Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-10-20T12:53:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ANÁLISE FENOTÍPICA E GENÉTICA DE FATORES VIRULÊNCIA DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa MULTIDROGA-SENSÍVEL E MULTIDROGA-RESISTENTE.pdf: 1188065 bytes, checksum: 3d201d9ccfc4ba0e5a0ef45cce7f7056 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T12:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ANÁLISE FENOTÍPICA E GENÉTICA DE FATORES VIRULÊNCIA DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa MULTIDROGA-SENSÍVEL E MULTIDROGA-RESISTENTE.pdf: 1188065 bytes, checksum: 3d201d9ccfc4ba0e5a0ef45cce7f7056 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / CNPq / Pseudomonas aeruginosa é um patógeno humano oportunista responsável por causar uma enorme variedade de infecções agudas e crônicas com níveis significativos de morbidade e mortalidade. A sua plasticidade genética e metabólica possibilitou o desenvolvimento de isolados multidroga-resistentes (MDR) e a capacidade de expressar de inúmeros fatores de virulência. Este trabalho teve como objetivo correlacionar o padrão de susceptibilidade antimicrobiana, a produção de fatores de virulência através de técnicas fenotípicas (protease alcalina, hemolisina, fosfolipase C, lipase e pigmentos) e genéticas (genes aprA, lasA, lasB, plcH e toxA) e a variabilidade genética de 30 isolados clínicos de P. aeruginosa isoladas de diferentes sítios de infecção, sendo 15 isolados multidroga-sensível (MDS) e 15 MDR. Nossos resultados revelaram que 50% dos isolados foram resistentes a ceftazidima, sendo as cefalosporinas a classe antimicrobiana com mais isolados resistentes, principalmente entre isolados MDR onde todos foram resistentes. Entre os isolados MDS, todos foram sensíveis a carbapenêmicos e quinolonas. A grande diversidade apresentada no perfil de susceptibilidade às classes de antimicrobianos sugere a existência de associação de diversos mecanismos de resistência. Entre os isolados 53% foram amostras de secreção traqueal, entre estes todos os isolados sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Em relação aos fatores de virulência os isolados MDR apresentaram menor produção de piocianina e lipase, e menor detecção dos genes toxA e lasA, enquanto os MDS, apresentaram menor produção de hemolisina e fosfolipase C. Não houve diferença entre os grupos para produção de protease alcalina e o gene aprA. Todos isolados apresentaram produção de piocianina e os genes lasB e plcH. Em relação ao perfil genético, foi encontrada uma grande diversidade, em um total de 30 isolados foi possível observar 28 perfis genéticos. A presença dos clones ocorreu entre os isolados MDR. Embora alguns estudos relatem que o acréscimo de mecanismos de resistência leva a diminuição dos fatores de virulência, sugerindo assim que, as cepas de P. aeruginosa MDR têm a virulência diminuída quando comparada com cepas MDS, neste trabalho dos resultados obtidos não constatamos esta tendência para produção de protease alcalina, hemolisina, fosfolipase C e para a detecção do gene aprA, sugerindo que esta correlação seja multifatorial. Contudo, a ocorrência destes fatores de virulência em quase todos os isolados estudados sugere um elevado nível de patogenicidade dos mesmos. Concluímos portanto, que P. aeruginosa é um patógeno capaz de acumular inúmeros fatores de virulência e frequentemente associado à multirresistência, o que dificulta o tratamento de infecções causadas por esta bactéria. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen responsible for causing a wide variety of acute and chronic infections with significant levels of morbidity and mortality. Its genetic and metabolic plasticity enabled the development of multidrug-resistant (MDR) strains and the ability to express countless virulence factors. This paper aimed to correlate the pattern of antimicrobial susceptibility, the production of virulence factors through phenotyping techniques (alkaline protease, hemolysin, phospholipase C, lipase and pigments) and genetic (gene aprA, lasB, lasB, plcH e toxA) and the genetic variability of 30 clinical isolates of P. aeruginosa isolated from different sites of infection, 15 isolates multidrug-sensitive (MDS) and 15 MDR. Our results showed reveal that 50% of the isolates were resistant to ceftazidime, cephalosporin was the antimicrobial class with more resistant isolates, especially isolates MDR that were totally resistant to them. Among the isolated MDS, all were sensitive to carbapenems and quinolones. The large diversity presented in the susceptibility profile to antimicrobial classes suggests the existence of an association of several resistance mechanisms. Among the isolated 53% came from tracheal secretions, among them all isolates susceptible to all antimicrobials tested. Regarding virulence factors MDR isolates presented lower production pyocyanin and lipase, and lower detection toxA e lasA genes, since the MDS, showed lower production of hemolysin and phospholipase C. There was no difference between groups for the production of alkaline protease and aprA gene. All isolates presented pyocyanin production and lasB and plcH genes. In relation to genetic profile, it was verified a large diversity, in a totality of 30 isolates was observed 28 genetic profiles. The presence of clones occurred among the MDR isolates. Even though some studies to report that the increase of resistance mechanisms leads to the reduction of virulence factors, suggesting that the strains of P. aeruginosa MDR have decreased virulence strains compared with MDS, this work the results obtained we have not found this tendency to alkaline protease production, hemolysin, phospholipase C and for detecting aprA gene, suggesting that this correlation is multifactorial. However, the occurrence of these virulence factor in almost all isolates studied suggests a high level of pathogenicity the same. Therefore, it can be concluded that, P. aeruginosa is a pathogen with ability to accumulate several virulence factors and often associated to multiresistant complicating the treatment of infections caused by this bacterium.