O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.

O tratamento de infecções por Staphylococcus aureus tem sido problemático devido ao surgimento de cepas resistentes a múltiplios antibióticos. O antibiótico de escolha para o tratamento de infecções por S. aureus resistente a oxacilina é o glicopeptídeo vancomicina. Desde o primeiro isolamento de cepas com sensibilidade reduzida a vancomicina (VISA) em 1997, tem havido crescente preocupação com a disseminação da resistência a este antibiótico. Os mecanismos moleculares que levam à resistência de baixo nível a vancomicina ainda não foram elucidados. A detecção deste fenótipo na rotina de laboratório clínico é laboriosa, pois as técnicas disponíveis são de difícil execução e interpretação. Até agora, não há relato de transmissão horizontal de infecção por VISA, e todas as cepas com este fenótipo foram isoladas de pacientes que faziam o uso prolongado de vancomicina. Uma deficiência no locus regulador de genes acessórios (agr) foi postulado como fator de risco para a aquisição do fenótipo VISA por uma cepa sensível a este antibiótico. Para este estudo, foram selecionadas 47 cepas de S. aureus, com sensibilidades variadas a vancomicina, inclusive 5 cepas VISA isoladas no Brasil. Determinou-se nas cepas as concentrações inibitórias mínimas de vancomicina e oxacilina, a atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro e de coelho, a capacidade de aderir ao poliestireno e o polimorfismo do locus agr. Determinou-se a integridade do locus agr por PCR-RFLP e sequenciamento de bases em 13 cepas representativas das 47 estudadas. A integridade do locus regulador acessório sarA também foi avaliada por sequenciamento de bases nestas 13 cepas. Foram escolhidas 18 cepas sensíveis a vancomicina com variadas características fenotípicas e estas foram submetidas à indução de resistência a vancomicina através da passagem seriada em concentrações crescentes deste antibiótico. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6 µg/mL de vancomicina foi avaliada em 8 cepas através de ensaios de flutuação. Não observou-se correlação entre a aquisição de resistência a vancomicina com as atividades hemolíticas ou capacidade de adesão das cepas. A maioria das cepas (82,9%) apresentou-se como pertencente ao grupo polimórfico agr I, inclusive as cepas VISA. Duas cepas não conseguiram ser induzidas à resistência a vancomicina. O tempo levado para a aquisição de resistência não se correlacionou com nenhuma característica fenotípica ou genotípica de um grupo de cepas. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6µg/mL de vancomicina apresentou-se maior para uma cepa pertencente ao clone endêmico brasileiro (CEB) cujo locus agr pertence ao grupo I e não apresentou variação de acordo com funcionalidade ou tipo do locus agr. Apenas uma das cepas VISA apresentou uma mutação no locus agr que o torna disfuncional. Os loci agr das outras cepas estudadas apresentaram-se íntegros. O locus sarA das cepas estudadas apresentou-se íntegro e com polimorfismos funcionais agrupados de acordo com a linhagem clonal das cepas. Pôde-se concluir que a integridade funcional do locus agr não é uma condição sine qua non para a aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina por parte de uma cepa sensível a este antibiótico. O grupo polimórfico agr II não tem maior predisposição à aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina, como havia sido sugerido por alguns trabalhos disponíveis na literatura. / The treatment of staphylococcal infections has lately been a strenuous undertaking due to the resistance of Staphylococcus aureus to multiple antibiotics. The antimicrobial drug of choice for the treatment of methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the glycopeptide vancomycin. Since the first isolation of S. aureus with reduced susceptibility to vancomycin (VISA) in 1997, there has been growing concern as to the dissemination of this resistance phenotype among isolates of this species. The molecular mechanisms that result in low level resistance to vancomycin have not yet been completely elucidated. The correct detection of this phenotype in the clinical laboratory is tricky, for the techniques available for this purpose are hard to execute and interpret. Until now, lateral transmission (dissemination) of VISA has not been reported and all strains bearing this phenotype have been isolated from patients who had been making prolonged use of vancomycin. A deficiency in the accessory gene regulator (agr) has been proposed as a risk factor for the acquisition of a VISA phenotype by a susceptible strain. For this study, 47 nosocomial VISA strains, that had been isolated in another study, were used. These strains were isolated from multiple geographical regions of Brazil, and included 5 VISA strains. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of vancomycin and oxacillin, as well as haemolysis in sheep and rabbit agar, adhesion to polystyrene and agr polymorphism were determined in all of these strains. The integrity of the agr locus was determined by PCR-RFLP and by nucleotide sequencing in a sample of 13 strains chosen to be representative of the 47 strains studied. The integrity of the Staphylococcal accessory regulator sarA was also determined by nucleotide sequencing in these 13 strains. Another representative sample of 18 strains that were susceptible to vancomycin were submitted to induction of resistance to vancomycin by serial passage in increasing concentrations of this drug. The mutation rate of a mutation that leads to the ability of growing in a concentration of 6 µg/mL of vancomycin was determined for 8 strains by fluctuation assays. There was no correlation between the acquisition of resistance to vancomycin with either haemolysis or adhesion to polystyrene. Most strains (82.9%) bore a group I agr polymorphism, including all of the VISA strains. Two strains could not be induced to resistance. The time taken for each strain to acquire resistance to vancomycin did not correlate with any phenotypic or genotypic characteristic pertaining to a group of strains. The rate of mutation that leads to the ability of growing in 6µg/mL of vancomycin proved to be higher for a strain belonging to the Brazilian Endemic Clone (BEC) bearing an agr group I polymorphism, and did not vary according to presence or type of agr locus. Only one of the VISA strains presented a mutation in the agr locus that renders it disfunctional. The agr loci of the other strains studied presented themselves to be intact. The sarA loci of the strains evaluated were intact however presented functional polymorphisms that were groups according to the clonal lineage of the strains. It can thus be concluded that the functional integrity of the agr locus is not a sine qua non condition for the acquisition of low level resistance to vancomycin by a susceptible strain. Bearing of an agr group II polymorphism does not predispose a strain to acquire resistance to vancomycin, as has been previously suggested in literature.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-17T15:25:38Z No. of bitstreams: 1 Cleia Santos Cabral.pdf: 1106804 bytes, checksum: 14447df94770ff469bfc234136893b59 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T15:25:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleia Santos Cabral.pdf: 1106804 bytes, checksum: 14447df94770ff469bfc234136893b59 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (FOLac), is an important disease of lettuce in the world. This disease was reported in Brazil, recently. From 2008 to 2011 the laboratories of Plant Pathology of Embrapa Hortaliças (Embrapa Vegetable Crops), Sakata Seeds Sudamerica and Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (INCAPER) collected some FOLac isolates in states from the Southern and the Southeastern regions of Brazil. The isolates were identified as F. oxysporum by the morphological characteristics of conidia and conidiophores. Isolates were inoculated on lettuce plants, cultivars Elisa, Vera, and Red Salad Bowl, conditions in a greenhouse. Isolates were also inoculated on plants of others Asteraceae species (Cichorium endivia, Cichorium intybus, Sonchus oleraceus, Emilia sonchifolia, Bidens pilosa e Tagetes erecta) and others botanical families as (Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Gossypium hirsutum, Phaseolus vulgaris e Ocimum basilicum). Lettuce cultivars Elisa and Vera were suscetible to all isolates while the cultivar Red Salad Bowl was resistant. All isolates were reisolated from diseased plants fulfilling the Koch‟s postulates. Others plant species were not susceptible to any isolate, proving that isolates belong to the species F. oxysporum