes, checksum: f45d8056bdb8c66ff8b4ea8704a4ba6a (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A busca por alimentos que proporcionem melhorias na saúde e bem estar dos consumidores é uma tendência mundial. Os produtos lácteos fermentados estão incluídos entre os alimentos que atendem a esta demanda. O objetivo desta pesquisa foi selecionar novas linhagens de bactérias ácido-láticas (BAL) potencialmente probióticas e seguras, bem como avaliar a aplicação das cepas selecionadas em leite. Na primeira etapa, o potencial probiótico (capacidade de hidrolise de sais biliares [BSH], capacidade de autoagregação, coagregação com Lactobacillus spp. e Listeria spp. e hidrofobicidade e tolerância em diferentes valores de pH e concentrações de NaCl) e a segurança (susceptibilidade a antibióticos e degradação da mucina) foram avaliados em vinte cepas de BAL, previamente isoladas de queijo muçarela de búfala e identificadas como Lactobacillus helveticus (SJRP56 e SJRP191), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SJRP49), Lactobacillus fermentum (SJRP42), Enterococcus durans (SJRP14, SJRP17, SJRP25, SJRP26 e SJRP68), Enterococcus faecium (SJRP20, SJRP28, SJRP65, SJRP69) e Enterococcus sp. (SJRP04, SJRP11, SJRP16, SJRP101, SJRP120, SJRP122 e SJRP125). Seis cepas apresentaram atividade de BSH e a maioria delas apresentou elevada capacidade de autoagregação e hidrofobicidade. Algumas cepas apresentaram capacidade de coagregação com outras BAL e patógenos. A maioria das cepas cresceu bem em pH neutro e a tolerância ao NaCl foi dependente da temperatura. Nenhuma das BAL degradou a mucina; entretanto, algumas apresentaram resistência aos antibióticos testados. Na segunda etapa, considerando as características probióticas e de segurança, as cepas E. faecium SJRP20 e E. faecium SJRP65 foram selecionadas para testes complementares, incluindo tolerância às condições simuladas do trato gastrointestinal (TGI), adesão as células Caco-2, produção da enzima ß- galactosidase e presença de genes associados à virulência e produção de aminas biogênicas. Ambas as cepas resistiram bem às condições do TGI, apresentaram baixa propriedade de adesão, são produtoras de ß-galactosidase e não apresentaram genes relacionados à adesão, agregação e colonização. E. faecium SJRP65 apresentou poucos genes relacionados a resistência a antibióticos e fatores de virulência. Em função disso, foi considerado com boas propriedades funcionais e com características interessantes para aplicação em produtos lácteos. Na terceira etapa, foi avaliada a aplicação de E. faecium SJRP20 e SJRP65 potencialmente probióticos em leite: cinética de acidificação, . pós-acidificação, resistência às condições simuladas do TGI e capacidade de sequestro de radicais livres. E. faecium SJRP20 em leite apresentou maior velocidade máxima de acidificação (Vmáx = 7,11x10-3upH/min), enquanto que E. faecium SJRP65 apresentou menor taxa de acidificação. Não houve diferença na composição centesimal das amostras de leite fermentado inoculado com as cepas de E. faecium. Durante a estocagem refrigerada houve redução do pH e aumento da acidez em todas as amostras de leite fermentado. Os produtos fermentados por ambas as cepas resistiram bem às condições simuladas do TGI, com elevada viabilidade ao longo do período de estocagem. O leite fermentado por E. faecium SJRP20 e SJRP65 apresentou elevada capacidade de sequestro de radicais livres. Com o aumento da concentração de produto e do tempo de estocagem, foi maior a capacidade antioxidante. A fermentação do leite por E. faecium potencialmente probióticos apresentou bons resultados, e a cepa E. faecium SJRP20 reuniu as melhores características tecnológicas para aplicação em produtos lácteos fermentados funcionais: apresentou maior velocidade de acidificação, menor tempo para atingir a velocidade máxima, maior estabilidade às condições do TGI durante a estocagem refrigerada e alta capacidade de sequestro de radicais livres. / The search for food which improves consumer health and well-being is a worldwide trend. The fermented dairy products are included among food which satisfies this demand. The aim of this research was to select new strains of lactic acid bacteria (LAB) potentially probiotic and safe, as well as to evaluate the application of selected strains in milk. In the first stage, the probiotic potential (bile salt hydrolase capacity [BSH], capacity of auto-aggregation, co-aggregation with Lactobacillus spp. and Listeria spp., hydrophobicity, tolerance in different pH values and concentrations of NaCl) and safety (susceptibility to antibiotics and mucin degradation) were evaluated in twenty LAB strains, previously isolated of water- buffalo mozzarella cheese and identified as Lactobacillus helveticus (SJRP56 and SJRP191), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SJRP49), Lactobacillus fermentum (SJRP42), Enterococcus durans (SJRP14, SJRP17, SJRP25, SJRP26 and SJRP68), Enterococcus faecium (SJRP20, SJRP28, SJRP65, SJRP69) and Enterococcus sp. (SJRP04, SJRP11, SJRP16, SJRP101, SJRP120, SJRP122 and SJRP125). Six strains presented BSH activity and most of them presented high capacity of auto-aggregation and hydrophobicity. Some strains presented capacity of co-aggregation with other LAB and pathogens. The majority of strains grew well in neutral pH and the tolerance to NaCl was dependent on the temperature. None of the LAB degraded the mucin; however, some of them presented resistance to the tested antibiotics. In the second stage, considering the probiotic features and safety, the strains E. faecium SJRP20 and E. faecium SJRP65 were selected for complementary tests, including tolerance to the simulated GIT conditions, adhesion to Caco-2 cells, production of ß-galactosidase enzyme and presence of genes associated to the virulence factors and production of biogenic amines. Both strains resisted well to the GIT conditions, presented low property of adhesion, ß-galactosidase activity and they did not present genes related to adhesion, aggregation and colonization. E. faecium SJRP65 presented few genes related to the resistance to antibiotics and virulence factors. According to this, it was considered with good functional properties and with interesting characteristics for application in dairy products. In the third stage, the application of potentially probiotic E. faecium SJRP20 and SJRP65 in milk was evaluated: acidification kinetics, post acidification, resistance to the simulated GIT conditions .(GIT) and free radicals scavenging capacity. E. faecium SJRP20 in milk presented higher maximum speed (Vmáx = 7,11x10-3upH/min), while the E. faecium SJRP65 presented lower acidification rate. There was not difference in the gross composition of the samples of fermented milk inoculated with E. faecium strains. During the refrigerated storage, there was a pH reduction and an increase in acidity for all fermented samples. The products fermented by both strains resisted well to the simulated GIT conditions, with high viability during the storage period. The milk fermented by E. faecium SJRP20 and SJRP65 presented high free radicals scavenging capacity. With the increase of the product concentration and the storage time, the antioxidant capacity was higher. The milk fermentation by potentially probiotic E. faecium presented good results, and the E. faecium SJRP20 strain combined the best technological characteristics for application in functional fermented dairy products: presented higher speed of acidification, lower time to reach the maximum speed, higher stability to the GIT conditions during the refrigerated storage and high free radicals scavenging capacity.

Submitted by PRISCILA LUIZA MELLO (priscila_mello@msn.com) on 2017-06-13T15:16:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Priscila Luiza Mello - versao final.pdf: 2607615 bytes, checksum: e303ccde84189b3e5dee79662db55303 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-13T17:37:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mello_pl_dr_bot.pdf: 2607615 bytes, checksum: e303ccde84189b3e5dee79662db55303 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T17:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mello_pl_dr_bot.pdf: 2607615 bytes, checksum: e303ccde84189b3e5dee79662db55303 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A mastite é considerada um grande problema na pecuária leiteira e o uso frequente de antimicrobianos contribui para o aumento da pressão seletiva de micro-organismos resistentes aos principais fármacos. A Organização Mundial da Saúde Animal tem alertado para o risco da resistência antimicrobiana resultante do uso indevido de antimicrobianos no tratamento de animais doentes. O presente trabalho tem como objetivos identificar e caracterizar o perfil clonal, bem como os fatores de virulência e de resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus spp. isolados do leite de bovinos com mastite subclínica de várias regiões do Brasil. As amostras foram concedidas pela Embrapa Gado de Leite, provenientes de 6 estados brasileiros, incluindo Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco. Foram incluídas 181 amostras de Staphylococcus spp. no estudo. A identificação fenotípica revelou um total de 82 (45,3%) Staphylococcus aureus e 99 (54,7%) Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Destes, a espécie mais isolada foi S. chromogenes com 27 (14,9%) amostras, seguido de S. epidermidis com 26 (14,3%). Realizou-se a confirmação genotípica utilizando a técnica Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) de todas as amostras, demonstrando um total de 98% de concordância com o teste fenotípico. Quanto à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), S. aureus revelou 99% de sensibilidade à oxacilina, enquanto os CoNS