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-24T13:59:01Z No. of bitstreams: 1 Marilia Wortmann Marques.pdf: 1506911 bytes, checksum: 4d0a22b2b791255d8d7c2170ea10a2e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T13:59:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marilia Wortmann Marques.pdf: 1506911 bytes, checksum: 4d0a22b2b791255d8d7c2170ea10a2e9 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Dieback and stem-end rot are diseases caused by species of Botryosphaeriaceae have been associated with serious yield losses to mango culture in northeastern Brazil and worldwide. Considering the increasing importance of these diseases and recent discovery of several species of Botryosphaeriaceae, the objective of this study was (i) to identify species of Botryosphaeriaceae associated with dieback and stem-end rot of mango in the semi-arid region of northeastern Brazil and (ii) compare the species in relation to mycelial growth, pathogenicity and virulence. A total of 235 isolates of Botryosphaeriaceae were identified using morphological and DNA sequence data (ITS and EF1-α). The following species were found: Botryosphaeria dothidea, B. mamane, Lasiodiplodia crassispora, L. egyptiacae, L. hormozganensis, L. iraniensis, L. pseudotheobromae, Lasiodiplodia sp., L. theobromae, Fusicoccum fabicercianum, Neofusicoccum parvum, Neofusicoccum sp., Neoscytalidium dimidiatum e Pseudofusicoccum stromaticum. Only B. dothidea, L. theobromae, N. parvum and P. stromaticum had been previously reported, while the other species represent the first report associated with the mango diseases in this country. L. theobromae, B. dothidea and P. stromaticum were the most frequently isolated species. There were significant differences in mycelial growth rates among the Botryosphaeriaceae species and also in the optimum temperature for growth. The optimum temperature and mycelial growth rates for species Lasiodiplodia vary from 28.2 to 31.1 ºC and from 36.4 a 49.1 mm/day, respectively. While in the other species, the variation was from 25.4 to 30.8 ºC and 19.7 to 41.2 mm/day. All species were pathogenic in mango fruit. There were significant differences in virulence among the species. L. hormozganensis and Lasiodiplodia sp. were the most virulent. For the other species within the Botryosphaeriaceae family, N. dimidiatum and N. parvum were the most virulent species, B. mamane, L. crassispora e L. viticola are reported for the first time associated with mango diseases worldwide. / A morte descendente e a podridão peduncular são doenças causadas por espécies de Botryosphaeriaceae e vêm causando sérios prejuízos à cultura da mangueira no Nordeste do Brasil e do mundo. Tendo em vista a importância crescente dessas doenças e as descobertas recentes de novas espécies de Botryosphaeriaceae, o presente trabalho teve como objetivos: (i) identificar espécies de Botryosphaeriaceae associadas à morte descendente e podridão peduncular na cultura da mangueira no Nordeste do Brasil e (ii) comparar as espécies em relação ao crescimento micelial, patogenicidade e virulência. Um total de 235 isolados de Botryosphaeriaceae foram identificados a partir de características morfológicas e dados de sequências de DNA (ITS, BT e EF1-α), sendo encontradas as seguintes espécies: Botryosphaeria dothidea, B. mamane, Lasiodiplodia crassispora, L. egyptiacae, L. hormozganensis, L. iraniensis, L. pseudotheobromae, Lasiodiplodia sp., L. theobromae, Fusicoccum fabicercianum, Neofusicoccum parvum, Neofusicoccum sp., Neoscytalidium dimidiatum e Pseudofusicoccum stromaticum. Somente L. theobromae, N. parvum, B. dothidea e P. stromaticum tinham sido relatadas em mangueira no Brasil, enquanto as outras espécies representam o primeiro relato associadas à esta cultura no país. L. theobromae, B. dothidea e P. stromaticum foram as espécies prevalentes. Houve diferenças significativas na taxa de crescimento micelial entre as espécies de Botryosphaeriaceae e também em relação à temperatura ótima para o crescimento. A temperatura ótima e a taxa de crescimento micelial para as espécies de Lasiodiplodia variaram de 28,2 a 31,1 ºC e de 36,4 a 49,1 mm/dia, respectivamente. Nas demais espécies, a variação foi de 25,4 a 30,8 ºC e de 19,7 a 41,2 mm/dia. Todas as espécies foram patogências em manga. Houve diferenças significativas na virulência entre as espécies. Em relação às espécies de Lasiodiplodia, L. hormozganensis e Lasiodiplodia sp. foram as mais virulentas. Nas demais espécies dentro da família Botryosphaeriaceae, N. dimidiatum e N. parvum foram as espécies mais virulentas. B. mamane e L. crassispora representam o primeiro relato dessas espécies na cultura da mangueira no mundo.