Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.

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A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

Os sistemas de sinalização de dois componentes são sistemas prevalentes em bactérias, permitindo a adaptação a diferentes condições ambientais. O sistema de dois componentes classicamente possui uma proteína histidina quinase, o primeiro componente, capaz de reconhecer o estímulo ambiental e fosforilar o regulador de resposta, o segundo componente. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria ubíqua, capaz de infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Esse patógeno oportunista apresenta um dos maiores conjuntos de sistemas de dois componentes em bactérias, que permite que ela sobreviva numa grande gama de ambientes, incluindo humanos. P. aeruginosa UCBPP-PA14 apresenta pelo menos 64 histidina quinases e 76 reguladores de resposta codificados em seu genoma. Diversos sistemas de dois componentes já foram correlacionados com a virulência, sendo o sistema GacSA o exemplo melhor caracterizado. Há poucos estudos sistemáticos sobre o envolvimendo dos reguladores de resposta na virulência de P. aeruginosa e os sinais que induzem a ativação dos reguladores de resposta precisam ser encontrados. Para identificar novos reguladores de resposta envolvidos na patogenicidade, infecções in vitro em macrófagos e in vivo em Drosophila melanogaster foram realizadas neste trabalho. Os macrófagos foram infectados com cada mutante dos reguladores de resposta ou com a linhagem selvagem, e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-α e o clearance bacteriano foram determinados. Alternativamente, as moscas foram infectadas utilizando-se a estratégia de feeding e a sobrevivência foi verificada. Utilizando-se essas abordagens, a identificação de diversos reguladores de resposta com papel na virulência foi alcançada, além de se corfirmar o papel de reguladores de resposta já estudados. Um dos novos genes envolvidos em virulência, PA14_26570 (nomeado neste trabalho de atvR), codifica um regulador de resposta atípico com substituição no aspartato fosforilável para glutamato, o que usualmente induz um estado sempre ativo. Um mutante não polar em atvR foi construído e macrófagos infectados com a linhagem ΔatvR confirmaram um maior clearance bacteriano e maior produção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Para comprovar a participação de AtvR durante a patogênese, um modelo de pneumonia aguda em camundongos foi utilizado. Camundongos infectados com a linhagem ΔatvR apresentaram uma maior sobrevivência em comparação aos camundongos infectados com a linhagem selvagem. Além disso, os camundongos infectados com ΔatvR apresentaram menor carga bacteriana, aumento no recrutamento de neutrófilos ativados e aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ). Utilizando-se uma abordagem transcritômica (RNA-Seq), foi determindo diversos genes são regulados positivamente na linhagem superexpressando AtvR em relação à linhagem controle. Dentre esses, os clusters de respiração anaeróbia nar, nir, nor e nos estão incluídos. Esse resultado foi confirmado por qRT-PCR e análises fenotípicas, em que a linhagem ΔatvR apresentou menor crescimento e expressão da nitrato redutase durante condições de hipóxia em comparação à linhagem selvagem. Em suma, neste trabalho foi demonstrado que diversos reguladores de resposta são importantes para a virulência de P. aeruginosa em macrófagos in vitro e in vivo em Drosophila, além de caracterizar o regulador de resposta atípico AtvR, que regula a respiração anaeróbica por desnitrificação, permitindo que P. aeruginosa possa infectar e colonizar o hospedeiro com maior eficiência. / Two-component systems are widespread in bacteria, allowing the adaptation to environmental changes. A two-component system is classically composed by a sensor kinase that phosphorylates a cognate response regulator. Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous proteobacterium able to cause disease in several hosts. This opportunistic pathogen presents one of the largest sets of two-component systems known in bacteria, which certainly contributes to its ability to thrive in a wide range of environmental settings, including humans. P. aeruginosa UCBPP-PA14 genome codes for at least 64 sensor kinases and 76 response regulators. Some response regulators are already known to be related to virulence, with the GacSA system as the best characterized. There are no systematic studies about the involvement of P. aeruginosa response regulators in virulence. Moreover, the input signal that triggers the response regulator activation is yet to be uncovered for most systems. To find new response regulators involved in virulence, in vitro infections werecarried out using macrophages. Briefly, the macrophages were infected with each response regulator mutant or the wild-type strain, the pro-inflammatory cytokine production (TNF-α) and the bacterial clearance were evaluated. Using this approach, we identified