f. sp. lactucae. The isolates were also inoculated in a differential set of cultivars comprising: „Patriot‟ (Susceptible to all races), „Costa Rica No. 4‟ (resistant to race 1) and „Banchu Red Fire‟ (resistant to race 2). Cultivars „Patriot‟ and „Banchu Red Fire‟ were susceptible while „Costa Rica No. 4‟ was resistant, confirming that all the isolates were race 1. Molecular analysis using a primer specific to race 1 isolates was performed using F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) raça 3 and a non-pathogenic isolate as negative controls. DNAs of FOLac isolates were amplified by PCR and those of the negative controls were not, confirming the specificity of the primers and the presence of only the race 1 of FOLac in Brazil. In addition, it was used the Translation elongation factor 1-α region (tef-1α) for phylogenetic analysis between FOLac isolates races 1 and 2 and isolates of F. oxysporum. Comparison of the sequences obtained with the tef-1α confirmed the polyphyletic origin of the forma specialis lactucae and also showed a greater genetic variability among Brazilian isolates of FOLac race 1compared with isolates of the same race available in GenBank. After the isolates characterization, it was made a screening of 102 accessions for resistance to the isolate Fus-173 and it was selected 47 as highly resistant. After this, the selected genotypes were evaluated for the stability of resistance in three additional assays, using different FOLac race 1 isolates. In all three assays it was used a highly susceptible cultivar (Regina) as susceptible control. In the first assay, carried out in October 2011, it were used the isolates Fus-202 and Fus-205. In the second assay, carried out in November 2011, it were used the isolates Fus-219 and Fus-222. In the third assay, carried out in December 2011, it were used the isolates (Fus-207, Fus-209 e Fus-220). Inoculation was performed on 25 days old seedlings on greenhouse conditions. Seedlings were inoculated by cutting their roots and emerging them in spore suspension of pathogen. Evaluation was carries out 30 days after inoculation, using a grade scale varying from 0 (heath plants) to 4 (dead plants). Data were transformed in Disease Index (DI) submitted to a variance analysis and the media were compared by the Tukey‟s test (5%). Thirty two accessions were identified as having broad spectrum of resistance to different pathogen isolates in the four inoculation seasons. / A murcha de fusário, causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (FOLac) é uma das doenças mais importantes da alface. Esta doença foi relatada recentemente no Brasil. Nos anos de 2008 a 2011 foram coletados isolados de FOLac nos Laboratórios de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças, Sakata Seed Sudamerica Ltda e do Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (Incaper). Estes eram provenientes de todos os estados das Regiões Sul e Sudeste do Brasil. A identificação foi feita observando-se as características morfológicas de conídios e conidióforos. Os isolados foram inoculados em plantas das cultivares Elisa, Vera e Red Salad Bowl, em condições de casa de vegetação. Os mesmos também foram inoculados em plantas de outras espécies de Asteraceae (Cichorium endivia, Cichorium intybus, Sonchus oleraceus, Emilia sonchifolia, Bidens pilosa e Tagetes erecta) e de outras famílias (Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Gossypium hirsutum, Phaseolus vulgaris e Ocimum basilicum). Os isolados foram identificados como Fusarium oxysporum. As cultivares Elisa e Vera foram suscetíveis a todos os isolados e a Red Salad Bowl foi resistente. Efetuou-se o re-isolamento do patógeno, completando-se assim os Postulados de Koch. Nenhuma outra espécie de planta foi suscetível ao patógeno, confirmando a identificação como F. oxysporum f. sp. lactucae. Em seguida, os isolados foram avaliados quanto a sua virulência numa série de cultivares diferenciadoras de raças: Patriot (suscetível), Costa Rica No. 4 (resistente à raça 1) e Banchu Red Fire (resistente à raça 2). As cultivares Patriot e Banchu Red Fire comportaram-se como suscetíveis a todos os isolados, enquanto a cultivar Costa Rica No. 4 comportou-se como resistente. Concluiu-se que os isolados avaliados são da raça 1 de FOLac. Adicionalmente, foi feito um teste com primers específicos para a raça 1 