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-12T14:14:59Z No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1493945 bytes, checksum: 8bcc1ab9e28f749b73d9d7ff2cbaa285 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T14:16:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1493945 bytes, checksum: 8bcc1ab9e28f749b73d9d7ff2cbaa285 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Glanders is a highly contagious disease caused by Burkholderia mallei solipeds, a Gram - negative bacterium, not motility and aerobic coccobacillus, primarily infecting horses, donkeys and mules, though humans are considered accidental hosts . The Burkholderia mallei is listed in the list of the World Organisation for Animal Health (OIE) as an important public health disease, and due to its high potential for infection is referred to as a bioterrorism agent. According to the OIE comprises the serological diagnosis, allergy testing and bacterial isolation, and complement fixation, the official test to be performed for trade of animals. This method of diagnosis is recommended in Brazil by Instruction Nº 22, 16 of march of 2018, Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply by its high sensitivity and specificity. According to the OIE comprises the serological diagnosis, allergy testing and bacterial isolation, and complement fixation, the official test to be performed for trade of animals and bacterial isolation is considered gold test for identification of the agent. From the bacterial isolation the presence of Burkholderia was identified in 11 samples from epidemiological surveillance in the disease outbreaks. Sequencing demonstrated the circulation of the strains Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei in Brazilian territory where Mormo is present. The results show the differentiation of the circulating strains in the national territory and provides the knowledge of their epidemiology and virulence, later assisting in formulations of disease control and eradication measures / O Mormo constitui-se em uma doença altamente contagiosa dos solípedes causada pela Burkholderia mallei, uma bactéria Gram-negativa, não móvel e cocobacilo aeróbio, infectando primariamente equínos, asininos e muares, entretanto humanos são considerados hospedeiros acidentais. Burkholderia mallei está relacionada na lista de doenças da Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE) como doença de importância de saúde pública, e devido ao seu alto potencial de infecção é referenciada como agente de bioterrorismo. De acordo com a OIE o diagnóstico compreende o teste sorológico, alérgico, isolamento bacteriano e testes de biologia molecular, sendo a fixação do complemento, o teste oficial a ser realizado para trânsito de animais. O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, através da Portaria Nº 22, de 16 de março de 2018 do Ministério, utiliza o teste da Fixação do Complemento e Elisa para triagem dos animais, sendo aqueles reagentes, testados posteriormente com o Western Blotting para confirmação. Neste trabalho, temos como objetivo identificar filogeneticamente as cepas circulantes em território nacional para os animais suspeitos de Mormo. A partir do isolamento bacteriano foram identificados 08 resultados compatíveis com a Burkholderia em amostras oriundas de vigilância epidemiológica em áreas focos da doença. O sequenciamento demonstrou a circulação das cepas Burkholderia pseudomallei e Burkholdeia mallei, em território brasileiro onde há presença do Mormo. Os resultados mostram a diferenciação das estirpes circulantes em território nacional e proporciona o conhecimento de sua epidemiologia e virulência, auxiliando posteriormente em formulações de medidas para controle e erradicação da enfermidade.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3017_1.pdf: 1400724 bytes, checksum: e24c6a4e74eacdf1fc7cfe359d6e167d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A incidência de lesões superficiais em HIV/AIDS é freqüente sendo caracterizada por depressão celular facilitando o aumento da susceptibilidade por fungos. A patogenicidade destes parece estar relacionada ao crescimento a 37ºC e produção de enzimas. O insucesso terapêutico e complicações clínicas requerem testes antifúngicos. Os objetivos deste estudo foram diagnosticar infecções fúngicas superficiais em HIV/AIDS e caracterizar os agentes quanto à patogenicidade e susceptibilidade antifúngica. As amostras foram clarificadas com KOH e inoculadas em ágar Sabouraud com cloranfenicol, incubadas a 30ºC e 37ºC por 15 dias. As enzimas foram testadas usando caseína do leite (protease), lecitina de soja (fosfolipase) como substratos. O antifungigrama seguiu o CLSI, sendo testados 45 isolados de Candida frente anfotericina B, fluconazol (controle), própolis e lectinas. Em 117 amostras clínicas foram observadas estruturas fúngicas e isoladas Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. famata, C. glabrata, Malassezia furfur, M. sympodialis, Trichosporon asahii, Kodamae ohmeri, Brettanomyces anomalus, Microsporum gypseum, Trichophyton menthagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, Aspergillus niger, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani, Phialophora reptans, Scytalidium hialinum, S. japonicum e Penicillium commune. As amostras cresceram a 37ºC e exibiram fosfolipase, entretanto protease foi detectada em 43 isolados. Os intervalos de valores de MIC foram muito amplos e o efeito inibitório da própolis e lectinas sobre o crescimento fúngico foram respectivamente 2-1024Pg/mL e 8- 256Pg/mL. Os resultados da anfotericina B e fluconazol foram 0,06-2 Pg/mL e 0,25-64 Pg/mL, respectivamente

Orientador: Jose Francisco Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-05T03:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_LetiziaMonteiro_D.pdf: 1457309 bytes, checksum: df3cfd98d740cdfc928e9c7b1e4a3c89 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Candida spp. são leveduras oportunistas, que habitam a cavidade bucal de uma proporção significativa da população saudável. Entretanto, sob condições predisponentes, podem provocar candidose bucal. Foram avaliados 53 pacientes com diagnóstico de periodontite, porém saudáveis sistemicamente, com o objetivo de verificar a ocorrência destes microrganismos em 3 sítios distintos: bolsa periodontal, sulco gengival e mucosa bucal. As amostras foram semeadas em meio cromogênico seletivo, e a identificação de C. albicans e C. dubliniensis foi feita por PCR. Vinte e um pacientes (39,6%) foram positivos para Candida spp. Não houve diferença significativa na freqüência de colonização entre os gêneros (teste , p= 0,5922), ou entre os sítios (teste , p= 0,1287). Entretanto, as bolsas periodontais