apresentaram 32% de resistência à esse antimicrobiano. Já para a vancomicina, todas as amostras foram sensíveis, apresentando apenas susceptibilidade reduzida pelo método de triagem, onde 13 amostras cresceram em BHI ágar com concentrações de 4μg/mL e 6 μg/mL de vancomicina. Com referência à produção de beta-lactamase foi possível observar que 96% das amostras de Staphylococcus spp. foram positivas. O gene mecA foi detectado em 8 amostras, todas do grupo CoNS e a tipagem do SCCmec revelou isolados do tipo I e tipo IV. Nas amostras em que não foram encontrados o gene mecA, foi realizada pesquisa do mecA homólogo (LGA251) e um total de 12 amostras apresentaram um produto de PCR com tamanho semelhante ao esperado para o gene mecC. No entanto o sequenciamento das amostras revelou similaridade de 99% com um gene ancestral do mecA. Através da técnica de PCR foram pesquisados os genes do operon ica responsáveis pela produção de biofilme,sendo detectados o gene icaA em 79 amostras (43,6%), o icaB em 24 (13,2%), o icaC em 57 (31,4%) e o icaD em 127 (70,1%). O gene bap foi detectado em 66 amostras (36,4%), enquanto o gene bhp foi encontrado apenas em 9 (4,9%) amostras de S. epidermidis. Já os ensaios de expressão por RT-qPCR comprovaram a expressão do gene icaA em 60 amostras (33%) do icaB em 6 (3,3%), do icaC em 26 (14,3%) e do icaD em 80 (44%). Quanto aos genes de enterotoxinas, o estudo revelou o gene sea como o mais frequente, sendo detectado em 18,2% das amostras, o gene seb em 7,7%, o sec em 14,9%, o sed 0,5%, o see em 8,2%, o sei em 6,6%, e o ser em 1,6%. Os genes ses, set e tst não foram detectados em nenhuma das amostras. A tipagem do perfil clonal das amostras pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis permitiu a identificação de oito clones de S. aureus que incluíram simultaneamente, ≥3 amostras, com similaridade ≥80%. Em relação às outras espécies estudadas, houve a formação de três grupamentos para a espécie S. chromogenes, enquanto para S. epidermidis quatro clusters foram detectados. Já ao analisar S. saprophyticus, foi possível observar apenas um grupamento. Quanto ao Multilocus Sequence Type (MLST) para o sequenciamento dos sete genes housekeeping, os ST prevalentes em S. aureus foram ST126 e ST1 enquanto em S. epidermidis, os ST foram todos distintos. / Mastitis is considered a major problem in dairy farming and the frequent use of antimicrobials contributes to increased selection pressure of resistant micro-organisms to the main drugs. The World Organisation for Animal Health are aimed at the protection of animal and human health against the risk of antimicrobial resistance resulting from the treatment of sick animals. This study aims to identify and characterize the clonal profile and the virulence as well as the virulence factors and the antimicrobial resistance to Staphylococcus spp. isolated from bovine milk with subclinical mastitis from several regions of Brazil. The samples were provided by Embrapa Gado de Leite (Embrapa Dairy Cattle), from 6 Brazilian states, including Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo and Pernambuco. A total of 181 samples of Staphylococcus spp. were included in the study. Phenotypic identification revealed a total of 82 (45.3%) Staphylococcus aureus and 99 (54.7%) Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) and, of these, the most isolated species was S. chromogenes with 27 (14.9%) samples, followed by S. epidermidis with 26 (14.3%). We realized the genotypic confirmation by using the technique Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) of all samples, demonstrating a total of 98% of concordance with the phenotypic test. As for the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), S. aureus showed 99% of susceptibility to oxacillin, while CoNS showed 32% resistance to this drug. As for vancomycin, all samples were susceptible, by displaying only reduced susceptibility screening method, where 13 samples grown on BHI agar at concentrations of 4μg/mL and 6 g/mL of vancomycin. With reference to the production of beta-lactamase was observed that 96% of Staphylococcus spp. strains were positive. The mecA gene was detected in 8 samples, all of CoNS group and typing of isolates revealed SCCmec type I and type IV. In the samples that were not found mecA gene, an homologous mecA (LGA251) survey was conducted and a total of 12 samples showed a PCR product with size similar to that expected for mecC gene. However, the sequencing of the samples revealed a similarity of 99% with an ancestral gene mecA. Through PCR technique were investigated genes of the ica operon responsible for the production of biofilm, being detected icaA gene in 79 samples (43.6%), the icaB in 24 (13.2%), icaC in 57 (31 , 4%) and icaD in 127 (70.1%). The bap gene was detected in 66 samples (36.4%), while bhp gene was found only in 9 (4.9%) samples of S. epidermidis. Yet, the