de FOLac, utilizando como controles um isolado de F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) raça 3 e um isolado não patogênico de F. oxysporum. O fragmento de DNA foi amplificado por PCR para os isolados de FOLac e não foi amplificado para o isolado de FOL e nem para o isolado não patogênico de F. oxysporum. Este resultado confirma a especificidade desse par de primers e a presença apenas da raça 1 de FOLac no Brasil. Além disso, foi utilizada a região do fator de elongação da tradução (tef-1α) para análise filogenética entre os isolados FOLac raças 1 e 2 e isolados de F. oxysporum. Comparação das seqüências obtidas com o tef-1α confirmou a origem polifilética da forma specialis lactucae e também observou-se uma maior variabilidade genética entre os isolados brasileiros de FOLac raça 1 comparados com isolados da mesma raça disponíveis no GenbanK. Posteriormente, 102 acessos (cultivares comerciais ou linhagens) foram avaliados, visando identificar fontes de resistência a FOLac e analisar a estabilidade da resistência de acessos promissores a diferentes isolados do patógeno. Inicialmente foi feita uma seleção preliminar, utilizando um isolado do patógeno (Fus-173). Em seguida, quarenta e sete acessos altamente resistentes mais uma testemunha suscetível (Regina), identificados na seleção preliminar, foram reavaliados para estabilidade da resistência ao FOLac raça 1, utilizando os isolados (Fus-202 e Fus-205) no mês de Outubro de 2011; isolados (Fus-219 e Fus-222) no mês de Novembro de 2011 e isolados (Fus-207, Fus-209 e Fus-220) no mês de Dezembro de 2011. A inoculação foi realizada em condições de casa de vegetação, pelo método de corte das raízes e imersão na suspensão de conídios do patógeno. A avaliação foi realizada após 30 dias, com auxílio de escala de notas variando de 0 (planta sadia) a 4 (planta morta). Os dados obtidos foram transformados em índice de doença (ID) e submetidos a uma análise de variância e comparação de médias pelo teste de Tukey (5%). Foram identificados trinta e dois acessos apresentando amplo espectro de resistência aos diferentes isolados do patógeno nas quatro épocas de inoculação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

O Trypanosoma cruzi, parasita causador da doença de Chagas, apresenta isolados virulentos e de baixa virulência. Exploramos o envolvimento do sistema imune nos baixos níveis de parasitemia de camundongos infectados com parasitas de baixa virulência Sylvio X10/4. Camundongos C57Bl/6 WT não apresentam parasitemia patente após 24 horas da infecção, e a análise da carga parasitária revelou que a maioria dos parasitas vão para o fígado e baço. O envolvimento dos anticorpos naturais foi descartado, e uma pequena participação do sistema complemento sugerida. Já camundongos IFN-<font face=\"Symbol\">gKO infectados apresentaram parasitemia intermitente nas primeiras semanas, e isto não pôde ser atribuído à deficiência na produção de proteínas de fase aguda. Anticorpos específicos parecem cruciais para o controle do parasita; além disso, animais que apresentam apenas IgM são resistentes à infecção. Assim, sugerimos que a rápida saída que segue a inoculação do Sylvio X10/4 é um processo de remoção ativa e, em longo prazo, não somente a IgG, mas a IgM tem um papel importante na proteção. / Trypanosoma cruzi, the parasite responsible for Chagas´ disease, displays virulent isolates and low-virulence ones. We explored the involvement of the immune system in the low level parasitemia of mice infected with low-virulence Sylvio X10/4 parasites. C57BL/6 WT mice do not show patent parasitemias after 24 hours after infection and the parasite load revealed that most parasites go to the liver and spleen. The involvement of natural antibodies was discarded and a small participation of the complement system was suggested. However, infected IFN-<font face=\"Symbol\">gKO mice showed intermittent patent parasitemias in the first weeks of infection and this can not be attributed to deficiency in the production of acute phase proteins. Parasite-specific antibodies seem crucial for parasite control, in addition, animals that have only IgM are resistant to infection. Thus, we suggest that the rapid clearance that follows Sylvio X10/4 inoculation is an active removal process and, at the long run, not only IgG, but also IgM play an important role in protection.