foram mais densamente povoadas (UFC/mL) do que os outros sítios (teste ANOVA, p=0,0319), podendo ser consideradas, assim, um bom reservatório para estas leveduras. C. albicans, foi a espécie prevalente, em relação às demais (teste exato de Fischer; p=0,0088). C. dubliniensis ocorreu em um paciente, nas bolsas periodontais. A diversidade genética de C. albicans e C. dubliniensis foi analisada pelo método de RAPD, utilizando dois primers arbitrários (OPA-03 e AP-03), sendo detectados 16 tipos eletroforéticos distintos entre os 156 isolados de C. albicans e de um tipo eletroforético entre os três isolados de C. dubliniensis. Não houve diferença significativa entre os sítios (teste ANOVA, p=0,6431), nem entre os gêneros (teste t de student, p=0,892), quanto à diversidade genotípica de C. albicans. Todos os isolados apresentaram atividade enzimática de aspartil proteinases (Saps) e de fosfolipases, podendo ser considerados, portanto, potencialmente patogênicos. A propagação sistêmica de linhagens potencialmente patogênicas de C. albicans e C. dubliniensis, assim como de outras espécies do gênero, poderia ser favorecida em determinados grupos populacionais, especialmente quando as bolsas periodontais se apresentassem densamente colonizadas. Estudos longitudinais seriam necessários, para acessar o grau de manutenção dessas linhagens, em diferentes populações, incluindo a avaliação dos fatores de virulência e da susceptibilidade a agentes antifúngicos, bem como verificar a eficácia da terapia periodontal no controle e/ou eliminação dessas espécies da cavidade bucal / Abstract: Candida spp. are opportunistic yeasts that are able to inhabit the oral cavity of a high proportion of the healthy people. However, under predisponent condictions, Candida species are associated many forms of oral candidoses. A total of 53 patients with periodontitis, without systemic disease, were evaluated to verify the occurrence of this microorganism in three different sites: periodontal pocket, gingival sulci and oral mucosa. The samples were plated on chromogenic medium, and C. albicans and C. dubliniensis were identified by PCR Twenty-one volunteers (39.6%) were positive to Candida spp. in one or more sites. No statistical differences were detected between the genders, male or female ( , p= 0.5922), or sites ( , p= 0.1287). Periodontal pockets were more heavily populated (CFU/ml) than other sites (ANOVA, p=0.0319), so may be considered a yeast reservoir. It was found a higher prevalence of C. albicans compared to other species (Fischer test, p=0.0088). C. dubliniensis were recovered from the periodontal pocket from one patient. The genotypic diversity of Candida albicans and C. dubliniensis were analyzed by RAPD, using two arbitrarily primers (OPA-03 and AP-03), and 16 electrophoretic types were detected among 156 isolates of C. albicans and one electrophoretic type among three isolates of C. dubliniensis. There was no statistical difference among the analyzed sites (ANOVA, p=0.6431), neither between of gender (student t test, p=0.892) related with the genotypic diversity of C. albicans. All isolates showed enzymatic activity of aspartil proteinase (Saps) and phospholipase, so may be considered potentially pathogenic. Systemic propagation of commensal C. albicans, C. dublinienesis, and other species, would be favor in some population, especially in heavily populated periodontal pockets with Candida spp. Longitudinal studies must be done to establish the lineage maintenance in a different population and forms of periodontal disease, including the evaluation of virulence factors, antifungal susceptibility, and to assess the efficacy of different periodontal treatment to eliminate this species from the oral cavity / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

A mastite é um sério problema em rebanhos leiteiros com consideráveis conseqüências econômicas. Embora alguns patógenos possam causar essa doença, Staphylococcus aureus é o mais importante agente etiológico em mastites bovinas e ovinas. O surgimento de linhagens resistentes a diferentes antibióticos e a presença de múltiplos fatores de virulência dificultam o tratamento das infecções causadas por essa espécie. Neste estudo, foram analisados 70 isolados de estafilococos coagulase positivos de origem animal: 52 provenientes de amostras de leite de bovinos portadores de mastite subclínica, do óstio dos tetos desses animais e de insufladores de três fazendas de exploração leiteira do Estado de São Paulo. Os outros 18 isolados foram provenientes de ovinos da região do agreste do Estado de PE, sendo 6 de casos de mastite clínica e 12 de casos de mastite subclínica. Por meio da eletroforese de campo pulsado (PFGE), pôde-se concluir que houve alta diversidade genética entre as linhagens de S. aureus isoladas das diferentes fontes analisadas das três fazendas do Estado de SP. No entanto, um perfil clonal comum foi identificado nas amostras de leite de duas dessas fazendas e, em uma terceira fazenda, houve a predominância de outro perfil clonal de S. aureus entre os isolados de leite bovino proveniente de animais portadores de mastite subclínica. Em relação às outras espécies coagulase positivas, todas originadas de óstios bovinos, foi possível determinar os perfis clonais dos isolados S. schleiferi spp coagulans e S. delphini e identificar a ocorrência de dois perfis distintos entre as linhagens de S. intermedius. Os isolados S. aureus provenientes de ovinos mostraram baixa diversidade genética com três perfis clonais comuns aos casos de mastite clínica e subclínica. Observou-se, em relação à combinação dos fatores de virulência de bovinos e ovinos, a ocorrência do gene cflA em 100% das amostras, o que indica o seu envolvimento no processo de colonização da glândula mamária, independente do hospedeiro. Dois clones bovinos destacaram-se por