Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

A doença decorrente da infecção por Salmonella é um dos maiores problemas de saúde no mundo em termos de morbidade e mortalidade. Entre as sorovariedades de Salmonella, a sorovariedade Enteritidis é a de maior ocorrência mundial e compreende linhagens que tem seu nicho biológico relacionado a frangos e ovos. Várias metodologias de tipagem fenotípicas e genotípicas foram desenvolvidas a fim de se delinear a epidemiologia das infecções por S. Enteritidis. Entretanto a tipagem fenotípica usualmente falha em discriminar linhagens relacionadas das nãorelacionadas epidemiologicamente e apresenta problemas de reprodutibilidade que foram minimizados com a utilização de métodos genotípicos. No Brasil, poucos estudos que utilizaram técnicas moleculares na tipagem de linhagens dessa sorovariedade foram realizados. Os objetivos desse estudo foram investigar o potencial patogênico, a resistência a antimicrobianos e realizar a tipagem molecular de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, de alimentos e de frangos no Brasil. Para isso foram estudadas 188 linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de surtos e de casos esporádicos, de humanos (67) de alimentos (61) e de frangos (60), durante o período de 1986 a 2010, de vários locais do Brasil. A susceptibilidade frente a 14 antimicrobianos foi analisada através da técnica de disco difusão e a presença de 13 genes de virulência das ilhas de patogenicidade de Salmonella I e II e do plasmídio pSEV foram pesquisados por PCR. Os mecanismos de resistência a quinolonas foram verificados através da pesquisa de genes de resistência plasmidiais e cromossomais e também através da verificação de mutações no gene gyrA por High resolution melting analysis (HRMA) seguida de sequenciamento de algumas linhagens. As linhagens também foram tipadas molecularmente pelas metodologias Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) com a enzima XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) e por Multilocus sequence typing (MLST). Das 188 linhagens estudadas, 42,5% foi resistente ao ácido nalidíxico e somente 0,5% foi resistente a sulfametoxazol-trimetoprima e estreptomicina. A resistência a quinolonas foi relacionada principalmente a mutações no gene gyrA. A maioria das linhagens estudadas (98,4%) apresentou todos os genes de virulência pesquisados, sendo uma linhagem negativa para o gene sipA e duas linhagens negativas para o gene prot6E. ERIC-PCR dividiu as 128 linhagens isoladas de humanos e alimentos em 55 perfis diferentes com similaridade >79,7%. PFGE dividiu essas mesmas linhagens em 68 perfis diferentes com uma similaridade >73,1%. Para as linhagens isoladas de frango, o dendrograma concatenado de ERIC-PCR e PFGE dividiu as 60 linhagens em dois grandes grupos com 73,3% de similaridade. O grupo A consistiu de linhagens isoladas tanto de material clínico de frangos (23) quanto do ambiente da granja (5) com 81,2% de similaridade. O grupo B também consistiu de linhagens isoladas tanto de casos clínicos de frangos (21) quanto do ambiente da granja (11) com 81,1% de similaridade. MLVA dividiu as 188 linhagens isoladas no Brasil e outras 100 linhagens isoladas na América do Norte em dois grandes grupos. O grupo MLVA-A apresentou 71 linhagens isoladas na América do Norte e somente três linhagens isoladas no Brasil. Essas linhagens do ii Brasil incluíram as isoladas antes do início da pandemia de S. Enteritidis se iniciar no país. Em contraste, o grupo MLVA-B agrupou 185 linhagens isoladas no Brasil e 29 linhagens isoladas na América do Norte. As linhagens presentes no grupo A, foram divididas em 34 tipos genéticos diferentes com similaridade maior do que 46%, enquanto no grupo B as linhagens se diferenciaram em 15 tipos genéticos diferentes com mais de 66% de similaridade. MLST caracterizou 44 das 46 linhagens estudadas como pertencentes ao ST 11. As outras duas linhagens apresentaram alelos que não existiam no banco de dados e caracterizaram dois novos STs, o 1632 e o 1633. Os resultados de tipagem molecular obtidos por ERICPCR, PFGE e MLVA no presente estudo, demonstraram uma alta similaridade genotípica entre linhagens de S. Enteritidis isoladas no Brasil, o que sugere que as linhagens estudadas descendem de um precursor comum que pouco se diferenciou genotipicamente ao longo de 24 anos no país. Ademais, os resultados de MLVA sugerem que um novo e prevalente subtipo foi introduzido no Brasil após 1993 e tem contaminado alimentos e infectado humanos e animais. O grande número de genes de virulência encontrados reforça o potencial das mesmas causarem doenças em humanos e animais, bem como, os riscos de sua presença em alimentos. Ademais, a grande