expression assays by RT-qPCR demonstrated the expression of icaA gene in 60 samples (33%), of icaB 6 (3.3%) of icaC in 26 (14.3%) and icaD 80 (44 %). As for enterotoxin genes, the study revealed the sea gene as the most frequent, being detected in 18.2% of samples, the seb gene in 7.7%, sec in 14.9%, sed 0.5% , see in 8.2%, sei at 6.6% and the ser in 1.6%. The ses, set and tst genes were not detected in any of the samples. The typing of clonal profile of the samples by the Pulsed Field Gel Electrophoresis technique, permitted the identification of eight clones of S. aureus, included both ≥3 samples, with ≥80% similarity. For the other species studied, there was the formation of three groups for the S. chromogenes species, while for S. epidermidis, four clusters were detected. Have to analyze S. saprophyticus, we observed only one grouping. As for the Multilocus Sequence Type (MLST) that is the sequencing of seven housekeeping genes, the ST prevalent in S. aureus were ST126 and ST1 while in S. epidermidis, the ST were all different. / FAPESP: 2012/24135-0

Orientador : Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Ricardo José Giordano / Banca: Carlos Pelleschi Taborda / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Celso Luiz Marino / Resumo: O gênero Paracoccidioides consiste de fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente, estudos filogenéticos dividem o gênero Paracoccidioides em duas espécies denominadas Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A primeira é dividida em três espécies filogenéticas S1, PS2 e PS3, e a segunda é chamada de Pb01-like. A correta taxonomia molecular do gênero abriu novas possibilidades para o estudo e compreensão de suas relações com seu hospedeiro. Os fungos do gênero Paracoccidioides têm algumas características que permitem o seu crescimento em condições adversas, que podem contribuir para o desenvolvimento da doença, e têm mecanismos que lhes permitem aderir e invadir os tecidos do hospedeiro. A adesão ocorre através de uma classe específica de proteínas presentes na parede celular, essas proteínas são chamadas adesinas, e são capazes de mediar interações do fungo com os tecidos do hospedeiro durante a infecção. Diferenças na adesão são responsáveis pelo aumento da virulência/patogenicidade de um isolado em relação aos outros. O objetivo deste trabalho foi contribuir para ao maior conhecimento de componentes superficiais de espécies do gênero Paracoccidioides e sua influência na virulência. Para tanto, foram analisados os perfis de adesão e expressão de adesinas, bem como a clonagem e expressão heteróloga da proteína CS (Cell surface protein) que pode estar envolvida na virulência de Paracoccidioides spp e a caracterização e identificação de moléculas por phage display com capacidade de inibir a ligação de Paracoccidioides spp. Assim, ao se avaliar o perfil de adesão das espécies P. brasiliensis e P. lutzii bem como uma análise da expressão de genes codificantes de adesinas previamente caracterizadaspor PCR em Tempo Real, verificou-se alta heterogeneidade de comportamento nas diferentes espécies em relação à adesão, mostrando ainda ... / Abstract: The Paracoccidioides genus consists of dimorphic fungi, etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently, phylogenetic studies divide the Paracoccidioides genus in two species named Paracoccidioides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii. The first is divided in three phylogenetic species, S1, PS2 and PS3 and the second is named Pb01-like. The correct molecular taxonomy of this fungus has opened new possibilities for the study and understanding of their relationships with their hosts. The fungi of the Paracoccidioides genus have some features that allow their growth in adverse conditions provided by the host, which may contribute to disease development and it have mechanisms that enable them to adhere and invade host tissues. Adhesion is provided by a particular class of proteins present in the cell wall called adhesins, capable of mediating interactions with the fungal host tissues during infection. Differences in adhesion are responsible for increased virulence/pathogenicity of an isolate in relation to others. The goal of this study was to contribute to a better knowledge of the superficial components of the species of Paracoccidioides genus e its influence in the fungi virulence. For this, we analyzed the adhesion profile and the adhesins expression during the interaction of the fungi with the host, cloned and expressed the CS protein, in a heterologous system, which may be involved in virulence of Paracoccidioides spp. as well as characterize and identify molecules capable of inhibit the adhesion of Paracoccidioides spp. using a Phage Display system. So, when we evaluated the adhesion profile of the species P. brasiliensis and P. lutzii, as well as the analysis of the expression of genes coding adhesins by Real Time PCR, it has been founded a high heterogeneity of behavior in the different species, showing that the adhesins 14-3-3 and enolase are the most used ones adhesins by the pathogen, independent of the strain ... / Doutor