apresentar multiplicidade dos genes codificadores dos fatores de virulência. No entanto, houve pouca ocorrência dos genes relacionados ao processo toxigênico entre os isolados dessa espécie animal, ao contrário das cepas provenientes de ovinos. Em relação ao sistema regulador agr, o grupo II foi associado aos perfis clonais que apresentaram maior combinação dos genes codificadores dos fatores de virulência em isolados S. aureus provenientes de bovinos. Já o grupo III e agr negativos, aos isolados portadores de poucos desses genes. A presença do gene eta, pouco freqüente em linhagens animais, foi associada tanto com cepas bovinas agr negativas como do grupo II. Assim como nos isolados bovinos, o grupo II de agr, em ovinos, também foi relacionado com o perfil que apresentou maior combinação dos fatores de virulência, incluindo a associação dos genes sec e tst, mas também com perfis portadores de poucos genes de adesinas ou de nenhum gene para exotoxinas. O mesmo foi observado para o grupo I em linhagens ovinas. As cepas resistentes à oxacilina (BORSA), provenientes de isolados bovinos e de insufladores, apresentaram concentração inibitória mínima ≥1 - ≤ 16 µg/ml com múltipla resistência a outros antimicrobianos, mas foram negativas para o gene mecA, o que indica que sejam portadoras de outros mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, diferente da produção de PBP2a. / Mastitis is a serious problem in dairy herds with considerable economic consequences. Although some pathogens may cause this disease, Staphylococcus aureus is the most important etiologic agent in bovine and ovine mastitis. The appearance of antibiotic resistant strains and the presence of multiple factors of virulence, make the treatment of the infections caused by these species very difficult. In this study, we analyzed 70 isolates of coagulase positive Staphylococcus sp of animal origin: 52 from milk samples of subclinic mastitis, bovine teats and milking linners collected in three dairy farms from São Paulo State. The other 18 isolates were from the agreste region ovine in the State of Pernanbuco, with 6 strains from cases of clinic mastitis and 12 cases of subclinic mastitis. By pulsed-field electrophoresis (PFGE), we found high genetic diversity among S. aureus strains from different sources analyzed in the three farms from São Paulo State. However, a common S. aureus cloning profile was identified in the milk samples from two farms and, the third farm, presented a predominance of different profile from two previous farms. The six coagulase positive isolates from bovine teats were identified as S. schleiferi spp coagulans (1), S. delphini (1) and S. intermedius (4). This last specie presented two distinct profiles among strains. The ovine S. aureus strains showed a low genetic diversity presenting three common profiles in both clinic and subclinic mastitis. The cflA gene occurred in 100% of the bovine and ovine strains, showing its involvement in the process of colonization of the mammary glands independent of host species. Two bovine clones was notable for presenting multiplicity of virulence factors genes. However, there was a low occurrence of toxin encoding genes among bovine strains, unlike the ovine strains. The group II agr regulatory systems of S. aureus from bovine strains was associated to a wider combination of the virulent factors encoding genes. However, group III and negative agr was associated to few combination genes. Although the gene eta is, in general, less frequent in animal strains, in this study it was associated in both agr negative and group II agr bovine strains. In ovine, agr group II, as in the bovine isolates, it was also related to a wider combination of virulence factors, including the association of sec and tst genes. It was also found a few genes encoding adhesion and exotoxins in this group, occurring the same in agr group I in ovine strains. The borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus (BORSA) strains isolated from bovine ostium, milk and milking apparatus line presented minimum inhibitory concentration ≥1 - ≤ 16 µg/ml with multiple resistance to other antimicrobial, but they were negative to the mecA gene, suggesting they are carrying other resistance mechanisms to beta-lactam antibiotics, different from the production of PBP2a.

O objetivo deste estudo foi o de verificar a ocorrência de quatro genes de virulência em Salmonella Enteritidis de acordo com o fagotipo e ribotipo, assim como a virulência “in vivo”. Os genes estudados foram invA, spvC, sefC e pefA em 120 amostras isoladas de várias fontes, pertencentes a diferentes fagotipos e ribotipos provenientes de sete estados brasileiros. Para a verificação da presença dos genes, as amostras foram examinadas pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) individualmente e em multiplex. A ocorrência para o gene invA foi de 100% nas amostras (120/120), spvC em 94% (113/120), sefC em 97,5% (117/120) e pefA em 97% (116/120) das amostras. Foi possível caracterizar as amostras em cinco diferentes perfis. O primeiro, P1, foi positivo para os genes invA, spvC, sefC e pefA, P2 para invA, spvC e pefA, P3 para invA, sefC e pefA, P4 para invA e sefC e o último P5 para os genes invA e spvC. Para as amostras PT4RT1 obteve-se o perfil P1 em 94% (64/68), P2 em 1,5% (1/68), P3 em 3% (2/68) e P4 em 1,5% das amostras (1/68). Para as amostras PT4RT2, 86% (18/21) pertenceram ao perfil P1, 5% (1/21) ao P3 e 9% (2/21) das amostras ao perfil P4. Nas amostras PT4RT3 80% (4/5) pertenceram ao perfil P1 e 20% (1/5) ao P2. Nas amostras PT4TR9, 91% (10/11) pertenceram ao perfil P1 e 9% (1/11) ao P3. Todas as amostras PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 pertenceram ao perfil P1 e apenas a amostra PT1 apresemtou o perfil P5. A virulência foi avaliada desafiando as aves via oral e subcutânea, através