porcentagem de linhagens resistentes ao ácido nalidíxico observadas a partir de 1996 sugere o uso de quinolonas no tratamento de infecções em animais causadas por S. Enteritidis no Brasil. / The disease caused of the infection by Salmonella is one of the major health problem worldwide in terms of morbid and mortality. Among the Salmonella serovars, the Enteritidis is the most frequent isolated one and comprises strains that have their biological niche related to chickens and eggs. Several phenotypic and genotypic methodologies were developed to trace epidemiologically the infections by S. Enteritidis. However, the phenotypic typing usually fail to discriminate related from unrelated epidemiologicaly strains and presents problems of reproducibility that were minimized with the introduction of genotypic methods. In Brazil, few studies that used molecular typing techniques to type strains of this serovar were conducted. The aims of this study were to investigate the pathogenic potential, the antimicrobial resistance and to molecularly type of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil. For this, it was studied 188 strains of Salmonella Enteritidis isolated from outbreaks and sporadic cases, from humans (67), food (61) and chickens (60), during the period of 1986 to 2010, from various places of Brazil. The susceptibility to 14 antimicrobials were analyzed by the disc diffusion technique and the presence of 13 virulence genes of the Salmonella pathogenicity islands I and II and from the pSEV plasmid were searched by PCR. The mechanisms of resistance to quinolones were verified by the search of plasmidial and cromossomal resistance genes and also by the verification of mutations in the gyrA gene by High resolution melting analysis (HRMA) followed by sequencing of some strains. The strains were also molecularly typed by the methodologies Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the enzyme XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and by Multilocus sequence typing (MLST). From the 188 strains studied, 42.5% were resistant to nalidixic acid and only 0.5% were resistant to sulfamethoxazoletrimethoprim and streptomycin. Resistance to quinolones was related mainly to mutations in the gyrA gene. The majority of the strains studied (98.4%) harbored all the virulence genes searched, being only one strain negative for the sipA gene and two strains negative for the prot6E gene. ERIC-PCR divided the 128 strains isolated from humans and food in 55 different profiles with >79.7% of similarity. PFGE divided the same strains in 68 different profiles with a similarity of >73.1%. Regarding the strains isolated from chickens, the concatenated dendrogram of ERIC-PCR and PFGE divided the 60 strains in two major groups with a similarity of 73.3%. Group A consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (23) or from the farm environment (5) with a similarity of 81.2%. Group B also consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (21) or from the environment (11) with a similarity of 81.1%. MLVA divided the 188 strains isolated in Brazil and other 100 strains isolated from North America in two major groups. MLVA-A group consisted of 71 strains isolated in North America and only three strains isolated in Brazil. These strains from Brazil included the ones isolated before the beginning of the pandemic of S. Enteritidis in this country. In contrast, MLVA-B group clustered 185 strains isolated in Brazil and 29 strains isolated in North America. The strains in the MLVA-A group were divided in 34 different genotypic types with a similarity of 46%, while strains in iv the group B were divided in 15 different genotypic types with a similarity of 66%. MLST characterized 44 of the 46 strains studied as belonging to ST 11. The other two strains presented new alleles that characterized two new STs, the 1632 and the 1633. The results of molecular typing obtained by ERIC-PCR, PFGE and MLVA in this study showed a high genotypic similarity among S. Enteritidis strains isolated in Brazil, which suggests that the strains studied descend from a common ancestor that differed little genotypically during 24 years in the country. Moreover, the results of MLVA suggest that a new and prevalent subtype was introduced in Brazil after 1993 and has been contaminating food and infecting humans and animals. The high prevalence of virulence genes found in the strains studied reinforce their potential to cause disease in humans and animals, as well as the risks of their presence in food. Moreover, the high percentage of strains resistant to nalidixic acid observed after 1996 suggests the use of quinolones in the treatment of animal infections by S. Enteritidis in Brazil.