Orientadora: Debora de Barros Barbosa / Coorientador: Douglas Roberto Monteiro / Banca: Alessandra Marçal Agostinho / Banca: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da molécula de quorum sensing farnesol na formação de biofilmes simples e misto de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175. Inicialmente o farnesol foi diluído em metanol e posteriormente em saliva artificial (SA). Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) do farnesol contra as células de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175 em suspensão foram baseados no método da microdiluição. O farnesol diluído nas concentrações de 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 70, 150 e 300 mM foi aplicado sobre os biofilmes de Candida albicans e Streptococcus mutans (formação) e após 48 horas de contato sua atividade antibiofilme foi determinada por meio da quantificação da biomassa total (coloração com violeta cristal (CV)), enumeração das unidades formadoras de colônias (UFCs) e atividade metabólica (XTT). Foi ainda realizada uma curva de tempo de morte celular para os dois microrganismos estudados. Após o tratamento com o farnesol, a matriz dos biofilmes foi extraída e analisada em termos de concentração de proteínas e carboidratos, além do teste de pH para S. mutans e verificação das atividades enzimáticas de proteinase, fosfolipase e hemolítica para Candida albicans, ainda a estrutura dos biofilmes foi analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura. Os resultados de CIM foram de 150 mM para C. albicans e de 6.25 mM para S. mutans. O farnesol diminuiu a formação de biofilmes simples e mistos, com reduções significativas de 37-90% e 64-96%, respectivamente para a biomassa total e atividade metabólica. Para os biofilmes simples, concentrações de farnesol iguais ou maiores que 3,125 mM promoveram reduções significativas (1,3-4,2 log10; p < 0,05) nas UFCs, enquanto que para os biofilmes mistos reduções... / Abstract: The aim of this study was to evaluate the activity of a quorum sensing molecule, farnesol, in biofilm formation of Candida albicans ATCC 10231 and Streptococcus mutans ATCC 25175. Initially farnesol was diluted in methanol and then in artificial saliva (AS). Minimum inhibitory concentration tests (MIC) of farnesol against Candida albicans ATCC 10231 cells and Streptococcus mutans ATCC 25175 suspension were based on the microdilution method. Farnesol was prepared at concentrations of 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 70, 150 and 300 mM, and placed in contact with biofilms in formation of Candida albicans and Streptococcus mutans for 48 hours. Its antibiofilm activity was determined by quantifying the total biomass (stained with crystal violet (CV)), enumeration of colony forming units (CFUs) and metabolic activity (XTT). It was further carried out a cell death time curve for both microorganisms studied. After the treatment with farnesol, the matrix of the biofilm was extracted and analyzed in terms of protein and carbohydrates, in addition to the pH test for S. mutans and examination of enzymatic activities of proteinase, fosfolipase and hemolytic for Candida albicans. The structure of biofilms was analyzed by scanning electron microscopy. The MIC values were 150 mM for C. albicans and 6.25 mM for S. mutans. Farnesol decreased the formation of single and mixed biofilms, with significant reductions of 37-90% and 64-96% respectively for the total biomass and metabolic activity. For single biofilms, farnesol concentrations equal to or higher than 3.125 mM promoted significant reductions (1,3-4,2log10; p <0.05) in the CFU for single biofilms, while in mixed biofilms the reductions (0,67-5,32log10; p <0.05) were noted at concentrations of 1.56 mM. For cell death curve after an hour in contact with those microorganisms, farnesol reduced 1 log10... / Mestre

Orientador: Josias Rodrigues / Banca: Silvio Luís de Oliveira / Banca: Rogéria Keller / Resumo: A Doença de Crohn (DC) é uma variante das doenças inflamatórias intestinais que não tem uma causa definida, porém há o envolvimento de fatores ambientais e genéticos, entre eles a microbiota. Portadores da DC apresentam desequilíbrio na composição de espécies da microbiota intestinal, incluindo o aumento da Escherichia coli. A E. coli é uma bactéria versátil em sua relação com o hospedeiro, isto é, inclui cepas comensais e várias categorias patogênicas. Estas compreendem dois grupos: linhagens causadoras de infecções intestinais e linhagens causadoras de infecção extraintestinais. As E. coli isoladas de portadores da DC em geral pertencem ao segundo grupo, e uma das