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Objectives:This study determines the predictive value (PPV) of the clinical diagnosis of VVC in comparison to the culture, characterizes Candida species isolated from the vaginal mucosa through phenotypic and molecular methods, and verifies the production of hydrolytic enzymes and the susceptibility profile in vitro to antifungal agents used in VVC therapy. Methods: the phenotypic methods used were based on morphological and biochemical aspects, while molecular tests were performed using the polymerase chain reaction with primes specific for each species. In order to verify the activity of the enzymes protease, phospholipase and hemolysin, yeast growth was carried out in media containing bovine albumin, egg yolk and blood, and the reading was determined by the precipitation zone (PZ). Adherence of Candida to epithelial cells was determined by light microscopy by counting the number of cells adhered to 100 epithelial cells. In vitro susceptibility of Candida isolates to fluconazole, itraconazole, voriconazole, nystatin, and amphotericin B was performed using the broth dilution assay to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antifungal. Results: the VPP of clinical diagnosis against the gold standard of 61.8% (34/55). Among the 55 samples collected, 36 isolates identified as C. albicans(27), C. glabrata (5) and C. topicalis (4) were obtained. All isolates were enzyme producers with average adherence to 100 oral epithelial cells for the C. albicans, C. glabrata and C. tropicalis species were respectively 402.5, 236.2 and 58. High resistance to fluconazole (38.8%), high susceptibility to amphotericin B (94.4%) and low MIC values for nystatin (8 μg / mL at > 16 μg/mL) were observed for the isolates. Conclusions: the culture is essential for the diagnosis of CVV and confirm that C. albicans continues the predominant species as CVV agent. All species presented a high pathogenic power. Hydrolytic enzymes were produced by all the isolates. This study allow suggest to the clinician that the in vitro susceptibility tests prior to antifungal prescription would bring higher therapeutic success. / Introdução: a candidíase vulvovaginal (CVV) é caracterizada como a segunda infecção mais comum entre as infecções que acometem esta região. As leveduras do gênero Candida, como C. albicans, C. parapsilosis, C. topicalis, C. glabrata, C. krusei e C. guilliermondii são as principais causadoras desta patologia, podendo ser identificadas por métodos fenotípicos e moleculares. Objetivos: determinar o valor preditivo (VPP), do diagnóstico clínico de CVV em comparação à cultura, realiza a caracterização das espécies de Candida isoladas da mucosa vaginal através de métodos fenotípicos e moleculares, verifica a produção de enzimas hidrolíticas e o perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos usados na terapia da CVV. Metódos: Os métodos fenotípicos usados foram baseados em aspectos morfológicos e bioquímicos, enquanto os testes moleculares foram realizados usando–se a reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeos específicos para cada espécie. Para a verificação da atividade das enzimas proteinase, fosfolipase e hemolisina, foi realizado respectivamente, o crescimento das leveduras em meios contendo albumina bovina, gema de ovo e sangue, sendo a leitura determinada pela zona de precipitação (PZ). A aderência de Candida às células epiteliais foi determinada por microscopia óptica pela contagem do número de células aderidas a 100 células epiteliais. A suscetibilidade in vitro dos isolados de Candida para fluconazol, itraconazol, voriconazol, nistatina e anfotericina B foi realizada usando-se o teste de diluição em caldo visando á determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do antifúngico. Resultados: o VPP do diagnóstico clínico frente ao padrão-ouro de 61,8% (34/55). Dentre as 55 amostras coletadas foram obtidos 36 isolados identificados como C. albicans (27), C. glabrata (5) e C. tropicalis (4). Todos os isolados foram produtores de enzimas, a média de aderência à 100 células epiteliais bucais para as espécies de C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis foi respectivamente de 402,5, 236,2 e 58. Alta resistência ao fluconazol (38,8%), elevada suscetibilidade a anfotericina B (94,4%) e baixos valores de MIC para nistatina (8 μg/mL a > 16 μg/mL) foram observados para os isolados.Conclusões: a cultura é fundamental para o diagnóstico de CVV e confirmam que C. albicans continua a espécie predominante como agente de CVV. Todas as espécies apresentam um alto poder patogênico visto a liberação de enzimas por todos os isolados. Este estudo permite sugerir ao clínico que a realização de testes de suscetibilidade in vitro anterior a prescrição do antifúngico traria maior êxito terapêutico.