Listeria monocytogenes é um importante patógeno de origem alimentar que causa listeriose, infecção severa que acomete, principalmente, gestantes, idosos, crianças e imunocomprometidos, e que apresenta elevada taxa de mortalidade. A bactéria está amplamente distribuída no ambiente e é comumente encontrada em produtos cárneos. O presente estudo teve como objetivos caracterizar 439 isolados de L. monocytogenes obtidos de salsicha bovina e produtos cárneos crus (carne moída, linguiça suína e coxa de frango) refrigerados, adquiridos no comércio do município de São Paulo, e previamente submetidos à sorotipagem molecular. Os isolados foram caracterizados quanto ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana; presença dos genes de virulência actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB e mpl; perfil genético por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e sequenciamento parcial dos genes actA e lmo0737. Baixa frequência de resistência antimicrobiana (0,5%) foi observada entre os 416 isolados avaliados. Um isolado pertencente ao sorogrupo 1 apresentou resistência à penicilina e à clindamicina e outro identificado como 4a ou 4c apresentou resistência à tetraciclina. Todos os isolados foram positivos para os genes de virulência testados. O sequenciamento parcial do gene actA mostrou a ocorrência de 14 sequências de nucleotídeos distintas nos 97 isolados avaliados. Além disso, verificou-se a ocorrência de uma deleção de 35 aminoácidos no gene actA em 36 isolados, além de substituições de nucleotídeos que resultaram em mutações nas sequências de aminoácidos da grande maioria dos isolados. A análise filogenética do gene actA possibilitou o agrupamento dos isolados em duas linhagens distintas (I e II). Os resultados do PFGE indicaram grande variabilidade nos perfis genéticos dos isolados analisados, principalmente naqueles pertencentes aos grupos 2 (1/2c e 3c), 3 (1/2b e 3b) e 4 (4b, 4d e 4e). Os resultados deste estudo mostram que os isolados de L. monocytogenes provenientes de salsicha bovina e produtos cárneos crus comercializados no município de São Paulo, apresentam grande diversidade genética, importante potencial de virulência e baixa frequência de resistência antimicrobiana. A diversidade observada deve-se, provavelmente, à característica ubíqua deste micro-organismo, tornando-o mais susceptível a grande pressão seletiva do ambiente. / Listeria monocytogenes is an important foodborne pathogen that causes listeriosis, a severe infection that affects primarily pregnant women, elderly, children and imunocompromised individuals, and has a high mortality rate. The bacteria is widely distributed in the environment and commonly found in meat products. The present study aimed to characterize 439 isolates of L. monocytogenes obtained from pork sausage and raw chilled meat products (ground beef, beef sausage, and chicken thigh) purchased in supermarkets in the city of São Paulo, and previously submitted to molecular serotyping. The isolates were characterized for antimicrobial susceptibility profile; presence of virulence genes actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB and mpl; genetic profile by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and partial sequencing of genes actA and lmo0737. A low frequency of antimicrobial resistance (0.5%) was observed among the 416 evaluated isolates. One isolate belonging to serogroup 1 presented resistance to clindamycin and penicillin and another one identified as 4a or 4c was resistant to tetracycline. All isolates were positive for the tested virulence genes. The partial sequencing of the gene actA indicated the occurrence of 14 distinct nucleotide sequences in the 97 isolates tested. Furthermore, a deletion of 35 amino acids in the actA gene was detected in 36 isolates, and nucleotide substitutions that resulted in amino acid changes in the sequences of most isolates. Phylogenetic analysis of the actA gene clustered the isolates in two distinct lineages (I and II). Results of PFGE indicated a great genetic variability among isolates, especially among those belonging to groups 2 (1/2c and 3c), 3 (1/2b and 3b) and 4 (4b, 4d and 4e). The results of this study show that isolates of L. monocytogenes from pork sausage and raw meat products marketed in the city of São Paulo present a great genetic diversity, significant virulence potential and low frequency of antimicrobial resistance. The detected diversity is probably due the ubiquitous nature of these microorganisms, making them more susceptible to selective pressure of the environment.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

Os sistemas de sinalização de dois componentes são sistemas prevalentes em bactérias, permitindo a adaptação a diferentes condições ambientais. O sistema de dois componentes classicamente possui uma proteína histidina quinase, o primeiro componente, capaz de reconhecer o estímulo ambiental e fosforilar o regulador de resposta, o segundo componente. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria ubíqua, capaz de infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Esse patógeno oportunista apresenta um dos maiores conjuntos de sistemas de dois componentes em bactérias, que permite que ela sobreviva numa grande gama de ambientes, incluindo humanos. P. aeruginosa UCBPP-PA14 apresenta pelo menos 64 histidina quinases e 76 reguladores de resposta codificados em seu genoma. Diversos sistemas de dois componentes já foram correlacionados com a virulência, sendo o sistema GacSA o exemplo melhor caracterizado. Há poucos estudos sistemáticos sobre o envolvimendo dos reguladores de resposta na virulência de P. aeruginosa e os sinais que induzem a ativação dos reguladores de resposta precisam ser encontrados. Para identificar novos reguladores de resposta envolvidos na patogenicidade, infecções in vitro em macrófagos e in vivo em Drosophila melanogaster foram realizadas neste trabalho. Os macrófagos foram infectados com cada mutante dos reguladores de resposta ou com a linhagem selvagem, e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-α e o clearance bacteriano foram determinados. Alternativamente, as moscas foram infectadas utilizando-se a estratégia de feeding e a sobrevivência foi verificada. Utilizando-se essas abordagens, a identificação de diversos reguladores de resposta com papel na virulência foi alcançada, além de se corfirmar o papel de reguladores de resposta já estudados. Um dos novos genes envolvidos em virulência, PA14_26570 (nomeado neste trabalho de atvR), codifica um regulador de resposta atípico com substituição no aspartato fosforilável para glutamato, o que usualmente induz um estado sempre ativo. Um mutante não polar em atvR foi construído e macrófagos infectados com a linhagem ΔatvR confirmaram um maior clearance bacteriano e maior produção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Para comprovar a participação de AtvR durante a patogênese, um modelo de pneumonia aguda em camundongos foi utilizado. Camundongos infectados com a linhagem ΔatvR apresentaram uma maior sobrevivência em comparação aos camundongos infectados com a linhagem selvagem. Além disso, os camundongos infectados com ΔatvR apresentaram menor carga bacteriana, aumento no recrutamento de neutrófilos ativados e aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ). Utilizando-se uma abordagem transcritômica (RNA-Seq), foi determindo diversos genes são regulados positivamente na linhagem superexpressando AtvR em relação à linhagem controle. Dentre esses, os clusters de respiração anaeróbia nar, nir, nor e nos estão incluídos. Esse resultado foi confirmado por qRT-PCR e análises fenotípicas, em que a linhagem ΔatvR apresentou menor crescimento e expressão da nitrato redutase durante condições de hipóxia em comparação à linhagem selvagem. Em suma, neste trabalho foi demonstrado que diversos reguladores de resposta são importantes para a virulência de P. aeruginosa em macrófagos in vitro e in vivo em Drosophila, além de caracterizar o regulador de resposta atípico AtvR, que regula a respiração anaeróbica por desnitrificação, permitindo que P. aeruginosa possa infectar e colonizar o hospedeiro com maior eficiência. / Two-component systems are widespread in bacteria, allowing the adaptation to environmental changes. A two-component system is classically composed by a sensor kinase that phosphorylates a cognate response regulator. Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous proteobacterium able to cause disease in several hosts. This opportunistic pathogen presents one of the largest sets of two-component systems known in bacteria, which certainly contributes to its ability to thrive in a wide range of environmental settings, including humans. P. aeruginosa UCBPP-PA14 genome codes for at least 64 sensor kinases and 76 response regulators. Some response regulators are already known to be related to virulence, with the GacSA system as the best characterized. There are no systematic studies about the involvement of P. aeruginosa response regulators in virulence. Moreover, the input signal that triggers the response regulator activation is yet to be uncovered for most systems. To find new response regulators involved in virulence, in vitro infections werecarried out using macrophages. Briefly, the macrophages were infected with each response regulator mutant or the wild-type strain, the pro-inflammatory cytokine production (TNF-α) and the bacterial clearance were evaluated. Using this approach, we identified several response regulators involved in virulence, and we also confirmed the involvement of known response regulators in this process. One of the novel virulence-related response regulators, PA14_26570 (named here as AtvR), is an atypical response regulator with a substitution in the phosphorylable aspartate to glutamate, that usually leads to an always-on state. A non-polar mutant was constructed, and macrophage infection with ΔatvR confirmed an increased bacterial clearance as well as a higher TNF-α production as compared to the wild-type strain. To ascertain the role of AtvR during the pathogenic process, an acute pneumonia model was used. Mice infected with ΔatvR showed an increased survival as compared to mice infected with the wildtype strain. In addition, ΔatvR infected mice showed reduced bacterial burden, increased neutrophil recruitment and activation, as well as increased pro-inflammatory cytokine production (TNF-α and IFN-γ). Also, using a transcriptomic approach (RNASeq), we showed that several genes were upregulated in the strain overexpressing AtvR. These genes include the anaerobic respiration clusters nar, nir, nor and nos. This result was confirmed by qRT-PCR and phenotypic analysis, in which ΔatvR showed reduced growth and nitrate reductase expression during hypoxic conditions as compared to the wild-type strain. In conclusion, we have demonstrated that several response regulators are important for P. aeruginosa virulence in vitro. In addition, we further characterized the atypical response regulator AtvR, which regulates anaerobic respiration via denitrification, allowing this bacterium to infect and colonize the host more efficiently.