principais características apresentadas por estas bactérias é a interação com células epiteliais (aderência e invasão). Estudos feitos na década de 90 levaram a identificação de um novo patótipo de E. coli, capaz de aderir e invadir células epiteliais e ainda invadir e se replicar dentro de macrófagos, produzindo granulomas, característica histopatológica da DC. Este novo patótipo, chamado de Adherent and Invasive E. coli (AIEC), têm sido usada como referência na caracterização de E. coli isoladas a partir de portadores da DC. Neste trabalho, foi feito o estudo de caracterização fenotípica e genética de E. coli isoladas a partir de 9 portadores da DC e 5 pacientes controles, as quais foram submetidas a testes de adesão e invasão celular em células epiteliais, teste de formação de biofilme e identificação de filogrupos da coleção de referência de E. coli (EcoR). Dentre o conjunto de amostras bacterianas estudado, foi encontrada uma amostra isolada de uma paciente com DC que apresentou invasibilidade superior às demais, e foi intensivamente estudada, tendo-se verificado que ela apresenta um perfil de virulência distinto de AIEC. O genoma da amostra em questão foi sequenciado e anotado. Os resultados da caracterização... / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Raquel Cordeiro Theodoro / Banca: Julhiany de Fatima da Silva / Banca: Gilda Maria Barbaro Del Negro / Resumo: A paracoccidioidomicose, uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, é causada pelas espécies crípticas Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii. Ainda não é claro como o processo de especiação dentro do gênero Paracoccidioides influi em aspectos como virulência e patogenia da doença. O objetivo deste trabalho é caracterizar algumas dessas diferenças entre as duas espécies crípticas, utilizando-se de modelo experimental alternativo, as larvas da traça de cera Galleria mellonella. Este modelo tem sido utilizado em estudos envolvendo outros patógenos, porém ainda é pouco explorado em Paracoccidioides spp. No presente estudo, G. mellonella refletiu diferenças entre a virulência de cargas fúngicas distintas, bem como dentre isolados variados e destes com os grupos controle. Além disso, foi possível a recuperação do patógeno a partir de larvas experimentalmente infectadas. Isolados P. lutzii apresentaram níveis de virulência variáveis, sendo pertencentes a esta espécie os isolados com maior e menor virulência observadas neste estudo (8334 e Pb01, respectivamente). Já os isolados pertencentes a espécie P. brasiliensis (Pb339, Pb192 e T15LN1) apresentaram taxas de mortalidade mais homogêneas e intermediárias. Tais resultados credenciam as larvas de G. mellonella como modelo de experimentação adequado para o estudo do processo de virulência em Paracoccidioides spp. Ainda, foi realizado knockdown do gene codificador da gp43 (PbGP43), o antígeno imunodominante em P. brasiliensis e do seu homólogo em P. lutzii (PlP43) utilizando-se a estratégia de RNA antisense combinada com transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Foram obtidos três transformantes P. brasiliensis com expressão de PbGP43 de cerca de 8%, 14% e 36% quando comparados com a expressão do isolado selvagem original Pb192. Além disso foram obtidos dois transformante P. lutzii com expressão de PlP43 por volta de 23% e... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM), an important systemic mycosis in Latin America, is caused by the cryptic species Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii. How these species differ in their virulence factors is still unknown and needs to be properly evaluated. While the role of PbGP43, which codes gp43, as a virulence factor is relatively well established for P. brasiliensis, the same is not true for its ortholog in P. lutzii, namely PlP43. PbGP43 and PlP43 present differences in their nucleotide sequences, expression levels, epitope occurrence and influences on PCM diagnosis. Herein, we obtained PbGP43 and PlP43 knockdown strains by antisense RNA technology combined with ATMT, in order to comparatively evaluate their effects on virulence, employing the alternative experimental host Galleria mellonella larvae. Our results suggest that p43 is important in the P. lutzii infectious process, as previously demonstrated by gp43 in P. brasiliensis. We confirmed G. mellonella as a useful model for studying P. brasiliensis and P. lutzii virulence, since it reflects variation between inoculum size and different strains, as well as between wild-type and respective knockdown transformant strains. Virulence levels may vary among isolates of the same species, probably reflecting that the physiological condition is more important than the species effect. Re-isolation of Paracoccidioides from experimentally infected G. mellonella larvae is possible and might be useful for epigenetic studies related to infection / Doutor