da colonização do ceco e invasão do fígado e baço. O gene spvC está relacionado com a sobrevivência e aumento da média de crescimento da bactéria no fígado e baço, mas neste estudo não demonstrou diferença na porcentagem de aves com reisolamento positivo para a bactéria nestes orgãos. Os genes sefC e pefA foram importantes para promover a colonização cecal, pois somente quando estes dois genes simultaneamente estiveram presentes no perfil, obteve-se o reisolamento cecal quando as aves foram desafiadas oralmente sendo esta via a principal rota de infecção deste patógeno. / This study has the intention of verify the four virulence genes event in Salmonella Enteritidis according with phage type and ribotype and the virulence “in vivo”. The genes studied were invA, spvC, sefC and pefA in 120 Salmonella Enteritidis isolates from different origins, belongs at different ribotypes and phage types of seven Brazilian states. To verify the genes presence the strains were examined by Polimerase Chain Reaction (PCR) technique, singly and multiplex. The event of invA gene was in 100% (120/120) of strains, the spvC gene was in 94% (113/120) of strains, the sefC gene was in 97.5% (117/120) of strains and the pefA gene was in 97% (116/120) of strains. There were discovered five different profiles. The pattern one, P1, was positive for invA, spvC, sefC e pefA. The P2 was positive for invA, spvC and pefA. The P3 was positive for invA, sefC e pefA. The P4 was positive for invA and sefC and the last one, P5, was positive for invA and spvC. For the PT4RT1 strains, the P1 profile was present in 94% (64/68) of strains; P2 profile was in 1.5% (1/68); P3 in 3% (2/68); and P4 in 1.5% (1/68) of strains. For the PT4RT2 strains, the P1 profile was present in 86% (18/21) of strains; P3 profile was in 5% (1/21); and P4 in 9% (2/21) of strains. For the PT4RT3 strains, the P1 profile was present in 80% (4/5) of strains, and P2 in 20% (1/5) of strains. For the PT4RT9 strains, the P1 profile was present in 91% (10/11) of strains, and P3 in 9% (1/11) of strains. The strains: PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 belongs at the P1 profile, and only the PT1 strain belongs at the P5’s profile. The virulence was evaluated challenging the birds orally and subcutaneous, through the colonization of the caecum, liver and spleen invasion. The gene spvC was related with the survivance and the increase of the average grow of the bacteria in the liver and spleen, but this study doesn’t demonstrate the difference in the percentage of positive birds for the bacteria in their organs. The sefC and pefA genes were important to promote the caecum colonization, because only when both genes were present simultaneously in the profile, obtain the caecum isolation when the birds were been by orally challenged this way the main route of the infection of this pathogen.

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:56:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_RebecaPassarelli_M.pdf: 3691454 bytes, checksum: 62da767a8ae513cf2860f407c915aae6 (MD5) Previous issue date: 2018-08-18T22:55:56Z / Resumo: Fibrose cística (FC) é uma doença genética, autossômica recessiva, caracterizada por anormalidade no transporte eletrolítico. Achromobacter xylosoxidans é um bacilo Gram-negativo, não-fermentador e nos últimos anos tem sido encontrado em pacientes com FC, levando à doença pulmonar crônica. Neste estudo foram analisadas 17 amostras de A.xylosoxidans, isoladas de pacientes do Ambulatório de Fibrose Cística do Hospital das Clínicas (HC) da UNICAMP-SP. Os isolados foram analisados quanto as suas propriedades de virulência: atividade hemolítica, presença de hemaglutinação, atividade enzimática (caseinase, esterase, lecitina e hidrolise de elastina), adesão em célula, formação de biofilme e produção de atividade citotóxica. As amostras produziram hemolisinas, hemaglutininas e atividades enzimáticas. Catorze amostras de A.xylosoxidans (78%) formaram biofilme em microplacas, o que sugere o seu potencial em formar biofilme em cateteres e sondas. Entretanto essas bactérias não aderiram em células de pulmão NCI-H292 nas condições utilizadas. Os sobrenadantes de cultura de A.xylosoxindas apresentaram atividade citotóxica termoestável sobre célula NCI-H292, induzindo a formação de vacúolos, perda de contato celular, condensação da cromatina, núcleos picnoticos e morte celular. Foi verificado que a atividade citotóxica foi mantida mesmo após o tratamento dos sobrenadantes com polimixina B, sugerindo não ser uma endotoxina Ensaios de ELISA demonstraram significativa produção de IL-6 e IL-8 pelas células NCI-H292 após 24 horas de incubação com a fração >50kDa do sobrenadante de cultura da bacteria. Os resultados sugerem que o fator citotóxico produzido por A. xylosoxidans apresenta um importante papel na virulência, o qual provavelmente está associado à inflamação pulmonar crônica em pacientes com FC, levando a danos teciduais e declínio da função pulmonar / Abstract: Cystic fibrosis is a genetic disease, autosomal recessive, characterized by abnormal electrolyte transport. Achromobacter xylosoxidans is a Gram-negative non-fermenter and in recent years has been found in CF patients, leading to chronic lung disease. These studies were analyzed 17 samples of A.xylosoxidans isolated from patients in the Cystic Fibrosis Clinic, HC UNICAMP-SP. The isolates were analyzed for their virulence properties, such as haemolytic activity, the presence of hemagglutination, enzyme activity (caseinase, esterase, lecithin and hydrolysis of elastin), cell adhesion, biofilm formation and production of cytotoxic activity. The presence of hemolysins, hemagglutinins and enzymatic activities were not detected. Fourteen samples (78%) of A.xylosoxidans formed biofilms in microplates, suggesting the ability of bacteria to form biofilms