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

A doença decorrente da infecção por Salmonella é um dos maiores problemas de saúde no mundo em termos de morbidade e mortalidade. Entre as sorovariedades de Salmonella, a sorovariedade Enteritidis é a de maior ocorrência mundial e compreende linhagens que tem seu nicho biológico relacionado a frangos e ovos. Várias metodologias de tipagem fenotípicas e genotípicas foram desenvolvidas a fim de se delinear a epidemiologia das infecções por S. Enteritidis. Entretanto a tipagem fenotípica usualmente falha em discriminar linhagens relacionadas das nãorelacionadas epidemiologicamente e apresenta problemas de reprodutibilidade que foram minimizados com a utilização de métodos genotípicos. No Brasil, poucos estudos que utilizaram técnicas moleculares na tipagem de linhagens dessa sorovariedade foram realizados. Os objetivos desse estudo foram investigar o potencial patogênico, a resistência a antimicrobianos e realizar a tipagem molecular de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, de alimentos e de frangos no Brasil. Para isso foram estudadas 188 linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de surtos e de casos esporádicos, de humanos (67) de alimentos (61) e de frangos (60), durante o período de 1986 a 2010, de vários locais do Brasil. A susceptibilidade frente a 14 antimicrobianos foi analisada através da técnica de disco difusão e a presença de 13 genes de virulência das ilhas de patogenicidade de Salmonella I e II e do plasmídio pSEV foram pesquisados por PCR. Os mecanismos de resistência a quinolonas foram verificados através da pesquisa de genes de resistência plasmidiais e cromossomais e também através da verificação de mutações no gene gyrA por High resolution melting analysis (HRMA) seguida de sequenciamento de algumas linhagens. As linhagens também foram tipadas molecularmente pelas metodologias Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) com a enzima XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) e por Multilocus sequence typing (MLST). Das 188 linhagens estudadas, 42,5% foi resistente ao ácido nalidíxico e somente 0,5% foi resistente a sulfametoxazol-trimetoprima e estreptomicina. A resistência a quinolonas foi relacionada principalmente a mutações no gene gyrA. A maioria das linhagens estudadas (98,4%) apresentou todos os genes de virulência pesquisados, sendo uma linhagem negativa para o gene sipA e duas linhagens negativas para o gene prot6E. ERIC-PCR dividiu as 128 linhagens isoladas de humanos e alimentos em 55 perfis diferentes com similaridade >79,7%. PFGE dividiu essas mesmas linhagens em 68 perfis diferentes com uma similaridade >73,1%. Para as linhagens isoladas de frango, o dendrograma concatenado de ERIC-PCR e PFGE dividiu as 60 linhagens em dois grandes grupos com 73,3% de similaridade. O grupo A consistiu de linhagens isoladas tanto de material clínico de frangos (23) quanto do ambiente da granja (5) com 81,2% de similaridade. O grupo B também consistiu de linhagens isoladas tanto de casos clínicos de frangos (21) quanto do ambiente da granja (11) com 81,1% de similaridade. MLVA dividiu as 188 linhagens isoladas no Brasil e outras 100 linhagens isoladas na América do Norte em dois grandes grupos. O grupo MLVA-A apresentou 71 linhagens isoladas na América do Norte e somente três linhagens isoladas no Brasil. Essas linhagens do ii Brasil incluíram as isoladas antes do início da pandemia de S. Enteritidis se iniciar no país. Em contraste, o grupo MLVA-B agrupou 185 linhagens isoladas no Brasil e 29 linhagens isoladas na América do Norte. As linhagens presentes no grupo A, foram divididas em 34 tipos genéticos diferentes com similaridade maior do que 46%, enquanto no grupo B as linhagens se diferenciaram em 15 tipos genéticos diferentes com mais de 66% de similaridade. MLST caracterizou 44 das 46 linhagens estudadas como pertencentes ao ST 11. As outras duas linhagens apresentaram alelos que não existiam no banco de dados e caracterizaram dois novos STs, o 1632 e o 1633. Os resultados de tipagem molecular obtidos por ERICPCR, PFGE e MLVA no presente estudo, demonstraram uma alta similaridade genotípica entre linhagens de S. Enteritidis isoladas no Brasil, o que sugere que as linhagens estudadas descendem de um precursor comum que pouco se diferenciou genotipicamente ao longo de 24 anos no país. Ademais, os resultados de MLVA sugerem que um novo e prevalente subtipo foi introduzido no Brasil após 1993 e tem contaminado alimentos e infectado humanos e animais. O grande número de genes de virulência encontrados reforça o potencial das mesmas causarem doenças em humanos e animais, bem como, os riscos de sua presença em alimentos. Ademais, a grande