several response regulators involved in virulence, and we also confirmed the involvement of known response regulators in this process. One of the novel virulence-related response regulators, PA14_26570 (named here as AtvR), is an atypical response regulator with a substitution in the phosphorylable aspartate to glutamate, that usually leads to an always-on state. A non-polar mutant was constructed, and macrophage infection with ΔatvR confirmed an increased bacterial clearance as well as a higher TNF-α production as compared to the wild-type strain. To ascertain the role of AtvR during the pathogenic process, an acute pneumonia model was used. Mice infected with ΔatvR showed an increased survival as compared to mice infected with the wildtype strain. In addition, ΔatvR infected mice showed reduced bacterial burden, increased neutrophil recruitment and activation, as well as increased pro-inflammatory cytokine production (TNF-α and IFN-γ). Also, using a transcriptomic approach (RNASeq), we showed that several genes were upregulated in the strain overexpressing AtvR. These genes include the anaerobic respiration clusters nar, nir, nor and nos. This result was confirmed by qRT-PCR and phenotypic analysis, in which ΔatvR showed reduced growth and nitrate reductase expression during hypoxic conditions as compared to the wild-type strain. In conclusion, we have demonstrated that several response regulators are important for P. aeruginosa virulence in vitro. In addition, we further characterized the atypical response regulator AtvR, which regulates anaerobic respiration via denitrification, allowing this bacterium to infect and colonize the host more efficiently.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-19T14:56:21Z No. of bitstreams: 1 Mercia Rodrigues Barros.pdf: 1115649 bytes, checksum: deca3723de48b7c3ba11045f77777fa2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T14:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mercia Rodrigues Barros.pdf: 1115649 bytes, checksum: deca3723de48b7c3ba11045f77777fa2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-02 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This investigation had the objective of studying the molecular epidemiology of infections by Mycoplasma spp., Escherichia coli and Staphylococcus spp., in broilers and commercial layers of the state of Pernambuco. A hundred and twenty birds were used from 24 flock of which 55 healthy broilers, 35 broilers and 30 commercial layers with respiratory and digestive signs. For the study of Mycoplasma spp., the bacteriological exam, the Polymerase Chain Reaction (PCR) and Nested-PCR were used. For the isolation of Escherichia coli the medium Eosine Methylene Blue Agar (EMB) was used. The pathogenicity test in vitro was carried out in Congo Red magnesium oxalate agar while the PCR was used, to evaluate the presence of virulence genes and the phylogenetic determination of groups A, B1, B2 and D. For the study of citotoxicity, the samples were inoculated in Vero cells. For the detection of plasmids, the extraction of DNA and the visualization of the plasmid profile was used. For Staphylococcus spp., isolation the bacteriological exam was used, with biochemical proof of species identification. The formation of the biofilm Congo Red Agar (ACR), and the detection of the mecA gene by PCR were verified. For Escherichia coli and Staphylococcus spp., a resistance profile was carried out through tests of disc diffusion and Minimum Inhibitory Concentration (MIC). In the PCR for Mycoplasma spp., it was observed that seven (29.17%) samples were positive for MS and one (4.17%) for MG, in samples of birds with respiratory signs, the positive sample was further confirmed as vacinal strain MG-F; in the bacteriological exam all samples were negative. From the 35 isolated Escherichia coli submitted to PCR, the number of positive E coli isolates for virulence genes of were: iss (16), iutA (10), hlyF (17), ironN (11), ompT (16), crl (10), fimA (14), tsh (5), papA (2), csgA (0) and iucA (2). They were phylogenetically classified into groups A (71.42%) and B1 (28.58%). The presence of hemolysis in agar blood was superior to the detection of the hlyF gene by the PCR. The pathogenicity test in Congo Red agar showed five (14.29%) positive isolated E coli, and for the cytotoxicity evaluation in vitro, in Vero cells, all the isolated E coli were negative. On the resistance profile to antibiomicrobials, it was observed that 33 (94.28%) of the E coli isolates were resistant to three or more antibiotics and that lincomicine presented the highest percentage of resistance (100%). On the CIM, multiresistance to various antimircrobials was observed. With respect to the plasmids, a frequency of 80.0% (28/35) was observed in E. coli isolates, where 16 E. coli isolates presented plasmid of 88 MDa. From the 24 processed samples 16 Staphylococcus isolates were, five being coagulasis-positive (SCP) and 11 coagulasis-negative (SCN). The biofilm production test, six (37.5%) isolates were positive. Regarding