on catheters and probes, but there was no adhesion in NCI-H292 cell lung. The culture supernatants of A.xylosoxindas isolated produced a heatstable cytotoxic factor in NCI-H292 cells, inducing the formation of vacuoles, loss of cell contact, chromatin condensation, pyknotic nuclei and cell death. ELISA assays to verify the release of IL-6 and IL-8, showed great production of these proinflammatory cytokines by NCI-H292 cells after 24 hours of incubation with the fraction> 50 kDa of culture supernatant of bacteria. It was also verified that the cytotoxic activity was maintained even after treatment with polymyxin B, suggesting may be not an endotoxin. Therefore, this cytotoxic factor produced by A. xylosoxidans may represent an important virulence factor, which is probably associated with chronic pulmonary inflammation in CF patients, leading to tissue damage and decline in lung function, decreasing the survival of these patients / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-13T18:09:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida [Dissertação, 2016].pdf: 1387702 bytes, checksum: 5161fb19d344833ea4e10e115c322cf4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T18:09:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida [Dissertação, 2016].pdf: 1387702 bytes, checksum: 5161fb19d344833ea4e10e115c322cf4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pseudomonas aeruginosa é um dos principais patógenos causadores de infecções graves em pacientes queimados, estando associado a elevadas taxas de mortalidade e morbidade. A alta plasticidade de seu genoma confere a este microrganismo a capacidade de tornar-se multirresistente a antimicrobianos, dificultando o tratamento devido à redução de opções terapêuticas. Este estudo teve como objetivo analisar 35 cepas de P. aeruginosa isoladas de pacientes queimados e da mesa onde era realizada a balneoterapia em um centro de tratamento de queimados (CTQ), determinando o perfil de resistência aos antimicrobianos, os fatores genéticos relacionados à virulência e resistência antimicrobiana, a capacidade de produzir biofilme e ação de biocidas sobre o mesmo, além de realizar tipificação molecular das cepas envolvidas. A suscetibilidade antimicrobiana foi verificada utilizando o método de disco-difusão, segundo os critérios do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A pesquisa de genes de resistência que codificassem β-lactamases (blaPER-1, blaCTX-M, blaOXA-10, blaGES-1, blaVIM, blaIMP, blaSPM-1, blaKPC, blaNDM e blaSIM) e dos genes de virulência exoS e exoU, foi realizada através da técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). O teste fenotípico Carba NP, foi utilizado com a finalidade de detectar atividade hidrolítica enzimática à carbapenemas. A capacidade de formação de biofilme foi avaliada em placa para microtitulação e em cupom de aço inoxidável, sendo este último utilizado para verificar a eficácia de três agentes biocidas (hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e clorexidina 4%) na remoção dos biofilmes formados. As cepas foram tipificadas através da técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). De acordo com o teste de suscetibilidade antimicrobiana, foi observado um elevado padrão de resistência, com 71,5% (25/35) das cepas sendo resistentes a multidrogas (MDR). O maior percentual de resistência foi para o ciprofloxacino (94,3%; 33/35), seguido da gentamicina (88,6%; 31/35). Também foi observada resistência aos β-lactâmicos, inclusive à carbapenemas (22,9%; 8/35). Com relação aos genes de resistência pesquisados foi encontrado em 34,3% (12/35) das cepas o blaGES-1 e em uma única cepa o blaCTX-M. Nenhum gene codificador de carbapenemases pesquisado foi encontrado. Da mesma forma, nenhuma atividade hidrolítica enzimática ao imipenem foi detectada através do teste Carba NP, sugerindo que outros mecanismos de resistência possam estar envolvidos, como superexpressão de bomba e perda de porina de membrana externa (OprD). O gene de virulência exoS foi o mais prevalente estando presente em 71,4% (25/35) das cepas, enquanto o gene exoU foi detectado em 14,3% (5/35), porém todas as cepas que abrigavam este gene eram carbapenemas resistentes. Onze (31,4%) das 35 cepas, foram formadoras de biofilme utilizando a placa de microtitulação, sendo estas em sua maioria (81,8%) pertencentes ao clone A (obtido através de tipificação por PFGE em estudo prévio), o qual era o mais prevalente infectando/colonizando pacientes e contaminando a mesa de balneoterapia. A remoção do biofilme formado em superfície de cupom de aço inoxidável foi eficaz para os três biocidas testados (hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e clorexidina 4%), não havendo contagem de células viáveis das cepas analisadas após contato com os mesmos. A tipificação por MLST originou dois tipos de sequenciamentos novos, ST2236 e ST2237. Conclui-se com este estudo, que a redução de opções terapêuticas associada à presença de genes de virulência, pode agravar a situação destes pacientes. Assim como a presença de genes como blaGES-1 e blaCTX-M é preocupante, pois podem ser difundidas entre as demais cepas por transmissão horizontal, se não houver um controle adequado. Entretanto, o teste de remoção dos biofilmes mostrou que se a desinfecção for realizada de maneira correta, a contaminação cruzada entre pacientes pode ser evitada. / Pseudomonas aeruginosa is major causative pathogens of serious infections in burn patients and is associated with high mortality and morbidity rates. The high plasticity of its genome confers to this organism the ability to become multiresistant to antibiotics, difficulting the threathment due to reduced therapeutic options. This study aimed to analyze 35 strains of P. aeruginosa isolated from burn patients and the tank where balneotherapy was held in a burn treatment