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarolinaRodriguesCosta-2009.pdf: 705821 bytes, checksum: 53ed28c3e9fdc5770d04b7c412384968 (MD5) Previous issue date: 2009-06-02 / Adhesion to host tissues, production of hydrolytic enzymes, the resistance to antifungals and ability to production hyphal interfere in the infectious process caused by Candida. Resistance to azole antifungal agents, used to treatment of candidiasis, has been observed to immunocompromised patients. Molecular typing based on RAPD-PCR has been used to discriminate between susceptible and resistant isolates to antifungal agents. In this work, were evaluated the virulence factors and molecular characteristics of Candida isolates obtained of samples from blood, catheter of nosocomial patients and from oral cavity of HIV positive patients. The isolates were identified as: Candida albicans (59) Candida parapsilosis (22), Candida tropicalis (14) Candida guilliermondii (07), Candida. famata (05), Candida krusei (03), Candid. lusitaniae (01) and Candida kefyr (01). The proteinase and phospholipase production and the adherence ability were determined for these yeasts. The effect of fluconazole and itraconazole antifungal agents on hyphal formation were studied to 5 isolates previously classified as either susceptible or resistant. The characterization genotypic of resistant and susceptible isolates to fluconazole was carried out for 13 isolates of C. albicans by RAPD-PCR method. The results showed that proteinase activity was detected in 88.1% of C. albicans isolates and in 69.8% of non C. albicans, while phospholipase was produced in 55.9% of C. albicans isolates and in 37.7% of non C. albicans. Isolates of blood were more proteolitic than catheter and oral cavity, while for phospholipase, there was more production of this enzyme in the oral cavity. The ability of adherence to buccal epithelial cell was higher in C. albicans than non C. albicans, however there was not behavior difference between the isolates from different sources studied. The hyphal formation was higher in resistant isolates than susceptible isolates when used the both drugs. In RAPD-PCR method the formation of two different groups was verified for susceptible and resistant isolates being that only one resistant isolate was clustered in the susceptible group. Thus, in this work, it was verified that the exoenzymes activity and adherence ability depend not only of the specie of Candida, but too of the source from host; the resistant isolates produced more hyphal than susceptible isolates under the antifungal action and the molecular characteristics of the resistant isolates did not suggest unique DNA fingerprints did not predicting their susceptibility to fluconazole / A capacidade de aderência ao tecido do hospedeiro, a produção de exoenzimas, a resistência aos antifúngicos e a formação de hifas são fatores que podem interferir no processo infeccioso causado por Candida. Resistência aos derivados azólicos utilizados no tratamento de candidíase, tem sido observada em pacientes imunocomprometidos. Tipagem molecular como o RAPD-PCR tem sido utilizada para discriminação entre isolados de Candida spp suscetíveis e resistentes aos antifúngicos. Neste trabalho foram avaliados fatores de virulência e características moleculares de leveduras do gênero Candida isoladas de amostras do sangue, de cateter de pacientes nosocomiais e da cavidade bucal de pacientes HIV positivos. Os isolados utilizados foram identificados como: Candida albicans (59) Candida parapsilosis (22), Candida tropicalis (14) Candida guilliermondii (07), Candida famata (05), Candida krusei (03), Candida lusitaniae (01) e Candida kefyr (01). Estas leveduras foram avaliadas quanto à atividade de