porcentagem de linhagens resistentes ao ácido nalidíxico observadas a partir de 1996 sugere o uso de quinolonas no tratamento de infecções em animais causadas por S. Enteritidis no Brasil. / The disease caused of the infection by Salmonella is one of the major health problem worldwide in terms of morbid and mortality. Among the Salmonella serovars, the Enteritidis is the most frequent isolated one and comprises strains that have their biological niche related to chickens and eggs. Several phenotypic and genotypic methodologies were developed to trace epidemiologically the infections by S. Enteritidis. However, the phenotypic typing usually fail to discriminate related from unrelated epidemiologicaly strains and presents problems of reproducibility that were minimized with the introduction of genotypic methods. In Brazil, few studies that used molecular typing techniques to type strains of this serovar were conducted. The aims of this study were to investigate the pathogenic potential, the antimicrobial resistance and to molecularly type of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil. For this, it was studied 188 strains of Salmonella Enteritidis isolated from outbreaks and sporadic cases, from humans (67), food (61) and chickens (60), during the period of 1986 to 2010, from various places of Brazil. The susceptibility to 14 antimicrobials were analyzed by the disc diffusion technique and the presence of 13 virulence genes of the Salmonella pathogenicity islands I and II and from the pSEV plasmid were searched by PCR. The mechanisms of resistance to quinolones were verified by the search of plasmidial and cromossomal resistance genes and also by the verification of mutations in the gyrA gene by High resolution melting analysis (HRMA) followed by sequencing of some strains. The strains were also molecularly typed by the methodologies Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the enzyme XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and by Multilocus sequence typing (MLST). From the 188 strains studied, 42.5% were resistant to nalidixic acid and only 0.5% were resistant to sulfamethoxazoletrimethoprim and streptomycin. Resistance to quinolones was related mainly to mutations in the gyrA gene. The majority of the strains studied (98.4%) harbored all the virulence genes searched, being only one strain negative for the sipA gene and two strains negative for the prot6E gene. ERIC-PCR divided the 128 strains isolated from humans and food in 55 different profiles with >79.7% of similarity. PFGE divided the same strains in 68 different profiles with a similarity of >73.1%. Regarding the strains isolated from chickens, the concatenated dendrogram of ERIC-PCR and PFGE divided the 60 strains in two major groups with a similarity of 73.3%. Group A consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (23) or from the farm environment (5) with a similarity of 81.2%. Group B also consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (21) or from the environment (11) with a similarity of 81.1%. MLVA divided the 188 strains isolated in Brazil and other 100 strains isolated from North America in two major groups. MLVA-A group consisted of 71 strains isolated in North America and only three strains isolated in Brazil. These strains from Brazil included the ones isolated before the beginning of the pandemic of S. Enteritidis in this country. In contrast, MLVA-B group clustered 185 strains isolated in Brazil and 29 strains isolated in North America. The strains in the MLVA-A group were divided in 34 different genotypic types with a similarity of 46%, while strains in iv the group B were divided in 15 different genotypic types with a similarity of 66%. MLST characterized 44 of the 46 strains studied as belonging to ST 11. The other two strains presented new alleles that characterized two new STs, the 1632 and the 1633. The results of molecular typing obtained by ERIC-PCR, PFGE and MLVA in this study showed a high genotypic similarity among S. Enteritidis strains isolated in Brazil, which suggests that the strains studied descend from a common ancestor that differed little genotypically during 24 years in the country. Moreover, the results of MLVA suggest that a new and prevalent subtype was introduced in Brazil after 1993 and has been contaminating food and infecting humans and animals. The high prevalence of virulence genes found in the strains studied reinforce their potential to cause disease in humans and animals, as well as the risks of their presence in food. Moreover, the high percentage of strains resistant to nalidixic acid observed after 1996 suggests the use of quinolones in the treatment of animal infections by S. Enteritidis in Brazil.