center (BTC), determining the resistance profile to antimicrobial agents, genetic factors related to virulence and antimicrobial resistance, the ability to produce biofilms and biocide action thereon and perform molecular typing of the strains involved. Antimicrobial susceptibility was assessed using the disk diffusion method, according to the criteria of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The research for resistance genes encoding β-lactamases (blaPER-1, blaCTX-M, blaOXA-10, blaGES-1, blaVIM, blaIMP, blaSPM-1, blaKPC, blaNDM and blaSIM) and the virulence genes exoS and exoU was performed using the Polymerase Chain Reaction (PCR). The phenotypic test Carba NP, was used in order to detect enzymatic hydrolytic activity to carbapenems. Biofilm formation ability was evaluated through plate for microtitration and stainless steel coupon, the latter being used to verify the efficacy of three biocides (sodium hypochlorite 1%, hydrogen peroxide 5% and chlorhexidine 4%) to remove formed biofilms. The strains were typed by Multilocus Sequence Typing technique (MLST). According to the antimicrobial susceptibility test, a high resistance pattern was observed in which 71.5% (25/35) of strains were multidrug resistant (MDR). The highest percentage of resistance was to ciprofloxacin (94.3%; 33/35), followed by gentamicin (88.6%; 31/35). It was also observed resistance to β-lactams antibiotics, including the carbapenems (22.9%; 8/35). Regarding the resistance genes investigated were found the blaGES-1 in 34,3% (12/35) of the strains and the blaCTX-M in a single strain. None of the searched genes encoding carbapenemases was found. Similarly, no enzymatic hydrolytic activity to imipenem was detected by Carba NP test, suggesting that other resistance mechanisms may be involved, such as pump over expression and loss of outer membrane porin (OprD). The exoS virulence gen was the most prevalent being present in 71.4% (25/35) of the strains, while exoU was detected in 14.3% (5/35), however all strains that harbored this gene were carbapenems resistant. Eleven (31.4%) of 35 isolates were biofilm formers using the plate for microtitration, which mostly (81.8%) belonging to clone A (obtained in a previous study by PFGE) that was the most prevalent infecting/ colonizing patients and contaminating balneotherapy tank. Removal of biofilm formed in stainless steel coupon surface was effective for all three biocides tested (sodium hypochlorite 1%, hydrogen peroxide 5% and chlorhexidine 4%), with no viable cell count after contact with biocides solutions. The MLST originated two new sequencing types, ST2236 and ST2237. It is concluded from this study that the reduction of therapeutic options associated with the presence of virulence genes, can aggravate the situation of these patients. As well as the presence of genes as blaGES-1 and blaCTX-M is worrying as they may be spread among the other strains by horizontal transmission, if there is no adequate control. However, the removal test of biofilms showed that, if the disinfection is carried out in a correct way, cross-contamination between patients can be avoided.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_gustavo_cerqueira.pdf: 9683705 bytes, checksum: a1d0f93c3566774a1f0e953cc32fb912 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / In this study, Himar1 was used to obtain a total of 929 transposon mutants, of which, 721 correspond to coding sequences (CDS) disrupted by the transposon in 551 different genes. Some mutants were evaluated regarding the effect of gene disruption to virulence in the hamster model, and two attenuated mutants containing the transposon into hypothetical genes were identified. Another study aimed to develop a new genetic tool to help in the study of specific genes. Thus, an inducible expression system for L. biflexa was developed. Such inducible expression system employed as reporter genes the green fluorescence protein (gfp) and the gene encoding for the flagelin B protein (flaB). Fluorescent L. biflexa (GFP) and motile leptospires (FlaB) were observed after induction by IPTG. Finally, another study was conducted to determine, by PCR amplification, the presence of the lig genes in different pathogenic species. ligB appeared to be ubiquitously distributed, while ligA and ligC were detected only in a reduced number of serovars. In addition, a 214 bp specific ligB fragment was used to constitute a new method for pathogenic Leptospira species classification. / Neste estudo, o Himar1 foi utilizado para a obtenção de um total de 929 mutantes, dos quais, 721 correspondem a seqüências codificadoras (CDS) interrompidas pelo transposon, cobrindo 551 genes diferentes. Alguns mutantes foram avaliados com relação aos efeitos da interrupção gênica sobre a virulência em modelo animal, e dois mutantes atenuados contendo o transposon em genes hipotéticos foram identificados. Outro estudo realizado buscou desenvolver uma nova ferramenta genética para auxiliar no estudo da função de genes específicos. Assim, foi desenvolvido um sistema de expressão induzível para L. biflexa. Este sistema de expressão empregou como repórter o gene da proteína verde fluorescente (gfp) e o gene da proteína flagelina B (flaB). L. biflexa fluorescente foi observada, assim como leptospiras que voltaram a ter mobilidade após a adição do agente indutor (IPTG). Finalmente, foi conduzido um estudo para a determinação da presença dos genes da família lig nas diversas espécies de leptospiras patogênicas, através da técnica de PCR. O gene ligB apareceu amplamente distribuído, enquanto que ligA e ligC foram detectados apenas em um reduzido número de sorovares. Além disso, a sequência de um fragmento específico de 214 pb do gene ligB pode ser usada para a constituição de um novo método para a classificação das espécies patogênicas de Leptospira