proteinase, fosfolipase e à sua capacidade de aderência. A ação do fluconazol e itraconazol sobre a formação hifal, foi avaliada em 5 isolados previamente classificados como suscetíveis e resistentes ao fluconazol e ao itraconazol. A caracterização genotípica de 13 isolados de C albicans resistentes e suscetíveis ao fluconazol foi realizada por meio de RAPD-PCR. Os resultados mostraram que a atividade de proteinase foi detectada em 88,1% de isolados de C. albicans e em 69,8% de Candida não albicans, enquanto que a fosfolipase foi detectada em 55,9% de isolados de C. albicans e em 37,7% de Candida não albicans. Isolados do sangue foram mais proteolíticos do que os do cateter e os da cavidade bucal, enquanto para a fosfolipase foi observado maior produção desta enzima em isolados da cavidade bucal. A capacidade de aderência à célula epitelial foi maior em C. albicans que Candida não albicans, no entanto não houve diferença de comportamento entre isolados obtidos dos diferentes locais estudados. A formação de hifas foi maior nos isolados resistentes do que nos isolados suscetíveis quando sob a ação de qualquer um dos dois fármacos. Na análise do RAPD-PCR foi verificada a formação de dois grupos distintos para os isolados suscetíveis e resistentes ao fluconazol, sendo que apenas um isolado resistente foi agrupado com os suscetíveis. Neste trabalho, foi verificado que a atividade de exoenzimas e a habilidade de aderência dependem além da espécie de Candida como também do local onde foi isolada no hospedeiro, que isolados resistentes formaram mais hifas do que os suscetíveis sob a ação de antifúngico e que as características moleculares dos isolados resistentes em mais de um padrão fingerprinting não permitiram predizer a sua suscetibilidade ao fluconazol

O fenômeno do aumento global da temperatura é uma realidade inquestionável. Tendo em vista tal cenário, acredita-se que haverá uma expansão geográfica (migração de populações humanas) e um aumento na incidência de infecções tropicais. No entanto, a tendência de aumento da severidade destas infecções como função do aumento da temperatura ainda é desconhecida. Suponha que duas cepas de um dado parasita estejam competindo pelo mesmo hospedeiro. É possível mostrar que, em geral, a cepa com uma estratégia evolu- cionária estável, isto é, aquela que vence a competição, é aquela com maior valor de reprodutibilidade basal. Queremos saber quais combinações de temperatura ambiental T e virulência V maximizam Ro(T, V). Para isto calculamos o plano tangente ao ponto máximo (ou a uma região de máximo) e analisamos as respectivas curvas de nível. Para tanto, calculamos o seguinte sistema de equações diferenciais: ?Ro/?T = 0 ; ?Ro/?V = 0 (1). Agora, consideremos o caso de uma infecção transmitida por um vetor. De- monstramos que, neste caso, o aumento na Virulência do parasita está associada ao aumento na Temperatura. Esta hipótese é embasada por evidências empíricas de dengue hemorrágica em Singapura que vem aumentando sua virulência à medida em que há um aumento observado da temperatura local nos últimos anos. / The phenomenon of global increase of the temperature is reality unquestionable. In this case, it is expected that the increase in the global temperature will lead to an expansion of the geographical spread and to an increase in the incidence of tropical infections. However, the trend in severity of those infections as a function of the increase in the temperature is still unknown. Suppose that two strains of a given parasite are competing for the same host. It is possible to demonstrate that, in general, the strain with an evolutionary stable strategy, that is, the one that wins the competition, is the one with the highest value of R 0. We want to know which combination of environmental temperature T and virulence V maximizes R 0( V ). For this we calculate the tangent plane to the maximum point, that is ?Ro/?T=0 ; ?Ro/?V=0 (2) Now, let us consider the case of a vector-borne infection. We demonstrate, in this case, that the increase in temperature is associated with an increase in the parasite virulence. This hypothesis is supported by empirical evidence from dengue hemorrhagic fever in Singapore, which is increasing its virulence along with the increase in the local temperature observed in the last years.