Host shifts -- where a pathogen jumps from one host species to another -- have been described as one of the main factors leading to emerging infectious diseases (EID). The harm that a pathogen causes to a host (virulence) varies following a host shift. Differences in susceptibilities among host species means that pathogens may be more likely to switch between certain groups of hosts. Factors that determine the variation in host susceptibility are still unknown, but one possible predictor is the host evolutionary history. Here, we examine how phylogenetically related hosts vary in susceptibility when dealing with infections of two viruses differing in pathogenicity. We infected 39 species of Drosophilidae with Drosophila A virus (DAV), a virus initially described as avirulent, and we measured host mortality (virulence) and virus replication (viral load). Then, we compared our results to previously collected data from the virulent Drosophila C virus (DCV) and we analysed the data of both viruses together. We found large variation in DAV virulence and viral load, with benign infections in some cases and high mortality in others. There was phylogenetic correlation in viral load, with species presenting similar viral load clustering together in the phylogeny. However, we did not find correlation for virulence, indicating that DAV virulence was not predictable based on viral load. Also, we did not find correlation between DAV and DCV results, indicating that variation in host susceptibility is not predictable by other pathogens infections. It is possible that hosts and parasites ecology or genetic traits may be also influencing susceptibility variation. These results suggest that although some traits are predicted by phylogeny, to determine the factors driving host susceptibility variation to different pathogens following host shifts is a very complex task / Trocas de hospedeiro -- quando um patógeno passa de uma espécie de hospedeiro para outra -- são descritas como um dos principais fatores causadores de doenças infecciosas emergentes (DIE). O dano que um patógeno causa a seu hospedeiro (virulência) varia quando trocas de hospedeiro ocorrem. Diferenças em susceptibilidade entre espécies de hospedeiros indicam que patógenos são mais propensos a realizar trocas entre determinados grupos de hospedeiros. Os fatores que determinam a variação na susceptibilidade do hospedeiro ainda são desconhecidos, porém um possível preditor é a história evolutiva do hospedeiro. Nesse estudo, nós examinamos como hospedeiros filogeneticamente relacionados variam em susceptibilidade ao lidar com duas infecções de vírus que variam em patogenicidade. Infectamos 39 espécies de Drosophilidae com o vírus A de Drosophila (DAV), inicialmente descrito como não virulento, e medimos mortalidade do hospedeiro (virulência) e replicação viral (carga). Em seguida, nós comparamos nossos resultados com informações do vírus C de Drosophila (DCV), um virulento, e analisamos os dados dos dois vírus conjuntamente. Encontramos uma grande variação nos dados de virulência e carga viral para DAV, com infecções benignas em alguns casos e alta mortalidade em outros. Encontramos correlação para carga viral, com espécies com cargas virais semelhantes aparecendo filogeneticamente próximas. Contudo, não há correlação filogenética para virulência, indicando que a virulência de DAV não pode ser predita com base na carga viral. Além disso, nós não encontramos correlação entre os resultados de DAV e DCV, indicando que a variação na susceptibilidade não pode ser predita por infecções de outros patógenos. É possível que fatores ecológicos e genéticos do hospedeiro e do parasita estejam influenciando a variação em susceptibilidade. Esses resultados sugerem que, apesar de alguns traços possam ser preditos pela filogenia, determinar os fatores causadores da variação na susceptibilidade a diferentes patógenos após trocas de hospedeiros é um trabalho extremamente complexo

Orientador: Pasqual Barretti / Resumo: Peritonite por bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) é complicação importante da diálise peritoneal (DP), com curso clínico grave e elevada taxa de falência do método. Fatores associados à virulência, resistência antimicrobiana, formação de biofilme, entre outros, têm sido relatados, mas o limitado conjunto de evidências não permite concluir sobre os fatores responsáveis pelo pior curso clínico dessas infecções. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características microbiológicas, das condições clínicas do paciente e do tratamento na evolução de peritonites por BGNNF, ocorridas num único centro, em período de 18 anos. A sensibilidade in vitro aos antimicrobianos, produção de biofilme, além da análise do perfil clonal das bactérias pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado foram realizadas em todos os isolados bacterianos. Foram pesquisados genotipicamente, em isolados de Pseudomonas aeruginosa, a presença de marcadores de virulência (alginato, exoenzima S, fosfolipases C, exotoxina A, protesase alcalina, elastase e ramnolipídeos). Associações entre as características microbiológicas do paciente e tratamento com a taxa de resolução da peritonite foram estudadas. A espécie mais frequente foi Pseudomonas aeruginosa (45,59%), seguida por isolados do complexo Acinetobacter baumannii (17,65%). O estudo dos fatores de virulência da Pseudomonas aeruginosa revelou a presença de fatores de virulência em 100% dos casos, exceto exoenzima S (58,33%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Peritonitis due to non-fermentative Gram-negative bacilli (NFGNB) is a serious complication of peritoneal dialysis (PD), with a severe clinical course and high technique failure rate. Factors as bacterial virulence, antimicrobial resistance, biofilm formation, among others, have been reported, but the limited amount of evidence does not allow to conclude on the factors responsible for the worst clinical course of these infections. The objective of this study was to evaluate the influence of the microbiological characteristics, patients conditions, and treatment on evolution of peritonitis episodes at a single center in an 18 - year period. In vitro susceptibility, biofilm production, and clonal profile analysis of bacteria by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) were performed in all isolates. The presence of virulence markers (alginate, exoenzyme S, phospholipases C, exotoxin A, alkaline protease, elastase, and ramnolipids) was genotyped in bacterial isolates of Pseudomonas aeruginosa. From the data referring to the patient and causal agent, associations between the microbiological, patient characteristics, and treatment on the resolution rate of peritonitis were analyzed. The most frequent species was Pseudomonas aeruginosa (45.59%), followed by Acinetobacter baumannii complex (17.65%). The study of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa revealed the presence of virulence factors in 100% of the cases, except for exonzyme S (58.33%) and hemolytic phospholipase C ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Coorientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Banca: Ary Fernandes Júnior / Banca: Antonio Carlos Campos Pignatari / Resumo: Staphylococcus aureus se destaca por sua patogenicidade e alta frequência, permitindo que este agente seja capaz de produzir doenças tanto em indivíduos sadios quanto em imunocomprometidos por sua fácil disseminação. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a distribuição de clones de S. aureus sensíveis e resistentes à meticilina (MSSA/MRSA) em 50 isolados provenientes de pacientes com infecções de pele da Seção de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina (FMB) de Botucatu, 50 isolados de idosos de Instituições de Longa Permanência (ILP) de Bauru e 50 isolados provenientes de detentos do Centro de Ressocialização (CR) de Avaré. Os isolados de S. aureus foram submetidos à técnica de E-test para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Para determinação do perfil de virulência e resistência à oxacilina nos 150 isolados de S. aureus foram realizadas reações em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção dos genes mecA, cassete cromossômico estafilocócio mec (SCCmec), genes codificadores das enterotoxinas (sea, seb e sec-1), toxinas esfoliativas A e B (eta e etb), toxina 1 da síndrome do choque tóxico (tst), leucocidina de Panton-Valentine (lukS-PV e lukF-PV), hemolisinas alfa e delta (hla e hld) e biofilme (icaA e icaD). O perfil clonal dos isolados MSSA e MRSA foi caracterizado por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), e os clones de MRSA foram submetidos a tipagem molecular por Multilocus Sequence Typing (MLST) e spa typing. Os resultados revelaram maior prevalência de MRSA nas instituições de longa permanência, além de apresentarem CIM90 64μg/mL para oxacilina e CIM90 > 256 μg/mL para clindamicina. Das 150 amostras de S.aureus ... / Abstract: Staphylococcus aureus is distinguished by its high pathogenicity and frequency, allowing that this agent is capable of producing diseases in both healthy individuals and immunocompromised due to its easy dissemination. The aim of this work was to characterize the distribution of clones of S. aureus sensitive and resistant (MSSA/MRSA) in 50 isolates from patients with skin infections of Section of Dermatology of the University Hospital of the Botucatu Medical School Hospital of the (FMB), 50 isolates of elderly residents of nursing homes of Bauru and 50 isolates from inmates of Detention Center of Avare. The isolates of S. aureus were subjected to the technique of E-test for determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC). To determine the virulence profile and oxacillin resistance in 150 isolates of S. aureus was used Polymerase Chain Reaction (PCR) for the detection of mecA gene, staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), genes encoding enterotoxins (sea, seb and sec-1), exfoliative toxins A and B (eta e etb), toxic shock syndrome toxin 1 (tst), Panton-Valentine leukocidin (lukS-PV and lukF-PV), alpha and delta hemolysin (hla and hld) and biofilm (icaA and icaD). The clonal profile of MRSA and MSSA isolates were characterized by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), and MRSA clones were subjected to molecular typing Multilocus Sequence Typing (MLST) and spa typing. The results revealed a higher prevalence of MRSA in institutional settings, besides having MIC90 64μg/mL for oxacillin and MIC90 > 256 mg/mL for clindamycin. Of the 150 samples of S. aureus studied, 20 (13.3%) were mecA carriers, being detected seven isolates harboring SCCmec type IV nine carrying the SCCmec type II, only one isolate carrying the SCCmec type I and 3 isolates were not typed by the protocol used. Among the virulence factors, enterotoxin A was the most prevalent in all sources. Is important to note, 10% of isolates from Center Resocialization ... / Mestre