PCR for the detection of the mecA gene, all the isolates were negative. It was observed that 15 isolates presented a multiresistance profile to antimicrobials. Based on the results, these bacteria participate in the respiratory disease of the studied chickens populations and they must be considered in the control and treatment measures used in aviculture, together with the performance of in vitro tests. / Objetivou-se com este trabalho estudar a epidemiologia molecular das infecções por Mycoplasma spp., Escherichia coli e Staphylococcus spp., em frangos de corte e poedeiras comerciais no Estado de Pernambuco. Foram utilizadas 120 aves provenientes de 24 granjas, das quais 55 frangos de corte sadios, 35 com sinais respiratórios e 30 poedeiras comerciais com sinais respiratórios e digestivos. Para a pesquisa de Mycoplasma spp., utilizou-se o exame bacteriológico e a reação em cadeia da polimerase (PCR) e Nested-PCR. Para o isolamento de Escherichia coli foi utilizado o meio ágar Eosina Azul de Metileno (EMB), o teste de patogenicidade in vitro foi realizado em ágar oxalato de magnésio acrescido de vermelho congo, enquanto a PCR foi realizada para avaliar a presença de genes de virulência e determinação filogenética dos grupos em A, B1, B2 e D. Para o estudo de citotoxicidade, as amostras foram inoculadas em células Vero e para a detecção de plasmídios foi utilizada a extração de DNA e visualização do perfil plasmidial. Para o isolamento de Staphylococcus spp., utilizou-se o exame bacteriológico, com provas bioquímicas para a identificação das espécies. Verificou-se a formação de biofilme em ágar Vermelho Congo (ACR), e detecção do gene mecA pela PCR. Para Escherichia coli e Staphylococcus spp., realizou-se perfil de resistência através dos testes de disco difusão e Concentração Inibitória Mínima (CIM). Na PCR para Mycoplasma spp., observou-se que sete (29,17%) amostras foram positivas para MS e uma (4,17%) para MG em amostras de aves com sinais respiratórios, sendo a amostra positiva confirmada como cepa vacinal MG-F; no exame bacteriológico todas as amostras foram negativas. Dos 35 isolados de Escherichia coli submetidos a PCR, o número de isolados positivos para os genes de virulência foi: iss (16), iutA (10), hlyF (17), ironN (11), ompT (16), crl (10), fimA (14), tsh (5), papA (2), csgA (0) e iucA (2). Foram classificados filogeneticamente nos grupos A (71,42%) e B1 (28,58%). A presença de hemólise em ágar sangue foi superior à detecção do gene hlyF pela PCR. O teste de patogenicidade em ágar vermelho congo revelou cinco (14,29%) isolados positivos e para avaliação da citotoxicidade in vitro em células Vero todos os isolados foram negativos. No perfil de resistência aos antibiomicrobianos observou-se que 33 (94,28%) isolados foram resistentes a três ou mais antibióticos e a lincomicina apresentou o maior percentual de resistência (100%). Na CIM observou-se multirresistência a vários antimicrobianos. Quanto aos plasmídios observou-se frequência de 80,0% (28/35) nos isolados de E. coli, onde 16 isolados apresentaram plasmídio de 88 MDa. Das 24 amostras processadas foram isolados 16 Staphylococcus, sendo cinco coagulase-positiva (SCP) e 11 coagulase negativa (SCN), e no teste de produção de biofilme, seis (37,5%) isolados foram positivos. Na PCR para detecção do gene mecA todos os isolados foram negativos. Observou-se que 15 isolados apresentaram perfil de multirresistência a antimicrobianos. Com base nos resultados obtidos, essas bactérias participam da doença respiratória na população estudada e devem ser consideradas nas medidas de controle e tratamento nos plantéis avícolas em conjunto com a realização de testes in vitro.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-10-05T18:40:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2695208 bytes, checksum: 64ee45ce4e18a3b829acab0ecd84536a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-05T18:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2695208 bytes, checksum: 64ee45ce4e18a3b829acab0ecd84536a (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Seca de ponteiros, causada por Erwinia psidii é atualmente uma das doenças emergentes mais severas na cultura do eucalipto. Apesar de sua importância econômica, em virtude dos riscos que pode causar na eucaliptocultura, pouco se sabe sobre este patossistema. Assim, neste trabalho, a partir de cortes histológicos, estudou-se o processo de colonização em plantas de eucalipto usando um isolado de E. psidii transformado com gfp, estimou-se a variabilidade genética das populações do patógeno por meio de marcadores moleculares rep– PCR (ERIC, REP e BOX) e desenvolveu-se um imunoteste para detecção rápida de E. psidii usando colônias puras isoladas de plantas sintomáticas e assintomáticas. Neste estudo, conseguiu-se transformar E. psidii com pGreen-TIR e demonstrar que o plasmídeo é estável na ausência de seleção com antibióticos in vitro e in vivo. Usando microscopia de fluorescência, demonstrou-se que a colonização de E. psidii nos tecidos não está restrita ao ponto de inoculação (axila foliar). E. psidii coloniza os vasos do xilema, esclerênquima e parênquima das folhas e caule do eucalipto. Aos 35 dias após a inoculação (dai), a bactéria encontrava-se a 5 cm acima do ponto de inoculação, indicando que foi capaz de colonizar a planta acropetalmente, acompanhando o fluxo da água e nutrientes. Análises por microscopia confocal de amostras de plantas inoculadas via sistema raicular revelaram que E. psidii penetra e coloniza raízes primárias e secundárias e atinge os vasos do xilema. No entanto, nos tempos após inoculação avaliados neste estudo, a bactéria ficou restrita nas raízes e não atingiou o caule da planta. Estudos adicionais avaliando tempos após inoculação maiores devem ser realizados para confirmar esses resultados. Acredita-se que E. psidii seja disseminada a partir de mudas infectadas assintomáticas. Análises moleculares (rep-PCR) de 101 isolados de E. psidii obtidos de Eucalyptus spp. e cinco isolados de goiabeira (Psidium guajava) indicam que as populações de E. psidii do Brasil apresentam baixa variabilidade genética. Observou-se, contudo, o agrupamento dos isolados por espécie hospedeira, embora dois isolados de goiaba (LPF681 e LPF682) agruparam-se com os de eucalipto (LPF609). Testes de Wilcoxon e ANOVA dos dados de severidade e AACPD para diferentes isolados da bactéria inoculados em dois clones de eucalipto indicaram que há interação isolado × clone. A AACPD e a severidade da doença variaram significativamente entre isolados e nos dois clones testados. A variabilidade em agressividade entre isolados de E. psidii demonstraram a importância do emprego de isolados mais agressivos para a seleção de genótipos de eucalipto resistentes para plantio em escala comercial. O anti-soro contra o isolado LPF534 de E. psidii (Anti-Ep), obtido neste estudo, reagiu positivamente contra todos os isolados de E. psidii testados, incluindo alguns isolados de goiaba. O teste de aglutinação desenvolvido com este anti-soro é importante para o diagnóstico de E. psidii, por representar uma alternativa rápida e de baixo custo, em comparação com métodos baseados em PCR para a detecção do patógeno em plantas assintomáticas. / Dieback, caused by Erwinia psidii is currently one of the most severe emerging diseases in eucalypt plantations. Despite its economic importance, due to the risks posed to eucalypt production, little is known about this pathosystem. In this work, we studied the plant colonization by a gfp-transformed E. psidii isolate using histological sections, estimated the genetic variability of pathogen populations using molecular rep–PCR markers (ERIC, REP and BOX) and developed an immunoassay for the rapid detection of E. psidii in symptomatic and asymptomatic plants. In this study, we were able to transform E. psidii with pGreen-TIR and to demonstrate that the plasmid is stable in the absence of antibiotic selection both in vitro and in vivo. Using fluorescence microscopy, it was possible to demonstrate that tissue colonization by E. psidii is not restricted to the inoculation point (leaf axil) and that it colonizes the xylem vessels, sclerenchyma and parenchyma of the leaves and stem of eucalypt. At 35 days after inoculation (dai), the bacterium was found at 5 cm above the inoculation point, indicating that it was able to colonize the plant acropetally, following the water flow. Confocal microscopy analysis of plant samples inoculated via radicular system revealed that E. psidii penetrates and colonizes primary and secondary roots and reaches the xylem vessels. However, at the times after inoculation evaluated in this study, the bacterium was restricted to the roots and did not reach the stem of the plant. Further studies with longer times after inoculation must be performed to confirm these results. It is believed that E. psidii is disseminated from infected asymptomatic cuttings. Molecular analyzes (rep-PCR) of 101 E. psidii isolates obtained from eucalypt (Eucalyptus spp.) and five guava (Psidium guajava) demonstrated that the populations in Brazil have low genetic variability. Nonetheless, grouping of isolates by host plant was observed, although two guava isolates (LPF681 and LPF682) grouped with eucalypt isolates (LPF609). The Wilcoxon and ANOVA tests on disease severity and AUDPC data indicated an isolate × clone interaction. AUDPC and disease severity varied significantly among isolates and between the two clones tested. The variability in aggressiveness among isolates of E. psidii demonstrated the importance of using the most aggressive isolates in the selection of resistant eucalypt genotypes for commercial scale planting. An antiserum against E. psidii isolate LPF534 (Anti-Ep) obtained in this study reacted positively against all strains of E. psidii tested, including some isolated from guava. The agglutination test designed using this antiserum can be considered important for the diagnosis of E. psidii, as it represents a rapid and low-cost alternative compared to PCR-based methods for detecting the pathogen in asymptomatic plants.